Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Immunology and Infection

כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

*, *, , ,

Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University

* These authors contributed equally

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE Immunology and Infection. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 50.16.108.167, User IP: 50.16.108.167, User IP Hex: 839937191

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

Christensen, S., Borrego, E., Shim, W. B., Isakeit, T., Kolomiets, M. Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays. J. Vis. Exp. (62), e3727, doi:10.3791/3727 (2012).

Abstract: כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

ריקבון של דגנים על ידי הזרע, מדביק פטריות מהווה אחד האתגרים הכלכליים הגדולים ביותר ברחבי העולם ייצור דגני בוקר, שלא לדבר על סיכון רציני לבריאות האדם ובעלי חיים. בין ייצור דגנים, תירס הוא לטעון את היבול הנגוע ביותר, עקב פתוגן המושרה הפסדים שלמות תבואה זרע זיהום mycotoxin. שני mycotoxins הנפוצים ביותר ובעייתי עבור מגדלי תירס ומוצרי מזון מעבדים מזון הם אפלטוקסין ו fumonisin, המיוצר על ידי Aspergillus flavus ו verticillioides Fusarium, בהתאמה.

מחקרים שנעשו לאחרונה במפעל לפתוגן אינטראקציות מולקולריות הראו הבטחה בהבנת מנגנונים ספציפיים הקשורים תגובות צמחים לזיהום פטרייתי וזיהום mycotoxin 1,2,3,4,5,6. כי מעבדות רבות משתמשות מבחני ליבה ללמוד הצמח לפתוגן אינטראקציות, יש צורך בשיטה אחידה לכימות פרמטרים ביולוגיים שונים, כךתוצאות של מעבדות שונות ניתן לחצות, לפרש. עבור אמצעי חזקים לשעתקו עבור ניתוחים כמותיים על זרעים, פיתחנו ב-Lab מבחני ליבה ושיטות הבאים לכמת הצמיחה ביומסה פטרייתי, וזיהום mycotoxin. ארבעה גרעיני תירס מעוקרים הם מחוסן ב צלוחיות זכוכית עם מתלה פטרייתי (10 6) מודגרת למשך פרק זמן מוגדר מראש. צלוחיות מדגם יבחרו מכן על ידי ניתוח ביומסה hemocytometer, ergosterol מבוסס על ספירה של נבגים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעל ביצועים גבוהים (HPLC), כימות אפלטוקסין באמצעות שיטה fluorometer AflaTest, וכימות fumonisin ידי HPLC.

Protocol: כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

1. ליבה תירס המבדק

  1. שבועיים לפני, תרבות של פתוגנים פטרייתיים על אגר תפוחי אדמה דקסטרוז (PDA) ב 28 מעלות ג
  2. בחר גרעינים עם גודל צורה דומה, רצוי שטוח כך הם שכבו עם רמת התחתון של צלוחיות המבדק, ומכניסים 50 מ"ל צינורות פלקון. גרעינים שנבחרו חייבים הופקו במקביל בסביבה אותו כדי להבטיח גיל הזרע דומה והרכב המטבוליט.
  3. פני השטח לעקר גרעיני על ידי ניעור צינורות בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות עם אתנול 70%, 1 דקה עם מים סטריליים, ו -10 דקות עם hypochlorite נתרן 6%. יש לשטוף, שלוש פעמים, במשך 5 דקות בכל פעם, עם מים סטריליים תוך רעד מתמשך. פאט גרעינים יבשים על מגבות autoclaved.
  4. כדי להקל על דלקת של אספרגילוס flavus, ליצור פצע קטן בצד, העובר עם מחט 18 G עד לעומק של 0.5 ס"מ. עם זאת, מניסיוננו פצע גדול דרוש זיהום verticillioides Fusarium. הerefore, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך בצד העובר בעומק של 0.5 מ"מ.
  5. הכן את ההשעיה הבידוד על ידי גירוד צלחות בתרבית על 5 מ"ל של תמיסת autoclaved tween-20 0.01% לשחרר נבגים ולהסיר תפטיר על ידי כוח המשיכה סינון דרך לפחות 4 שכבות של אריג autoclaved. חישוב ריכוז נבג עם hemocytometer ולהתאים את 10 6 נבגים למ"ל של א ' flavus או פ verticillioides. אם אתה משתמש מינים אחרים של הפתוגן או המארח, חשוב להעריך ריכוזים של הבידוד לזיהום המתאים.
  6. יצירת תא לחות במיכל פלסטיק (29.2 ס"מ X 18.7 ס"מ X 8.3 ס"מ) ובו חמישה גיליונות של נייר סופג או 100 מ"ל של מים סטריליים. לשכת הוא לא מים או אוויר חזק מים נוספים יש להוסיף במהלך הניסוי לשמור על מגבות נייר לחות.
  7. מקום ארבעה גרעינים לתוך בקבוקון autoclaved 20 מ"ל נצנץ זכוכית להקליט המסה שלהם. לחסן עם ההשעיה 200 μl נבג,כובע, ואת המערבולת באופן שווה גרעיני מעיל עם ההשעיה. שחרר כמוסות באופן חופשי ולאפשר חילופי האוויר במקום לחדר לחות.

