La disección de utrículo ratón adulto y mediada por adenovirus infección de reparto de las células

1. Utrículo Disección y Cultura

1. La eutanasia de un adulto (de 4 semanas de edad o más) del ratón mediante un protocolo aprobado y decapitar.
2. Corta el conducto auditivo externo en ambos lados de la cabeza y tire de la piel hacia adelante hacia la nariz. Dividir en dos la cabeza de atrás hacia delante y quitar el cerebro de ambos lados para revelar el laberinto óseo.
3. Recortar el cráneo lejos de la cóclea ósea y transferir el laberinto óseo (incluyendo la ampolla) a una campana de cultivo de tejidos equipado con un microscopio de disección (Nota: el trabajo adenovirus se debe realizar en un armario de Clase II de seguridad biológica).
4. En la campana, transferir cada cóclea a un plato de cultivo de tejidos de 35 mm que contiene estériles medios de disección (M199, Gibco / Invitrogen # 12350) (Figura 1A).
5. Si la bulla auditiva sigue intacta (es posible eliminar la bulla durante la disección bruta mediante la inserción de la uña del pulgar entre la bulla y el ápice dela cóclea), utilice dos pinzas (una # 3 y un n º 5) para romper la ampolla (fig. 1B).
6. Identificar los hitos de la cóclea ósea de preparación: huesecillos ápice, la base, y las ventanas redonda y oval, la raíz del nervio VIII, los canales semicirculares (Figura 1 C, D).
7. Coloque el oído interno en el plato con el lado medial hacia arriba, de tal manera que el óvalo y ventanas redondas y el ápice son en la parte inferior del plato y la raíz del nervio VIII está orientada hacia arriba. Mantenga la preparación utilizando una pinza de # 3 en la región de los canales semicirculares (Figura 1D).
8. Con un bisturí equipada con una cuchilla # 11, cortar el vértice de la cóclea sólo apical de la raíz nerviosa (Figura 1D).
9. Girar la preparación de modo que la porción cortada hacia arriba. Utilizar el canal semicircular anterior como asa para estabilizar la preparación (Figura 1E).
10. Utilizando # 5 pinzas, retire la cóclea en el modiolo abajoa la base. En el punto donde la región gancho de la cóclea gira hacia abajo, utiliza una sonda fina (media de unos rotos # 55 fórceps) para levantar la plataforma último ósea de la lámina espiral ósea (Figura 1F), revelando el sáculo. Justo debajo de la sáculo es la base del estribo, que es un hito importante. El utrículo es inmediatamente adyacente a la base del estribo (Figura 1G), y está rodeado por hueso. Utilice la sonda para astillar el hueso de distancia suficiente como para revelar aproximadamente 1/3 del utrículo. Retire con cuidado el utrículo con # 55 con fórceps (Figura 1H). Este procedimiento generalmente se traducirá en la eliminación del epitelio pigmentado del techo como el utrículo se extrae de la preparación ósea. Sin embargo, si el utrículo se elimina con el epitelio del techo intacto, el techo se puede quitar utilizando # 55 pinzas.
11. Utrículos para la infección por adenovirus (o experimentos en vivo de imágenes) debe tener el otoconia eliminado durante la disección (antes de la infección).En este caso, utilice una jeringa luer que se llena con los medios de disección y equipado con una aguja de pequeño calibre (generalmente 26-28 manométrica). Sostenga el utrículo en el borde usando pinzas de # 55 (Figura 1i). Llevar la punta de la aguja cerca del utrículo con el bisel de la aguja apuntando hacia abajo. Utilice un chorro de la disección de los medios de comunicación para hacer estallar fuera de la otoconia (Figura 1J). Alternativamente, otoconia se puede eliminar por cepillado a retirarse utilizando una herramienta de pestañas (Ted Pella, Inc. # 113). Utrículos que no van a someterse a la infección viral suelen ser cultivadas de libre flotación, en placas de 24 pocillos de cultivo de tejidos con la intacta otoconia (ver más abajo para la eliminación después de la corrección otoconia, que es más fácil).
12. Una vez que todos utrículos se disecan, cambiar los medios de comunicación a la cultura de disección estériles los medios de comunicación: DMEM F12 (Gibco # 11320) suplementado con FBS al 5% y 50 U / ml de penicilina G (Sigma).
13. Utrículos se cultivan a 37 ° C y 5% de CO _2. Si los cultivos son para ser maintained por más de 48 horas, la mitad de los medios de cultivo se debe cambiar cada dos días. Los cultivos se puede mantener durante una semana o más.

