成体マウスの卵形嚢とアデノウイルス媒介助演細胞感染の解剖

1。卵形嚢解剖と文化

1. 承認されたプロトコルと首をはねるを用いた成体（4週齢以上）マウスを安楽死させる。
2. 頭の両側に外耳道を切り取ると、鼻に向かって前方に肌を引き出します。後ろから前に頭を二分し、骨迷路を明らかにするために両側から脳を削除します。
3. 離れて骨の蝸牛から頭蓋骨をトリミングして、解剖顕微鏡（注：アデノウイルス作業はクラスIIの生物学的安全キャビネット内で行うべきである）を装備した組織培養フードに骨迷路を（水疱を含む）を転送します。
4. フードには、滅菌解剖メディアを含む35ミリメートル組織培養皿（M199、GIBCO / Invitrogen社＃12350）（ 図1A）にそれぞれ蝸牛を転送します。
5. 聴覚水疱が無傷のままであれば（それが水疱との頂点の間にサムネイルを挿入することで総解剖中に水疱を除去することが可能です。蝸牛）、水疱（ 図1B）を破るために2つの鉗子（1＃3、1＃5）を使用します。
6. 頂部、ベース、耳小骨、楕円形や円形の窓、VIIIth神経根、半規管（ 図1 C、D）：骨蝸牛の準備のランドマークを識別します。
7. 楕円形と円形の窓と頂点が皿とVIIIth神経根の底にあることなどが上を向いて、上を向く内側に皿に内耳を配置します。半規管（ 図1D）の領域で第3位鉗子を使用して準備を保持します。
8. ＃11ブレードを搭載したメスを用いて、神経根（ 図1D）にだけ心尖部蝸牛の頂点を切り落とした。
9. カットした部分が上を向いているように準備をオンにします。準備（ 図1E）を安定させるためのハンドルとして前半規管を使用しています。
10. ＃5鉗子を用いて、蝸牛軸で蝸牛を削除するベースに。蝸牛のフック領域が下向きになる時点で、球形嚢を明らかにし、骨らせん板（ 図1F）の最後の骨のシェルフを持ち上げて（壊れている＃55鉗子の半分）の微細なプローブを使用しています。ちょうど球形嚢の下に重要なランドマークであるアブミ骨底板です。卵形嚢は、アブミ骨底板（ 図1G）に隣接しており、それが骨に囲まれています。離れて卵形嚢の約1/3明らかにするために十分な骨が欠けするためのプローブを使用しています。慎重に＃55鉗子（ 図1H）を使用して、卵形嚢を削除します。卵形嚢は骨の準備から引き出されたとして、この手順は、通常、色素屋根上皮の除去になります。卵形嚢がそのまま屋根の上皮で削除された場合は、屋根は、第55位鉗子を使用して削除することができます。
11. アデノウイルス感染症のUtricles（またはライブイメージング実験）は清（感染前）の間に除去聴砂を持っている必要があります。このケースでは、解剖メディアを充填し、小口径ニードル（通常は26から28ゲージ）が装備されてルアーロックシリンジを使用しています。 ＃55鉗子（ 図1I）を使用して、端に卵形嚢を保持します。下向きの針のベベルと卵形嚢に近い針の先端をもたらす。聴砂（ 図1J）を吹き飛ばすために、メディアを解剖のストリームを使用しています。また、耳石は、まつげツール（テッド·ペラ社＃113）を使用して、それらをオフにブラッシングにより除去することができる。アデノウイルス感染を受けるつもりはありませんUtriclesはそのまま聴砂（簡単です、ポストフィックス聴砂除去、については下記参照）を24ウェル組織培養プレート中に通常浮遊培養する。
12. 5％FBSを添加したDMEM F12（Gibco社＃11320）および50 U / mlペニシリンG（シグマ）：すべてのutriclesが解剖され、無菌培養培地に解剖メディアを変更します。
13. Utriclesは37℃、5％CO ₂で培養されています。文化はmaintaにする場合48時間以上INED、培地の半分は一日おきに変更する必要があります。培養は週間以上維持することができる。

2。支持細胞のアデノウイルス感染症

重要：アデノウイルスで作業するバイオセーフティレベル2（BSL2）の手順と認証を必要とします。 BSL2手順に関するガイダンスや訓練のためにあなたの機関バイオ·オフィサーに確認してください。

1. （無血清）上記のように解剖メディアのutriclesを分析。上記のように聴砂を削除します。
2. 感染する準備ができたら、の各ウェルに1卵形嚢（毛細胞まで）を転送ヌンク15μL の無血清 DMEM F12（血清、ウイルスを不活化することができるので、これは重要である）を含むミニトレー（フィッシャー＃12-565-68） 。この転送は、1.5ミリメートルmicrocurette（＃10082から15ファイン科学ツールから）簡単になります。
3. 私たちの広告-GFPは、削除されたウイルスのE1およびE3遺伝子とtransgを駆動するヒトCMVプロモーターと血清型5であるエン（GFP）。このウイルスは、ベクターBioLabs社（ペンシルバニア州フィラデルフィアから得られたvectorbiolabs.com ）。ストックウイルスは1.0から^4.0×10 10 PFU / mlの力価で提供されています。よく卵形嚢（ 図1L）を含む各株式ウイルスの0.5から2μlを添加します。実際に使用される量は、ウイルスや株式価に応じて異なります。我々は通常1.0から4.0×10 ⁷ PFUで各卵形嚢に感染します。
4. 2時間37℃/ 5％CO ₂でウイルス含有培地での培養はutricles。 2時間後、血清培地を含む24ウェル組織培養プレートに戻ってutriclesを転送します。 37℃/ 5％CO ₂で一晩培養utricles。
5. Utriclesは、ライブイメージング実験のために翌日使用することができ、またはそれらは有毛細胞の免疫化学（下記参照）に固定することができます。時間をかけて、ウイルス遺伝子の発現が増加するので、導入遺伝子の発現は24時間後に感染症では低すぎる場合は、5月血清含有培地でさらに24時間培養細胞に有益。あなたが髪の細胞毒性が表示されている場合は、使用されるウイルスの量を減らすことができます。

3。卵形嚢ボール、聴砂除去し、免疫化学

1. 培養期間の終了時に、室温で3時間のいずれかに4％パラホルムアルデヒドでutriclesを修正（ロッキングプラットフォームの場合）または4℃で一晩0.1 M（1X）ソレンセンのリン酸緩衝液pH 7.4洗浄utricles（3回、各15分）。これらの手順は、24ウェル組織培養プレートで実行されます。
2. 聴砂除去注：聴砂は、（上記のステップ1.11参照）、アデノウイルス感染する前に削除する必要があります。しかし、感染しているではありませんutriclesはまだ無傷聴砂で培養し、修正することができます。このケースでは、固定した後聴砂を削除するには、ここで説明する手順を使用します。残っている色素の屋根上皮utriclesを点検します。慎重に2＃55 fを使用して、任意の残りの屋根の上皮を削除orceps。聴砂を削除するには、750から1000μLカル-EX decalcifier（フィッシャー＃CS510-1D）とソレンセンのリン酸緩衝液を交換してください。 1分40秒（2分を超えない）のためにutriclesのCAL-EXのままにしておきます。 0.1 Mソレンセンのリン酸緩衝液および洗浄（5回、各5分）でカル-EXを交換してください。
3. 10分間水素化ホウ素ナトリウムでutricles（シグマ＃45​​2882、脱イオン水で1％）をインキュベートします。 0.1 Mソレンセンのリン酸緩衝液（5回、各5分）にutriclesを洗浄します。
4. ブロッキング溶液中に置きutricles（PBS + 2％ウシ血清アルブミン+ 0.8％正常ヤギ血清+ 0.4％トリトンX-100）ロッキングプラットフォーム上で室温で3時間。
5. 一次抗体を追加し、4℃で一晩インキュベート℃、 1:100の抗ミオシン7aの（プロテウスサイエンスの発達研究ハイブリドーマバンクから＃25から6790または＃MYO7A 138から1までのいずれか）ソリューションのラベルすべての有毛細胞をブロックインチ別にstriolarと非striolar有毛細胞を標識するために、我々はダブルラベルprotocoを使用しているとポリクローナル抗カルビンジン（Chemicon社＃AB1778、テメキュラ、カリフォルニア州、米国; 1:200）、モノクローナル抗カルモジュリン（1:150シグマC＃3545）とlである。二次抗体（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州、アメリカ合衆国通常のAlexa Fluor®標識二次抗体）をブロッキング溶液で1:500に希釈し、ロッキングプラットフォーム上で、暗所、室温で4時間インキュベートする。
6. Fluoromount-Gを（サザンバイオテック、バーミンガム、アラバマ州、米国）を使用して、スライドガラス上にマウントutricles。

4。代表的な結果

この方法を用いて培養Utriclesは、完全な維持有毛細胞と支持細胞（ 図2）の両方を補完するものです。健康文化の有毛細胞は、図7a陽性ミオシンされている薄い細胞質領域で囲まれた丸い核のプロファイルを示す（ 図2、上のパネル）。支持細胞（抗レトロウイルスベクターで標識された）小さく、より密に有毛細胞（ 図 2、下段）よりも満員。アデnovirusは、卵形嚢の支持細胞の25〜50％に感染し、無毛細胞は（ 図2は、Ad-GFPパネル）に感染されていません。それは、ウイルス力価が高すぎる場合は毛の細胞死が可能であるので、それぞれのアデノウイルスの最適な仕事力価は、経験的に決定しなければならないことに留意すべきである。さらに、機械的損傷（解剖時に発生）の領域は、ウイルスを大量に取るでしょう。機械的損傷のこれらの領域は、GFPの発現不足している有毛細胞の非常に高いレベルでの細胞の連続的なラインで簡単に識別できます。これは、無傷の文化の細胞（ 図2）をサポートしているの散乱GFPの発現は対照的である。