הערה: זרעים או פטריות אחרות מאלו המתוארות במסגרת שיטות אלו, כמות הבידוד הנדרש עשויים להיות שונים ויש נגזרת באופן ניסיוני.

  1. דגירה גרעיני תחת photoperiod 12-h-light/12-h-dark על 28 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים או עד הרצויה.

2. נבגי ספירת

  1. לאחר תקופה זיהום, מוסיפים 5 מ"ל של autoclaved 0.01% Tween-20 כדי בקבוקונים המכילים גרעינים נצנץ נגוע מערבולת היטב במשך דקה 1.
  2. משתמש קצה פיפטה רחב משעמם, מיד לדלל על ידי העברת שני נפרדים aliquots 200 μl של השעיה נבג לתוך צינורות 2.0 מ"ל Eppendorf המכילים 1.8 מ"ל של 0.01% tween-20 (או לדלל לפי הצורך בהתאם זיהום).
  3. למנות כל aliquot 200 μl פעמיים עם hemocytometer 4ולהשוות את הרמות של נבגי בין הטיפולים.

3. אפלטוקסין כימות

  1. הוסף גרעיני מדגם 1-50 מ"ל בבלנדר כוס עם 20 מ"ל של מתנול 80% ו - 0.05 גרם NaCl, מכסים בתערובת במהירות גבוהה במשך דקות 1.
  2. מניחים נייר פילטר מחורץ על כלי אוסף נקי לשפוך תמצית לתוך מסנן.
  3. להעביר 10 מ"ל של תסנין לכלי נקי, מוסיפים 20 מ"ל מזוקקים H 2 O, ומערבבים היטב.
  4. מדגם סינון דרך פילטר זכוכית microfibre 1.5 מיקרומטר לתוך כוס נקייה.
  5. החל 1 מ"ל של מיצוי מסונן לעמודה מבחן Afla, באמצעות אוויר דחוס, לאלץ את תמצית מסוננת דרך העמודה בקצב של 1-2 טיפות / שנייה עד שרוקנו.
  6. לשטוף את הטור פעמיים עם 1 מ"ל של H 2 O מזוקקים ולעבור טור ב 1-2 ירידה / 2 עד שהאוויר מגיע דרך.
  7. טור Elute עם מתנול 1ml של 100% HPLC כיתה ב 1-2 ירידה / שיעור 2 אסף לתוך קובט זכוכית.
  8. להוסיף1 מ"ל של מפתחים מבחן Afla כדי eluate ומערבבים היטב. מקום קובט אל fluorometer מכויל ולקרוא על 60 שניות.