2. Adenovirus infección de las células de apoyo

Importante: Trabajo con adenovirus requiere de Bioseguridad Nivel 2 (BSL2) procedimientos y la certificación. Consulte con su Oficial de Seguridad de la Biotecnología Institucional para la orientación y capacitación sobre los procedimientos de BSL2.

1. Dissect utrículos como anteriormente en los medios de disección (sin suero). Quitar otoconia como anteriormente.
2. Cuando esté listo para infectar, transmitir un utrículo (células ciliadas hacia arriba) en cada pocillo de una bandeja de mini-Nunc (Fisher # 12-565-68) que contiene 15 l de suero libre de DMEM F12 (esto es importante porque el suero se puede inactivar el virus) . Esta transferencia es más fácil con un microcurette 1,5 mm (# 10082-15 de las herramientas de la ciencia Artes).
3. Nuestro Ad-GFP es el serotipo 5 con los genes virales E1 y E3 eliminadas y el promotor CMV humano impulsando la transgeno (GFP). Este virus se obtuvo de Vector BioLabs (Filadelfia, PA vectorbiolabs.com ). Virus de archivo se proporcionan en los títulos de 1.0-4.0 x ¹⁰ 10 PFU / ml. Añadir 0.5-2 l de virus de acciones a cada pocillo que contiene un utrículo (Figura 1 l). La cantidad real utilizado varía dependiendo del título del virus y de existencias. Por lo general, infectar con el utrículo 1.0-4.0 × 10 ⁷ UFP.
4. Cultura en los utrículos de virus que contiene los medios de comunicación a 37 ° C / 5% de CO ₂ durante 2 horas. Después de 2 horas, transferir los utrículos de nuevo a la placa de tejido de 24 pocillos de cultivo que contiene los medios de cultivo con suero. Cultura de los utrículos noche a la mañana a 37 ° C / 5% de CO _2.
5. Utrículos puede ser utilizado al día siguiente para experimentos de imagen en vivo, o pueden ser fijados para inmunoquímica de las células ciliadas (ver más abajo). Viral aumenta la expresión de transgenes en el tiempo, así que si la expresión del transgen es baja a las 24 horas post-infección que puedebeneficioso para células de cultivo de 24 horas adicionales en el suero que contienen medios de comunicación. Si usted ve la toxicidad de las células ciliadas, reducir la cantidad de virus que se utiliza.

3. Fijación utrículo, eliminación otoconia y Inmunoquímica

1. Al final del período de cultivo, fijar utrículos en paraformaldehído al 4%, ya sea para 3 horas a temperatura ambiente (en una plataforma oscilante) o durante la noche a 4 ° C. Lavar utrículos (3 veces, 15 min cada uno) en 0,1 M (1X) de Sorensen tampón fosfato pH 7,4. Estos pasos se llevan a cabo en una placa de tejido 24-pocillos.
2. La eliminación otoconia: Nota: otoconia debe ser removido antes de la infección por adenovirus (vea el paso por encima de 1,11). Sin embargo, utrículos que no son para ser infectados pueden ser cultivadas y se fija con el otoconia todavía intacto. En este caso, siga los pasos descritos aquí para sacar el otoconia después de la fijación. Inspeccione utrículos para cualquier epitelio de cubierta pigmentada que queda. Retire con cuidado el epitelio restante con techo de dos # 55 forceps. Para quitar el otoconia, reemplace tampón de Sorensen fosfato con l 750-1000 Cal-Ex descalcificador (Fisher # CS510-1D). Deja Cal-Ex en utrículos durante 1 minuto y 40 segundos (no exceder de 2 minutos). Vuelva a Cal-Ex con 0,1 M tampón fosfato de Sorensen y el lavado (5 veces, 5 minutos cada uno).
3. Incubar utrículos en borohidruro de sodio (Sigma # 452882, 1% en agua desionizada) durante 10 minutos. Lave utrículos en tampón fosfato 0,1 M de Sorensen (5 veces, a 5 minutos cada uno).
4. Utrículos Colocar en solución de bloqueo (PBS + 2% de albúmina de suero bovino + 0,8% de suero de cabra normal de + 0,4% de Triton X-100) durante 3 horas a temperatura ambiente sobre una plataforma oscilante.
5. Añadir anticuerpos primarios y se incuba durante la noche a 4 ° C. Anti-miosina 7a (ya sea Proteus Biosciences # 25-6790 o # 138-1 MYO7A del Banco de Desarrollo de Estudios de hibridoma) a 1:100 en el bloqueo de las etiquetas de todas las soluciones de las células ciliadas. Para etiquetar por separado las células ciliadas y no striolar striolar-, hemos utilizado un PROTOCOLO DE doble etiquetal con anticuerpo monoclonal anti-calmodulina (Sigma C # 3545; 1:150) y policlonal anti-calbindina (Chemicon # AB1778, Temecula, California, EE.UU., 1:200). Los anticuerpos secundarios (por lo general Alexa Fluor anticuerpos secundarios conjugados de Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) se diluyen 1:500 en solución de bloqueo y se incubó durante 4 horas en la oscuridad a temperatura ambiente en una plataforma oscilante.
6. Mount utrículos en portaobjetos de cristal utilizando Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, EE.UU.).

4. Los resultados representativos

Utrículos cultivadas con este método mantener completa era de las células ciliadas y las células de soporte (Figura 2). Las células ciliadas en los cultivos sanos muestran perfiles redondos nucleares rodeados de finas regiones citoplasmáticas que son la miosina 7a-positivo (Figura 2, panel superior). Células de soporte (marcadas con anti-Sox2) son más pequeños y más densamente poblado de células ciliadas (Figura 2, panel inferior). Adeadenovirus infecta a 25-50% de las células de apoyo en el utrículo, y no se infectan las células ciliadas (Figura 2, Ad-GFP paneles). Cabe señalar que el título de trabajo óptima de cada adenovirus se debe determinar empíricamente, desde la muerte de la célula de pelo es posible si el título viral es demasiado alto. Además, las regiones de daños mecánicos (causados ​​durante la disección) se llevará a grandes cantidades de virus. Estas regiones de los daños mecánicos son fácilmente distinguibles por una línea continua de células con niveles muy elevados de expresión de las buenas prácticas agrarias y que faltan las células ciliadas. Esto está en contraste con la expresión de GFP dispersa en el apoyo de las células de un cultivo sin daños (Figura 2).

Figura 1. Utrículo disección. R: C La ampolla se rompe utilizando dos pinzas fuertes::. Bulla auditiva (AB) B. Bony cóclea (OR = ventana redonda, S =. la arteria estapedial, C = cóclea, ST = estribo) D: Una hoja de bisturí (SB) se utiliza para cortar el vértice de la cóclea apical del nervio craneal VIII (8 ^º N) = ASC canal semicircular anterior E..: La preparación se mantiene firmemente con una pinza # 3 con un tenedor insertado en el canal semicircular anterior (ASC) y la otra en el hueso más externa (flechas). El laberinto membranoso se elimina el uso de fórceps. F: Con el laberinto membranoso eliminado, la vuelta basal de la lámina espiral ósea es visible cerca de la zona de ganchos. Una sonda fina se inserta debajo de esta plataforma ósea para levantar la plataforma y retírela (flecha) G:. Después de la eliminación del sáculo, utrículo (U) es visible inmediatamente adyacente a la base del estribo (SF) H:. Utrículo (U ) se retira con una pinza # 55 (flecha) SF = base del estribo I:.. utrículo con otoconia (O) elimina parcialmente unad sensoriales epitelio (SE) debajo visibles J:. otoconia (O) se elimina de la utrículo con una corriente de medio entregado por una jeringa provista de una aguja de calibre 26. La sombra de la aguja (S) es visible en la parte inferior de la imagen K:. Utrículo con otoconia eliminado y el epitelio sensorial (SE), visibles L:. Infección viral: cada utrículo (U) se coloca en un individuo bien de una mini bandeja de entrada. Las células de apoyo están infectadas con el adenovirus al vaso del virus en el pozo (P = punta de la pipeta).

Figura 2. Infección mediada por adenovirus de células de soporte. Utrículos estaban infectados con adenovirus expresión motriz de la proteína verde fluorescente (Ad-GFP). Se muestran imágenes confocal de la capa de células del cabello y la capa de células de apoyo en la misma área de un utrículo. Las células ciliadas se marcan con un anticuerpo contra la miosina 7a(Magenta). Las células de apoyo están etiquetados con un anticuerpo contra Sox2 (rojo). Esquema muestra la estructura del epitelio sensorial utrículo y las ubicaciones de las células ciliadas (HC) y células de soporte (SC). Lugares de confocal (óptico) secciones mostradas en la parte superior (U) y baja (L) paneles se indican mediante líneas de trazos en el esquema. Paneles superiores: En confocal de imágenes tomadas en el nivel de los núcleos de las células ciliadas, Ad-GFP señal aparece en los espacios entre las células ciliadas y no se solapa con la 7a células ciliadas miosina marcador. Reducción de los paneles: En las secciones confocal en el ámbito de los núcleos de células de apoyo, Ad-GFP señal de co-localiza con el marcador de células de apoyo Sox-2. Ad-GFP infección da lugar a la expresión de GFP en las células de sostén solamente, y no las células ciliadas están infectadas.

Figura 3. La infección viral no se traduce en la muerte de las células ciliadas o células de apoyo. Utricles fueron infectadas con Ad-GFP a 4 x 10 ⁸ PFU / ml. Utrículos fueron marcadas con anticuerpos contra la miosina 7a (marcador de células de cabello) y Sox2 (compatible con marcador de células). Células del pelo y el apoyo a los recuentos de células eran iguales para utrículos de control y las buenas prácticas agrarias Ad-utrículos infectados.

Las células sensoriales del cabello son susceptibles a la muerte causada por una variedad de tensiones, incluyendo el envejecimiento, el trauma del ruido, y la exposición a fármacos ototóxicos, incluyendo los antibióticos aminoglicósidos y el cisplatino agente antineoplásico. En los resultados de los mamíferos de pelo de muerte celular en la pérdida permanente de la audición y / o alteración de equilibrio. En los sistemas de modelos in vitro son instrumentos esenciales para los estudios destinados a determinar los mecanismos celulares y moleculares subyacentes de la muerte de células del cabello, así como las destinadas a prevenir o revertir la muerte de las células ciliadas . A diferencia de las células ciliadas de la cóclea de los mamíferos adultos, las células ciliadas del utrículo sobreviven bien en la cultura. Utrículo células capilares son sensibles a la muerte de la exposición a los mismos fármacos terapéuticos que son tóxicos para las células ciliadas de la cóclea, y los mecanismos celulares que subyacen a la muerte de las células ciliadas ototóxico y la supervivencia son similares a las células ciliadas cocleares tanto utriculares y ^12-18. Además, cuando los datos obtenidos en el sistema modelo utrículo son tested in vivo, la preparación utrículo ha demostrado ser un predictor fiable de la supervivencia de las células ciliadas y la muerte en la cóclea, madura ^{12, 18-21.} La preparación utrículo ratón también nos permite examinar los efectos de las proteínas específicas mediante la utilización de animales transgénicos utrículos y el golpe de gracia.

Las señales que median en la supervivencia y la muerte de las células ciliadas sensoriales bajo estrés son poco conocidos. Sin embargo, la evidencia emergente sugiere que otros tipos de células en el oído interno pueden desempeñar papeles importantes en la determinación de si las células de pelo bajo estrés en última instancia, vivir o morir ^{11, 22, 23.} El modelo de sistema de utrículo puede ser utilizado para examinar estos críticos interacciones célula-célula madura en un epitelio sensorial mamífero. Infección viral proporciona un método para alterar la expresión génica en células de soporte, facilitando así los estudios de la función (s) de células de soporte en la supervivencia de células de cabello, la muerte, la fagocitosis, y la regeneración.