Submit
Browse  

The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.

Recommend to Librarian

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Neuroscience

تشريح Utricle الفأر الكبار واتش بوساطة العدوى الداعم الخلية

1, 2, 3, 3

1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Department of Microbiology & Immunology, Medical University of South Carolina, 3National Institute on Deafness and Other Communication Disorders, National Institutes of Health

You must be subscribed to JoVE to access this content.

This article is a part of   JoVE Neuroscience. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

Recommend JoVE to Your Librarian

Current Access Through Your IP Address

You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

IP: 107.20.129.212, User IP: 107.20.129.212, User IP Hex: 1796506068

Current Access Through Your Registered Email Address

You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

 

Video Article Chapters

Cite this Article: تشريح Utricle الفأر الكبار واتش بوساطة العدوى الداعم الخلية

Brandon, C. S., Voelkel-Johnson, C., May, L. A., Cunningham, L. L. Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection. J. Vis. Exp. (61), e3734, doi:10.3791/3734 (2012).

Abstract: تشريح Utricle الفأر الكبار واتش بوساطة العدوى الداعم الخلية

وغالبا ما تسبب فقدان السمع واضطرابات التوازن عن طريق موت خلايا الشعر mechanosensory، والتي هي الخلايا المستقبلة في الأذن الداخلية. اذ لا يوجد اي خط الخلية التي تمثل مرض خلايا الشعر الثدييات، والبحث عن خلايا الشعر يعتمد على الثقافات الجهاز الرئيسي. وأفضل في نظام يتسم نموذج المختبر من خلايا ناضجة شعر الثدييات ويستخدم الجهاز من الثقافات utricles من الفئران (الشكل 1) 1-6. وutricle هي جهاز الدهليزي، وخلايا الشعر من utricle مماثلة في كل من التركيب والوظيفة للخلايا الشعر في الجهاز السمعي، وجهاز كورتي. وutricle الماوس إعداد الكبار يمثل ظهارة حسية للدراسات ناضجة من الاشارات الجزيئية التي تنظم بقاء على قيد الحياة، التوازن، وموت هذه الخلايا.

متباينة عضال الثدييات خلايا الشعر قوقعة وليس مجدد عندما ضائعون. في الثدييات غيرويتبع الفقاريات مالي، أو السمعي الدهليزي موت الخلايا الشعر عن طريق تجديد قوي الذي يعيد السمع والتوازن وظائف 7 و 8. وتوسطت الشعر تجديد الخلايا الدبقية التي تشبه الخلايا الداعمة، الذي اتصل السطوح basolateral من خلايا الشعر في ظهارة حسية 9 و 10. خلايا دعم تتجلى أيضا من بقاء الخلية الشعر والموت 11. وقد وضعنا مؤخرا تقنية لإصابة في دعم الخلايا في utricles مثقف باستخدام اتش. باستخدام نوع اتش 5 (dE1/E3) لتقديم التحوير التي تحتوي على GFP تحت سيطرة المروج CMV، نجد أن اتش على وجه التحديد ويصيب الخلايا بكفاءة دعم. خلية دعم كفاءة إصابة ما يقرب من 25-50٪، وعدم إصابة خلايا الشعر (الشكل 2). الأهم من ذلك، نجد أن عدوى الفيروسة الغدانية دعم الخلايا لا ينتج سمية للخلايا الشعر أو الخلايا الداعمة، وعدد الخلايا في AD-GFP INFutricles ected مكافئة لتلك التي في غير المصابة utricles (الشكل 3). وبالتالي اتش بوساطة التعبير الجيني في دعم خلايا utricles مثقف يوفر أداة قوية لدراسة دور كل من دعم خلايا وسطاء من بقاء الخلية الشعر، والموت، والتجدد.

Protocol: تشريح Utricle الفأر الكبار واتش بوساطة العدوى الداعم الخلية

1. تشريح Utricle والثقافة

  1. الموت ببطء بالغ (4 أسابيع من العمر أو أكثر) فأر باستخدام بروتوكول تمت الموافقة عليها وقطع رأس.
  2. قص القناة السمعية الخارجية في كلا الجانبين من الرأس وسحب الجلد إلى الأمام نحو الأنف. شطر الرأس من الخلف إلى الأمام وإزالة الدماغ من كلا الجانبين لتكشف عن نفق عظمي.
  3. تقليم الجمجمة بعيدا عن القوقعة العظمية ونقل المتاهة عظمي (بما في ذلك الفقاعة) إلى غطاء محرك السيارة الأنسجة ثقافة مجهزة مجهر تشريح (ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ العمل اتش في مجلس الوزراء من الفئة الثانية السلامة البيولوجية).
  4. في غطاء محرك السيارة، ونقل كل القوقعة إلى صحن زراعة الأنسجة 35mm التي تحتوي على وسائل الاعلام عقيمة تشريح (M199، Gibco / إينفيتروجن # 12350) (الشكل 1A).
  5. إذا كانت الفقاعة السمعية لا تزال سليمة (من الممكن لإزالة الفقاعة خلال تشريح الإجمالي عن طريق إدخال الصورة المصغرة الخاصة بك بين الفقاعة وقمةالقوقعة)، استخدام اثنين من ملقط (واحد واحد # 3 # 5) لكسر الفقاعة (الشكل 1B).
  6. تعرف على معالمها من إعداد القوقعة العظمية: قمة، قاعدة، العظيمات، ونوافذ بيضاوية ومستديرة، VIIIth جذر العصب، والقنوات نصف دائري (الشكل 1 C، D).
  7. وضع الأذن الداخلية في صحن مع الجانب الإنسي مواجهة، على ان يكون نظام التشغيل Windows بيضاوية ومستديرة، وقمة هي في الجزء السفلي من صحن وجذر العصب VIIIth يكون مواجها لها. عقد إعداد باستخدام ملقط # 3 في المنطقة من القنوات نصف دائري (1D الشكل).
  8. باستخدام مشرط مجهزة شفرة رقم 11، قطع قمة القوقعة قمي فقط إلى جذر العصب (1D الشكل).
  9. تحويل إعداد بحيث قطع جزء يكون مواجها لها. استخدام القناة الأمامية نصف دائري كما مؤشر لتحقيق الاستقرار في إعداد (الشكل 1E).
  10. باستخدام ملقط # 5، وإزالة القوقعة في أسفل عماد القوقعةإلى القاعدة. في النقطة حيث ربط المنطقة من القوقعة يتحول الهبوط، واستخدام مسبار غرامة (نصف الملقط # 55 مكسورة) لرفع الرف مشاركة عظمي من الصفيحة الحلزونية العظمية (الشكل 1F)، وكشف عن الكييس. فقط تحت الكييس هو الصفيحة القدمية الركابي، وهو معلما هاما. وutricle هو متاخم لالصفيحة القدمية الركابي (الشكل 1G)، وأنها محاطة العظام. استخدام مسبار لرقاقة العظام بعيدا بما فيه الكفاية لتكشف عن حوالي 1/3 من utricle. إزالة بعناية utricle باستخدام # 55 ملقط (الشكل 1H). وسوف يؤدي هذا الإجراء عادة في إزالة ظهارة سقف مصطبغا كما يتم سحبها utricle من إعداد عظمي. ومع ذلك، إذا تمت إزالة utricle مع ظهارة سقف سليمة، يمكن إزالة السقف باستخدام # 55 ملقط.
  11. يجب Utricles للعدوى اتش (أو تجارب التصوير الحي) لديها otoconia إزالتها أثناء تشريح (قبل الإصابة).في هذه الحالة، استخدم حقنة luer القفل الذي يتم تعبئة مع وسائل الاعلام تشريح ومزودة إبرة العيار الصغير (عادة 26-28 مقياس). عقد utricle على حافة باستخدام # 55 ملقط (الشكل 1I). جلب رأس إبرة على مقربة من utricle مع شطبة من الإبرة إلى الانخفاض. استخدام تيار من تشريح وسائل الإعلام إلى ينفخون otoconia (الشكل 1J). بدلا من ذلك، يمكن إزالة otoconia بواسطة بالفرشاة أجبرتها على الفرار باستخدام أداة رمش (تيد بيلا، شركة # 113). Utricles التي لن تخضع لعدوى الفيروسة الغدانية عادة مثقف التعويم الحر في 24 جيدا لوحات زراعة الأنسجة مع otoconia سليمة (انظر أدناه للحصول على إزالة otoconia في مرحلة ما بعد الإصلاح، وهذا أسهل).
  12. حالما يتم تشريح جميع utricles، تغيير وسائل الإعلام إلى وسائل الإعلام تشريح ثقافة العقيمة: DMEM F12 (Gibco # 11320) تستكمل مع FBS 5٪ و 50 يو / مل البنسلين G (سيجما).
  13. تستزرع Utricles عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. إذا الثقافات أن تكون maintaINED لأكثر من 48 ساعة، يجب تغيير نصف وسائل الاعلام كل يوم ثقافة أخرى. يمكن الحفاظ على الثقافات لمدة أسبوع أو أكثر.

2. العدوى من اتش خلايا دعم

المهم: العمل مع اتش تتطلب السلامة المستوى 2 (BSL2) الإجراءات وإصدار الشهادات. تحقق مع موظف للسلامة الأحيائية الخاص المؤسسية للإرشاد والتدريب على BSL2 الإجراءات.

  1. تشريح utricles على النحو الوارد أعلاه في وسائل الاعلام تشريح (لا يوجد مصل الدم). إزالة otoconia على النحو الوارد أعلاه.
  2. عندما تصبح جاهزة لنقل العدوى، ونقل 1 utricle (خلايا الشعر متابعة) في كل بئر من نونك المصغرة صينية (فيشر # 12-565-68) تحتوي على 15 ميكرولتر المصل خالية DMEM F12 (وهذا أمر مهم لأن المصل يمكن أن يعطل الفيروس) . هذا النقل هو أسهل مع microcurette مم 1.5 (# 10082-15 من أدوات العلم الجميلة).
  3. لدينا AD-GFP هو المصلي 5 مع الجينات الفيروسية E1 و E3 المحذوفة والمروج CMV الإنسان يقود transgين (GFP). تم الحصول على هذا الفيروس من BioLabs المتجهات (فيلادلفيا، بنسلفانيا vectorbiolabs.com ). يتم توفير مخزون الفيروسات في التتر من 1،0-4،0 × 10 10 PFU / مل. إضافة 0،5-2 ميكرولتر من فيروس الأوراق المالية إلى كل تحتوي على بئر utricle (الشكل 1L). المبلغ الفعلي المستخدمة تختلف تبعا لعيار الفيروس والأوراق المالية. نحن تصيب عادة كل utricle مع 1،0-4،0 × 10 7 PFU.
  4. ثقافة utricles في الفيروسات التي تحتوي على وسائل الاعلام في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 لمدة 2 ساعة. بعد 2 ساعة، ونقل utricles عودة إلى لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على 24 أيضا وسائل الاعلام مع ثقافة المصل. ثقافة utricles بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2.
  5. ويمكن استخدام Utricles في اليوم التالي لاجراء تجارب التصوير الحي، أو أنها يمكن ان تكون ثابتة للكيمياء مناعية خلية الشعر (أنظر أدناه). الفيروسية الزيادات التعبير التحوير على مر الزمن، لذلك إذا التحوير التعبير هو منخفض في 24 ساعة بعد الإصابة يجوز لهامفيد للخلايا ثقافة اضافي 24 ساعة في مصل الدم التي تحتوي على وسائل الاعلام. إذا كنت ترى شعر سمية الخلية، وخفض كمية الفيروس المستخدمة.

3. Utricle التثبيت، إزالة Otoconia، والمناعية

  1. في نهاية الفترة والثقافة، وإصلاح utricles في بارافورمالدهيد 4٪ ل3 ساعات سواء في درجة حرارة الغرفة (على منصة هزاز)، أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. utricles غسيل (3 مرات، 15 دقيقة لكل منهما) في 0.1 م (1X) سورنسن للفوسفات الهيدروجيني عازلة 7.4. يتم تنفيذ هذه الخطوات في لوحة زراعة الأنسجة 24 أيضا.
  2. ويجب إزالة Otoconia قبل عدوى اتش (راجع الخطوة 1،11 أعلاه): Otoconia إزالة ملاحظة:. ومع ذلك، يمكن زرعها utricles التي ليست للإصابة وثابتة مع otoconia لا تزال سليمة. في هذه الحالة، استخدم الخطوات المذكورة هنا لإزالة otoconia بعد التثبيت. فحص utricles عن أي سقف ظهارة الصباغية المتبقية. إزالة بعناية أي ظهارة سقف المتبقية باستخدام اثنين # 55 وorceps. لإزالة otoconia، استبدال العازلة سورنسن للفوسفات مع 750-1000 decalcifier كال السابقين ميكروليتر (فيشر # CS510-1D). ترك كال السابقين في utricles لمدة 1 دقيقة و 40 ثانية (لا تتجاوز 2 دقيقة). استبدل كال السابقين بنسبة 0.1 العازلة الفوسفات M سورنسن وغسل (5 مرات، 5 دقائق لكل منهما).
  3. احتضان utricles في بوروهيدريد الصوديوم (سيغما # 452882، 1٪ في ماء منزوع الأيونات) لمدة 10 دقيقة. غسل utricles في 0.1 العازلة الفوسفات M سورنسن في (5 مرات، 5 دقائق لكل منهما).
  4. utricles مكان في عرقلة الحل (PBS + 2٪ مصل بقري + 0.8٪ مصل طبيعي ماعز + 0.4٪ تريتون X-100) لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة على منصة هزاز.
  5. إضافة الأجسام المضادة الأولية واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. مكافحة الميوسين 7A (إما بروتيوس العلوم البيولوجية # # 25-6790 أو MYO7A 138-1 من البنك التنموي ورم هجين الدراسات) في 1:100 في منع الملصقات حل جميع خلايا الشعر. لتسمية على حدة خلايا الشعر striolar وغير striolar، وقد استخدمنا protoco المزدوج التسميةل مع وحيدة النسيلة المضادة كالمودولين (سيغما C # 3545؛ 1:150) وبولكلونل مكافحة calbindin (Chemicon # AB1778، تيميكولا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية، 1:200). مخففة الأجسام المضادة الثانوية (عادة اليكسا الأجسام المضادة فلور الثانوية مترافق من إينفيتروجن، كارلسباد، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية) 1:500 في عرقلة الحل وحضنت لمدة 4 ساعات في الظلام في درجة حرارة الغرفة على منصة هزاز.
  6. utricles جبل على الشرائح الزجاجية باستخدام Fluoromount-G (جنوب في مجال التكنولوجيا الحيوية، وبرمنغهام، AL، الولايات المتحدة الأمريكية).

4. ممثل النتائج

Utricles تربيتها باستخدام هذا الأسلوب تحتفظ كامل يكمل من خلايا الشعر على حد سواء، والخلايا الداعمة (الشكل 2). خلايا الشعر في الثقافات صحي تظهر ملامح النووية جولة محاطة بمناطق حشوية رقيقة التي الميوسين 7A إيجابية (الشكل 2، اللوحة العلوية). الخلايا الداعمة (المسمى مع المضادة للSox2) هي أصغر حجما وأكثر كثافة معبأة من خلايا الشعر (الشكل 2، اللوحة السفلى). ADEnovirus يصيب 25-50٪ من الخلايا الداعمة في utricle، ويصاب أي خلايا الشعر (الشكل 2، AD-GFP لوحات). وتجدر الإشارة إلى أنه يجب تحديد عيار الأمثل عمل من كل اتش تجريبيا، لأن الشعر موت الخلايا من الممكن إذا كان عيار الفيروسية مرتفعة جدا. وبالإضافة إلى ذلك، فإن مناطق من الأضرار الميكانيكية (الناتجة خلال تشريح) تناول كميات كبيرة من الفيروس. هذه المناطق من التلف الميكانيكي يمكن تمييزها بسهولة بواسطة خط متواصل من الخلايا التي تحتوي على مستويات عالية جدا من التعبير GFP وخلايا الشعر في عداد المفقودين. هذا هو على النقيض من التعبير GFP المتناثرة في دعم الخلايا غير التالفة من ثقافة (الشكل 2).

الشكل 1
الشكل 1. Utricle التشريح. ج: C يتم تقسيم فقاعة باستخدام اثنين من ملقط قوي:. السمعية الفقاعة (أ ب) (ب). القوقعة العظمية (RW إطار جولة =، S =ويتم استخدام شفرة مشرط (SB) لقطع رأس من القوقعة قمي إلى العصب القحفي VIIIth (8 N TH) ASC = القناة الهلالية الأمامي E:. الشريان الركابي، C = القوقعة، ST = الركابي) د..: ويقام على إعداد بحزم باستخدام ملقط رقم 3 مع واحد شوكة إدراجها في القناة الهلالية الأمامي (ASC)، والآخر على العظم الأبعد (سهام). تتم إزالة التيه الغشائي باستخدام ملقط F:. مع التيه الغشائي إزالتها، وبدوره القاعدية من الصفيحة الحلزونية عظمي مرئيا بالقرب من منطقة هوك. يتم إدخال مسبار غرامة تحت هذا الجرف عظمي لرفع الرف حتى وإزالته (السهم) G: بعد إزالة كيس، utricle (U) مرئيا متاخم لالصفيحة القدمية الركابي (SF) H:. Utricle (U ) تتم إزالة باستخدام ملقط # 55 (السهم) SF الصفيحة القدمية الركابي = الأول:. Utricle مع otoconia (O) إزالة جزئيا 1د ظهارة حسية (جنوب شرق) تحت مرئي J:. تتم إزالة Otoconia (O) من utricle باستخدام تيار من وسائل الاعلام التي ألقاها حقنة مزودة إبرة عيار 26. ظل إبرة (S) غير مرئية في الجزء السفلي من الصورة K:. Utricle مع otoconia إزالتها وظهارة حسية (جنوب شرق) وضوحا L:. عدوى الفيروسة الغدانية: يتم وضع كل utricle (U) في الفرد جيدا مصغرة درج. يصاب الخلايا الداعمة مع اتش بواسطة pipetting فيروس في البئر (ف طرف الماصة =).

الشكل 2
الشكل 2. أصيب اتش بوساطة العدوى من دعم الخلايا. Utricles مع التعبير اتش الدافعة للبروتين الفلورية الخضراء (AD-GFP). أظهرت عبارة عن صور مبائر من الشعر طبقة الخلية وطبقة خلية دعم في المنطقة نفسها واحد utricle. وصفت خلايا الشعر مع جسم مضاد ضد 7A الميوسين(أرجواني). وصفت الخلايا الداعمة مع جسم مضاد ضد Sox2 (الحمراء). تخطيطي يوضح هيكل من ظهارة والحسية utricle ومواقع لخلايا الشعر (HC) والخلايا الداعمة (المحكمة العليا). مواقع الفروع (البصرية) مبائر هو موضح في الجزء العلوي (U) والدنيا (L) وترد لوحات من قبل الخطوط المتقطعة في التخطيطي. لوحات العلوي: في الصور مبائر المتخذة على مستوى الشعر نوى الخلايا، AD-GFP إشارة تظهر في المسافات بين خلايا الشعر، ولا تتداخل مع 7A خلية الشعر الميوسين علامة. أقل لوحات: وثائق في أقسام مبائر على مستوى نواة الخلية الداعمة، AD-GFP إشارة colocalizes مع علامة خلية دعم سوكس-2. عدد المصابين بهذا المرض نتائج عدوى AD-GFP في التعبير GFP في دعم الخلايا فقط، وليس خلايا الشعر.

الشكل (3)
الشكل 3. عدوى الفيروسة الغدانية لا يؤدي إلى موت خلايا الشعر أو خلايا داعمة. التحريرأصيب ricles مع GFP-AD في 4 × 10 8 PFU / مل. وصفت Utricles مع الأجسام المضادة ضد 7A الميوسين (شعر علامة الخلية) وSox2 (دعم علامة الخلية). وكانت خلية الشعر وتعداد خلايا دعم متساوية للutricles السيطرة وAD-GFP utricles بالعدوى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion: تشريح Utricle الفأر الكبار واتش بوساطة العدوى الداعم الخلية

خلايا الشعر الحسية هي عرضة للموت بسبب مجموعة متنوعة من الضغوط، بما في ذلك الشيخوخة، والصدمات النفسية الضوضاء، والتعرض للالعقاقير السامة، بما في ذلك المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد وسيسبلاتين وكيل موانع الأورام. النتائج في الثدييات شعر موت الخلايا في فقدان السمع الدائم و / أو اضطراب التوازن في أنظمة نموذج المختبر هي أدوات حاسمة لدراسات تهدف الى تحديد الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء موت الخلايا الشعر، فضلا عن تلك التي تهدف إلى منع أو عكس الشعر موت الخلايا . خلافا لخلايا الشعر قوقعة من الثدييات الكبار، وخلايا الشعر من utricle البقاء على قيد الحياة بشكل جيد في الثقافة. خلايا الشعر Utricle حساسة للموت من جراء التعرض للعقاقير العلاجية نفسها التي هي سامة لخلايا الشعر القوقعة، والآليات الخلوية السامة الكامنة وراء موت الخلايا الشعر والبقاء على قيد الحياة هي مشابهة لخلايا شعر على حد سواء القريبي والقوقعة 12-18. وعلاوة على ذلك، عندما تكون البيانات التي تم الحصول عليها في نظام الشركة المصرية للاتصالات هي نموذج utriclested في الجسم الحي، وقد ثبت إعداد utricle أن يكون مؤشرا يمكن الاعتماد عليها للبقاء الخلية الشعر والموت في القوقعة ناضج 12، 18-21. إعداد utricle الماوس كما يسمح لنا للنظر في الآثار المترتبة على بروتينات معينة من خلال الاستفادة من الحيوانات المعدلة وراثيا utricles وخروج المغلوب.

ولا يزال الغموض يكتنف الاشارات التي توسط في البقاء على قيد الحياة والموت من خلايا الشعر الحسية تحت الضغط. ومع ذلك، والأدلة الناشئة يشير إلى أن أنواع الخلايا الأخرى في الأذن الداخلية يمكن أن تلعب دورا هاما في تحديد ما إذا كانت خلايا الشعر في نهاية المطاف تحت الضغط يعيش أو يموت 11، 22، 23. ويمكن استخدام نموذج النظام utricle لدراسة هذه الخلية خلية الحرجة التفاعلات في البشرة الناضجة الحسية الثدييات. عدوى الفيروسة الغدانية يوفر وسيلة لتغيير التعبير الجيني في الخلايا الداعمة، وبالتالي تسهيل دراسات لدور (ق) لدعم بقاء الخلايا في خلية الشعر، والموت، البلعمة، والتجدد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures: تشريح Utricle الفأر الكبار واتش بوساطة العدوى الداعم الخلية

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements: تشريح Utricle الفأر الكبار واتش بوساطة العدوى الداعم الخلية

وأيد هذا العمل من قبل شعبة البحوث ضمن الجدران في المعهد القومي للصمم واضطرابات التواصل الأخرى. وقدم دعم إضافي من قبل 5R01 NIDCD DC007613.

Materials: تشريح Utricle الفأر الكبار واتش بوساطة العدوى الداعم الخلية

Name Company Catalog Number Comments
Medium 199 GIBCO, by Life Technologies 12350
DMEM/F12 GIBCO, by Life Technologies 11320
Fine forceps (#55) Fine Science Tools 11255-20
Fine forceps (#5) Fine Science Tools 11252-30
Forceps (#3) Fine Science Tools 11231-30
Penicillin G Sigma-Aldrich P3032
Fetal bovine serum Invitrogen 10082-139
Nunc mini-tray Fisher Scientific 12-565-68
Adenovirus-GFP Vector Biolabs 1060*
Cal-Ex decalcifier Fisher Scientific CS510-1D
sodium borohydride Sigma-Aldrich 452882
Anti-Myosin 7a (polyclonal) Proteus Biosciences 25-6790
Anti-Myosin 7a (monoclonal) Developmental Studies Hybridoma Bank MYO7A 138-1
Anti-Calmodulin Sigma-Aldrich C 3545
Anti-Calbindin Chemicon International AB1778
Fluoromount G SouthernBiotech 0100-01
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1x1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.