הערה: בעת שימוש בפרוטוקול Aflatest FGIS, מדידה מ fluorometer מחושב על בסיס של 50 גרם הראשונים של המדגם שחולצו ל -100 מ"ל. אם לוקחים בחשבון דילול של המדגם עם מים, 1 מ"ל להחיל עמודה מייצגת 0.166 גרם של המדגם. לכן, כאשר שינוי פרוטוקול, אתה צריך לקחת בחשבון את הבדלי גודל המדגם והפתרון החילוץ הראשוני. כך, למשל, 2 גרם של גרעינים מופקים ב 20 מ"ל מתנול 80%. זה 0.1 גרם / מ"ל. כאשר 1 מ"ל של דגימה זו הוא מעורבב עם 2 מ"ל מים, שיעור מדגם בנוזל עכשיו 0.033 גרם / מ"ל. אם מדגם זה נותן קריאה fluorometer של ppb 100, ריכוז בפועל מבוסס על שיעור של מדגם 0.166, כלומר, ppb = (0.166 X 100 גרם ppb) / 0.1 גרם), או 166 ppb. עבור אפלטוקסין quantifi אלטרנטיביתשיטות קטיון, ראה התייחסות 7.

4. Fumonisin B1 (FB1) ניתוח

  1. כאשר הפטרייה הוא גדל על גרעיני תירס, לחלץ דגימות לילה עם 10 מ"ל של אצטוניטריל / מים (50/50, נ / V) בטמפרטורת החדר, ללא התרגשות. לאחר מכן, לערבב את תמצית (2 מ"ל) עם מים deionized (6 מ"ל), ולהחיל את תמהיל (8 מ"ל) ישירות מיצוי שלב C-18 מוצק.
  2. לפני טעינת המדגם, תנאי החילוץ C-18 מוצקים בשלב בטור על ידי שטיפה עם 2 מ"ל של אצטוניטריל ואחריו 2 מ"ל מים.
  3. לאחר טעינת לדוגמה, העמודה נשטף עם 2 מ"ל מים ואחריו 2 מ"ל של אצטוניטריל / מים (15/85 V / V). לדוגמה עבור HPLC ניתוח (המכיל FB1) הוא eluted עם 2 מ"ל של אצטוניטריל / מים (70/30 V / V).
  4. Derivatize FB1 עם O-phthaldehyde (OPA) על ידי העברת 0.1 מ"ל של eluate עמודה בקבוקון המכיל 0.1 מ"ל borate חיץ (0.05 מ 'בור acid/0.05 M נתרן borate [50/50, נ / v], pH 8.5) ו - 0.1 OPA מ"ל (0.1 מ"ג / מ"ל ​​ב acetonitrile עם 0.5% - mercaptoethanol).
  5. לעצור את התגובה לאחר 10 דקות על ידי הוספת 0.5 מ"ל של acetonitrile/0.01 M בור חומצה (40/60, נ / V).
  6. ניתוח FB1 על מערכת HPLC LC-20AT Shimadzu מצויד טור Zorbax ODS אנליטית (4.6 150 מ"מ) אורך גל משתנה Shimatzu RF-10Axl גלאי הקרינה (עירור 335 ננומטר / פליטה 440 ננומטר).
  7. שיפוע ליניארית משמש (ממס: acetonitrile/0.1 M פוספט נתרן (40/60), pH 3.3, ב ממס: אצטוניטריל / M 0.1 פוספט נתרן (60/40), pH 3.3) ואת תוכנית שיפוע הוא כדלקמן: 100% ל-B של 100% ב 10 דקות, 100% עבור 5 דקות.
  8. ניתוח FB1 סטנדרטים ידי HPLC, מדידות שטח שיא משמשים ליצירת עקומת סטנדרטי. לאחר מכן, לכמת FB1 רמת במדגם על ידי השוואת שטחים שיא עם עקומת FB1 סטנדרטי.

5. Ergosterol ניתוח

  1. תרבות פטרייה על גרעיני תירס על 7-14 ימים.
  2. לאחר תקופת הדגירה, להוסיף 10 מ"ל של כלורופורם: ספידanol (02:01, V / V) בבקבוקון אחד. לאחר ההוספה, לנער היטב דגימות ואז דגירה צלוחיות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
  3. לאחר 24 שעות, צנטריפוגות מדגמים, ולאסוף supernatant ולסנן אותה דרך הממברנה 0.45 ניילון אום.
  4. להזריק מדגם ישירות לתוך מערכת HPLC LC-20AT Shimadzu מצויד עמודה 4.6 ODS-C18 U (200 א, 250 ± 4.6 מ"מ) Shimadzu SPD-20A UV / VIS גלאי להגדיר כדי לפקח על 282 ננומטר.
  5. השתמש מתנול (100%) בקצב זרימה של 1.5 mL / min כשלב הנייד. לקבוע כימות ergosterol בדגימות על ידי השוואת שטחי שיא של דגימות כדי עקומת סטנדרט שנוצר HPLC כיתה ergosterol.