図1。郭清を卵形嚢。 ：聴覚水疱（AB）B：。水疱は2つの頑丈な鉗子を用いて切断されたC：骨蝸牛（RW =丸窓、S =アブミ骨動脈、C =蝸牛、ST =あぶみ）D：。外科用メスの刃（SB）はVIIIth脳神経（ ^第 8 ^回 N）に尖蝸牛の頂点を切断するために使用されるASC =前半規管 E：製剤は、最も外側の骨（矢印）の前半規管（ASC）およびその他の挿入1フォークで第3位鉗子を用いてしっかりと保持されます。膜迷路は、鉗子を使用して削除されたF：。除去膜迷路とは、骨らせん板の基底回転フックの領域の近くに表示されます。微細なプローブは、シェルフを持ち上げ、それを（矢印）を削除するには、この骨の棚の下に挿入されているG：。球形嚢を除去した後、卵形嚢（U）は、アブミ骨底板（SF）に隣接してすぐに表示されているH：卵形嚢（Uは、 ）＃55ピンセット（矢印）を使用して削除されたSF =アブミ骨底板は、I：。聴砂と卵形嚢（O）部分的に除去するにはD感覚上皮（SE）、可視下にJ：。聴砂は（O）26ゲージの針を備えたシリンジで配信されるメディアのストリームを使用して卵形嚢から削除されます。針（S）の影は、画像の下部に表示されているK：。アデノウイルス感染症：卵形嚢に耳石が削除され、感覚上皮（SE）が表示さLで各卵形嚢（U）は、ミニだけでなく、個々に配置されますトレイ。支持細胞はよくあった（P =ピペットの先端）にウイルスをピペッティングによりアデノウイルスに感染しています。

図2。支持細胞のアデノウイルス媒介性感染症。Utriclesは、緑色蛍光タンパク質のアデノウイルス駆動式（広告-GFP）を感染させた。有毛細胞の層と、1卵形嚢の同一エリア内の支持細胞層の共焦点画像が表示されます。有毛細胞はミオシン7aの抗体で標識された（マゼンタ）。支持細胞は、レトロウイルスベクター（赤）に対する抗体で標識されています。回路図は、卵形嚢感覚上皮と毛細胞（HC）と支持細胞（SC）の場所の構造を示しています。 （U）上部および下部に示すように、共焦点（光学）のセクションの位置は（L）パネルは、回路図の破線で示されています。上部パネル：有毛細胞核のレベルで撮影した共焦点画像では、Ad-GFPシグナルが有毛細胞の間のスペースに表示され、有毛細胞マーカーミオシン7aのとは重複しません。下パネル：支持細胞核のレベルで焦点のセクションでは、Ad-GFPシグナルは、支持細胞マーカーソックス-2と共局在する。細胞のみをサポートするGFPの発現、およびno有毛細胞のAd-GFP感染の結果が感染している。

図3。アデノウイルス感染は、有毛細胞または支持細胞の死に至ることはありません。ウッriclesは4×10 ⁸ PFU / mlで広告-GFPを感染させた。 Utriclesはミオシン7A（有毛細胞のマーカー）とSox2（細胞マーカーをサポートしている）に対する抗体で標識した。有毛細胞と支持細胞数がコントロールutriclesおよびAd-GFP感染utriclesために等しかった。

感覚毛細胞が老化、騒音外傷、およびアミノグリコシド系抗生物質と抗がん剤のシスプラチンを含む耳毒性薬物への暴露を含むさまざまなストレスによって引き起こされる死への影響を受けています。永久的な聴力損失および/ ​​またはバランスの乱れの哺乳類の有毛細胞死の結果に表示されます。in vitroのモデル系では、細胞および分子メカニズムの根底にある有毛細胞の死と同様に、有毛細胞死を予防または逆転を狙ったものを決定することを目的と研究のための重要なツールです。 。大人の哺乳動物由来の蝸牛有毛細胞とは異なり、卵形嚢の有毛細胞は、培養にも生き残る。卵形嚢の有毛細胞は、蝸牛の有毛細胞に有毒である同一の治療薬への曝露から死に敏感であり、耳毒性有毛細胞死と生存の基礎となる細胞のメカニズムは、卵形嚢と蝸牛有毛細胞の^12から18の両方に似ています。また、とき卵形嚢モデル系で得られたデータはTEです。in vivoでSTED、卵形嚢の準備が成熟した蝸牛^{12、18から21}の有毛細胞の生存と死の信頼できる予測因子であることが証明されています。マウスの卵形嚢の製剤はまた、私たちはトランスジェニックマウスおよびノックアウト動物からutriclesを利用することにより、特定のタンパク質の影響を調べることができます。

ストレス下の感覚毛細胞の生存と死を媒介する信号が十分に理解されています。しかし、新たな証拠は、内耳内の他の細胞型は、ストレス下の有毛細胞は、最終的に生きるか^{、11、22、23}死ぬかどうかを決定する重要な役割を果たすことを示唆している。卵形嚢モデルシステムは、成熟した哺乳類の感覚上皮では、これらの重要な細胞間相互作用を調べるために使用することができます。アデノウイルス感染は、このように有毛細胞の生存、死亡、貪食、および再生に支持細胞の役割（s）の研究を促進し、支持細胞の遺伝子発現を変化させる方法を提供しています。