References: تشريح Utricle الفأر الكبار واتش بوساطة العدوى الداعم الخلية

  1. Cunningham, L.L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res., (2006).
  2. Schmitt, N.C., Rubel, E.W., & Nathanson, N.M. Cisplatin-induced hair cell death requires STAT1 and is attenuated by epigallocatechin gallate. J. Neurosci. 29 (12), 3843-51 (2009).
  3. Ou, H.C., et al. Identification of FDA-approved drugs and bioactives that protect hair cells in the zebrafish (Danio rerio) lateral line and mouse (Mus musculus) utricle. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 10 (2), 191-203 (2009).
  4. Chiu, L.L., et al. Using the zebrafish lateral line to screen for ototoxicity. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9 (2), 178-90 (2008).
  5. Sugahara, K., Rubel, E.W., & Cunningham, L.L. JNK signaling in neomycin-induced vestibular hair cell death. Hear Res. 221 (1-2), 128-35 (2006).
  6. Matsui, J.I. & Cotanche, D.A. Sensory hair cell death and regeneration: two halves of the same equation. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 12 (5), 418-25 (2004).
  7. Ryals, B.M. & Rubel, E.W. Hair cell regeneration after acoustic trauma in adult Coturnix quail. Science. 240 (4860), 1774-6 (1988).
  8. Corwin, J.T. & Cotanche, D.A. Regeneration of sensory hair cells after acoustic trauma. Science. 240 (4860), 1772-4 (1988).
  9. Shang, J., et al. Supporting cell division is not required for regeneration of auditory hair cells after ototoxic injury in vitro. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11 (2), 203-22 (2010).
  10. Stone, J.S. & Cotanche, D.A. Hair cell regeneration in the avian auditory epithelium. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 633-47 (2007).
  11. Lahne, M. & Gale, J.E. Damage-induced activation of ERK1/2 in cochlear supporting cells is a hair cell death-promoting signal that depends on extracellular ATP and calcium. J. Neurosci. 28 (19), 4918-28 (2008).
  12. Cunningham, L.L., Cheng, A.G., & Rubel, E.W. Caspase Activation in Hair Cells of the Mouse Utricle Exposed to Neomycin. Journal of Neuroscience. 22 (19), 8532-8540 (2002).
  13. Matsui, J.I., et al. Caspase inhibitors promote vestibular hair cell survival and function after aminoglycoside treatment in vivo. J. Neurosci. 23 (14), 6111-22 (2003).
  14. Matsui, J.I., Ogilvie, J.M., & Warchol, M.E. Inhibition of caspases prevents ototoxic and ongoing hair cell death. J. Neurosci. 22 (4), 1218-27 (2002).
  15. Nakagawa, T., et al. A novel technique for inducing local inner ear damage. Hear Res. 176 (1-2), 122-7 (2003).
  16. Forge, A. & Li, L. Apoptotic death of hair cells in mammalian vestibular sensory epithelia. Hear Res. 139 (1-2), 97-115 (2000).
  17. Liu, W., et al. Caspase inhibitors prevent cisplatin-induced apoptosis of auditory sensory cells. Neuroreport. 9 (11), 2609-14 (1998).
  18. Taleb, M., et al. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hearing loss and cochlear hair cell death. Cell Stress Chaperones. 14, 427-437 (2009).
  19. Taleb, M., et al. Hsp70 inhibits aminoglycoside-induced hair cell death and is necessary for the protective effect of heat shock. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 9 (3), 277-89 (2008).
  20. Francis, S.P., et al. Celastrol Inhibits Aminoglycoside-Induced Ototoxicity via Heat Shock Protein 32 (HSP32). Cell Death and Disease., In press, (2011).
  21. Wang, J., et al. Caspase inhibitors, but not c-Jun NH2-terminal kinase inhibitor treatment, prevent cisplatin-induced hearing loss. Cancer Res. 64 (24), 9217-24 (2004).
  22. Bird, J.E., et al. Supporting cells eliminate dying sensory hair cells to maintain epithelial integrity in the avian inner ear. J. Neurosci. 30 (37), 12545-56 (2010).
  23. Sato, E., et al. Expression of fractalkine receptor CX3CR1 on cochlear macrophages influences survival of hair cells following ototoxic injury. J. Assoc. Res. Otolaryngol. 11 (2), 223-34 (2010).

Erratum: تشريح Utricle الفأر الكبار واتش بوساطة العدوى الداعم الخلية

Formal Correction: Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection
Posted by JoVE Editors on 04/17/2012. Citeable Link.

A correction was made to Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection. The incorrect version of figure 2 was published, the middle initials of the authors were omitted, and the acknowledgements were updated.

Figure 2. Adenovirus-mediated infection of supporting cells was corrected to include a schematic showing the structure of the utricle sensory epithelium. The incorrect figure was inadvertently published. This error does not change the scientific conclusions of the article in any way. The editors apologize for this error.

The acknowledgements were updated to:

The authors are grateful to Dr. Shimon P. Francis for generating the confocal micrographs.

This work was supported by the Division of Intramural Research at the National Institute on Deafness and Other Communication Disorders. Additional support was provided by NIDCD 5R01 DC007613.

From:

This work was supported by the Division of Intramural Research at the National Institute on Deafness and Other Communication Disorders. Additional support was provided by NIDCD 5R01 DC007613.

The authors were updated to:

Carlene S. Brandon, Christina Voelkel-Johnson, Lindsey A. May, Lisa L. Cunningham

From:

Carlene Brandon, Christina Voelkel-Johnson, Lindsey May, Lisa Cunningham

Ask the Author: تشريح Utricle الفأر الكبار واتش بوساطة العدوى الداعم الخلية

0 Comments

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Waiting
simple hit counter