6. נציג תוצאות

בעקבות חיסון ו הדגירה בתא לחות על שניים עד שלושה ימים, גידול פטרייתי צריך להתחיל להופיע על הגרעינים. שבעה ימים שלאחר הטיפול, גידול צמח על צמחים שטופלו צריך להיות בבירור, whilפקדי דואר מדומים צריך להיות נגוע (איור 1 ב, למעלה). תקופות של דגירה עוד הם תורמת לצמיחה צמח שופע יותר (איור 1 ב ', למטה). בתנאים המתוארים לעיל (איור 2G), א ' flavus wild-type NRRL 3357 ערכים מרביים המוצגים של קולוניזציה, הצטברות אפלטוקסין, וייצור נבגים בבית 8, 6, ו 8 ימים, בהתאמה (איור 2, AC). עם זאת, כאשר זיהום mycotoxin ו conidiation הושוו ליחידת ergosterol, הרמות הגדולים ביותר נצפו ב 4 ו 6 ימים, בהתאמה (איור 2, DE). איור 2F מסכם אלה פטרייתיים ביומסה תלויי היותר בעלי ערך תצפיות. מעניין לציין, כי בין 4-6 ימים לאחר חיסון, הגרעינים עוברים השפלה חומצות גרעין, כפי שניתן לראות על ידי RNA הכולל דוגמאות על קורס בזמן (איור 2H, למטה).

מספר מחקרים, כולל שלנו, יש examinאד פ verticilliodies על זיהום גרעיני תירס 2,8,9,10,11,12 ומשמש בהצלחה 7-13 ימים עם הזמן נקודות לתצפיות. שימוש בשיטות המתוארות להלן, fumonisin רמות נע בין 3,500-8,000 ng / g טווח הקרנל 4,13 ורמות ergosterol של 5,000-10,000 ng / g הקרנל 14,13. איור 3 מציג פסגות נציג עבור fumonisin (למעלה) ו ergosterol (התחתון ) מ-HPLC chromatograms. מדידת ergosterol יכול גם להיות דרך ספקטרום ספיגת 15.

איור 1
באיור 1. תרשים זרימה כימות של ביומסה sporogenesis פטרייתי, וייצור mycotoxin ותוצאות נציג לצמיחה צמח מ bioassays ליבה. א) תרשים זרימה מתאר את השיטה המתוארת על כימות של פרמטרים ביולוגיים בסיסיים להערכת הפתוגנזה פטרייתי על גרעיני תירס. ב) נציגהתוצאות עבור bioassays ליבה. למעלה, א flavus (NRRL3357) גידול צמח על גרעיני תירס ברקע הגנטי B73. הזרעים היו מחוסן עם 200 μl של 10 נבגים 6 / mL והתמונות נלקחו 7 ימים חיסון הודעה. בתחתית, פ verticillioides מחוסן הגרעינים ברקע B73 13 יום שלאחר זיהום. הגרעינים היו מחוסן עם 200 μl של 10 6 נבגים למ"ל.

איור 2
2. איור אספרגילוס הקרנל flavus המבדק זמן כמובן. B73 הגרעינים היו מחוסן עם μl 200 של 10 מ"ל / 6 נבגים אספרגילוס ההשעיה flavus הנבגים ו מודגרת למשך 2-8 ימים (G). כל הערכים נקבעו לעומת ממוצע משקל יבש של 4 גרעיני (n = 3-4, ממוצע ± SE). א) ההתיישבות (על בסיס ergosterol), (ב) אפלטוקסין, ו (ג) conidiation היו לכמת בשיטות שתוארו לעיל. E) ו אפלטוקסין (F) conidiation מוצגיםכפונקציה של ביומסה פטרייתי, כפי שהיא נמדדת באמצעות ה ergosterol. F) ערכים מרביים עבור ergosterol, הצטברות אפלטוקסין, ו conidiation כפונקציה של ביומסה פטרייתי - ערכים מרביים עבור כל כמות ציין נקבע על 100%. (ג) 1 מיקרוגרם לכל נתיב של RNA הכולל כמובן בזמן.

איור 3
איור 3. הנציג העליון נוזלי ביצועים כרומטוגרפיה (HPLC) chromatograms עבור fumonisin B1 (למעלה) ו ergosterol (למטה) מבודד גרעינים נגועים verticillioides Fusarium (M3125).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

Acknowledgements: כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

אנו רוצים להודות ברנדון הסאט וקרלוס אורטיז לקבלת סיוע טכני שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים NSF IOB-0544428, IOS-0951272, ו IOS-0925561 ד"ר מיכאל Kolomiets, ועל ידי משרד החקלאות המכון הלאומי המזון והחקלאות (NIFA), גידול הצמח AFRI וחינוך גרנט # 2010-85117 ל -20,539 בני הזוג. סת מוריי, תומאס Isakeit, ו Kolomiets מייקל.

Materials: כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

Name Company Catalog Number Comments
Potato Dextrose Agar Fisher Scientific S71659A
Tween-20 Fisher Scientific BP337-100
Plastic incubation container Sterilite 1713LAB06
Blender Vicam 20200
24 cm Fluted Filter Papers Vicam 31240
1.5 μm glass microfibre Vicam 31955
Afla Test column Vicam G1024
Afrla Test Developer Vicam 32010
Methanol Vicam 35016
Acetonitrile Fisher Scientific AC14952-0025
Ethanol Fisher Scientific AC39769-0025
C-18 solid phase extraction column (Prep SEP SPE C18 Column) Fisher Scientific 60108-304
O-phthalaldehyde (OPA) Sigma-Aldrich 79760-5g
Boric acid Fisher Scientific BP168-500
Sodium borate Fisher Scientific RDCS0330500
Mercapt–thanol Fisher Scientific 45-000-231
Shimadzu HPLC LC-20AT (Pump) Shimadzu Corporation LC-20AT
Zorbax ODS column (4.6x150mm) Agilent Technologies 443905-902
Shimatzu RF-10Axl fluorescence detector Shimadzu Corporation RF-10AXL
Sodium phosphate Fisher Scientific AC38987-0010
FB1 standards Sigma-Aldrich F1147-1mg
Chloroform VWR international MK444410
13 mm syringe filter with 0.45 um nylon membrane (HPLC) Pall Corporation 4426
Ergosterol Sigma-Aldrich 45480-50G-F
Scintillation vials VWR international 66021-602
Sodium Chloride Vicam G1124

References: כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

  1. Tsitsigiannis, D.I. & Keller, N.P. Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals. Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).
  2. Gao, X., Shim, W.-B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., & Kolomiets, M. Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin. Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).
  3. Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D.I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., & Keller, N.P. Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem. Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).
  4. Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S.H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N.P., & Kolomiets, M.V. Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp. Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).
  5. Gao, X.Q. & Kolomiets, M.V. Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi. Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).
  6. Mukherjee, M., Kim, J.-E., Park, Y.-S. Kolomiets, M. V., Shim, & W.-B. Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels. Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).
  7. Zheng, M.Z., Richard, J.L., & Binder, J. A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins. Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).
  8. Bacon, C.W., Bennett, R.M., Hinton, D.M., & Voss, K.A. Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia. Plant Dis. 76, 144-148 (1992).
  9. Munkvold, G.P., Hellmich, R.L., & Rice, L.G. Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids. Plant Dis. 83, 130-138 (1999).
  10. Sagaram, U.S., Shaw, B.D., & Shim, W.-B. Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence. Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).
  11. Shim, W.-B., Flaherty, J.E., & Woloshuk, C.P. Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides. J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).
  12. Shim, W.-B. & Woloshuk, C.P. Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1. Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).
  13. Unpublished Data
  14. Shin, J.-H. & Shim, W.-B. Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides. Phytopathol. 99, S119 (2009).
  15. Breivik, O.N. & Owades, J.L. Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).

Ask the Author: כימות של קולוניזציה Sporogenesis פטרייתי, ולאחר הפקה של mycotoxins שימוש bioassays-Kernel

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter