ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

1. הכנת תרחיף תאים ממח העצם

1. להרדים את העכבר ולמקם את בעל החיים בסיר נירוסטה ואתנול ספריי 70% על הבטן ועל הגב. איסוף עצם הירך לבין עצם השוק מן הרגליים האחוריות, ואת עמוד השדרה.
2. להסיר את כל שאריות מדויק של רקמות רכות של עמוד השדרה עם מספריים קצה חד לבין מעצמות הרגליים עם גזה. חנות הכלים צינור 50 פלקון מ"ל עם 30 מ"ל של מדיום RPMI המכיל 10% מומת חום בסרום שור עוברית (FBS), השלימו עם 50 mercaptoethanol β-מיקרומטר, 100 מיקרומטר ממ לא חיוניות חומצות אמינו, 1 MEM mM פירובט נתרן, 2 mM L-גלוטמין, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 100 סטרפטומיצין U / ml פניצילין.
3. מכסים את תחתית מרגמה מעוקר בעבר עם מסנני סטריליים.
4. מעבירים את העצמות אל תוך המדוכה ומכסים אותם בשכבה של מסננים על מנת להרכיב שטח החיכוך.
5. הכן 50 מ"ל צינור פלקון מסופק עם מסנן פלקון.
6. לרסק את העצמותבעזרת העלי עד קבלת ההשעיה התא הומוגנית.
7. מעבירים את ההשעיה לתוך הצינור.
8. הוסף מ"ל מרגמה 5 של המדיום RPMI טרי שלם לכבס למסוק את התאים הנותרים.
9. חזור על שתי הנקודות האחרונות עד עצמות ומעורים נראה ברור.
10. להעביר ולסנן בצינור חדש ההשעיה התא כדי לחסל את פסולת ברקמות הנותרים.
11. בצנטריפוגה צינור בסל"ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע תא גלולה.

2. פנוטיפי ניתוח

1. Resuspend ולשטוף בתאים של עכברים בודדים 15 מ"ל של PBS ו FBS 2%.
2. בצנטריפוגה צינור בסל"ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה.
3. להשעות גלולה של 5 מ"ל PBS ו 2% FBS ותאי הספירה.
4. העברת 1 × 10 ⁶ תאים / גם בתחתית בארות 96 עגולצלחת.
5. בצנטריפוגה צלחת בסל"ד 1500 דקות 5.
6. להכין תערובת של מבז המכוונים נגד סמני פני הבאים. לדלל אותם המצוין PBS ו - 2% FBS להכתים את התאים.
   • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 מצומדות ל PE-Cy5 1:200
   • C-Kit מצומדות כדי APC 1:100
   • מצומדות כדי ביוטין 1:50 Sca1
   • מצומדות כדי FITC 1:50 CD34
   • מצומדות כדי PE 1:100 FcγR
   • IL-7R מצומדות ל PE-Cy7 1:100
7. מחק supernatant ולהוסיף 50 μL תמהיל מבז היטב כל אחד מהם. לנתק לתוך תאים בודדים ידי pipetting.
8. דגירה תאים עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C.
9. לשטוף את התאים פעמיים עם μL 150 של PBS ו 2% FBS.
10. בצנטריפוגה צלחת בסל"ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant ידי צלחת היפוך.
11. לדלל streptavidin ב PBS ו - 2% FBS כמצוין להכתים את התאים.
    • Streptavidin conjuמגודרת כדי APC-Cy7 1:300
12. הוסף 50 μL הפתרון היטב כל אחד מהם. לנתק את ההשעיה תא בודד על ידי pipetting.
13. דגירה תאים עבור 10 דקות בחושך ב 4 ° C.
14. לשטוף את התאים פעמיים עם μL 150 של PBS ו 2% FBS.
15. בצנטריפוגה צלחת בסל"ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant.
16. Resuspend תאים μL 100 של PBS ו FBS 2%.
17. להשיג דגימות ב FACS.

3. העשרה המגנטי של C-Kit ⁺ תאים

1. הכן פתרון מאגר המכיל PBS, pH 7.2, 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA), ו 2 mM EDTA.
2. Resuspend תא גלולה של העצם הדלועים נגזר לפחות 10 עכברים 1 מ"ל של תמיסת מאגר המכיל C-Kit MAB מצומדות כדי APC בדילול 1:50.
3. דגירה תאים עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C.
4. לשטוף פעמיים את התאים עם 40 מ"ל של תמיסת המאגר.
5. בצנטריפוגה צינור בסל"ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר tהוא supernatant על ידי שאיפה. הקפד לא להפריע גלולה.
6. Resuspend תא גלולה ולהוסיף 50 μl של Anti-APC microbeads על העכבר בכל להרדים ישירות גלולה.
7. מערבבים היטב דגירה של 20 דקות בחושך ב 4 ° C.
8. לשטוף את התאים על ידי הוספת 40 מ"ל של תמיסת חיץ צנטריפוגות בסל"ד 1500 דקות 5. Aspirate supernatant לחלוטין.
9. Resuspend תא גלולה ב כפולה של 4 מ"ל של הפתרון למאגר כל שלושה עכברים להרדים.
10. מקום MACS טורים LS בשדה המגנטי של מפריד MACS מתאים. 1 השתמש בעמודה אחת לשלושה עכברים להרדים.
11. הכינו עמודות על ידי שטיפה עם 4 מ"ל של תמיסת חיץ.
12. החל ההשעיה התא על העמודים.
13. איסוף התאים שהוסרו מהן תוויות העוברים ולשטוף טור עם 4 מ"ל של תמיסת המאגר. לבצע פעולות כביסה ידי הוספת 4 מ"ל של תמיסת חיץ שלוש פעמים. הוסף חוצץ חדש כאשר המאגר טור מתרוקנת.
14. הסרה של עמודות מ מפריד ו placה כל אחד על גבי 15 צינורות מ"ל פלקון.
15. פיפטה 4 מ"ל של תמיסת חיץ על כל עמודה. מיד לשטוף את התאים המסומנים מגנטית על ידי לחיצה על הבוכנה לתוך הטור.
16. בצנטריפוגה צינורות בסל"ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה.
17. Resuspend כל גלולה עם 1 מ"ל של תמיסת חיץ כדורי קבוצתיות צינור יחיד פלקון 15 מ"ל.

4. מיון של בתאי גזע hematopoietic ואת אבות מסורים השושלת

1. להכין תערובת של מבז המכוונים נגד סמני פני הבאים. לדלל אותם כפי שעולה 500 PBS μL ו FBS 2% להכתים את התאים.
   • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 מצומדות ל PE-Cy5 1:200
   • C-Kit מצומדות כדי APC 1:100
   • SCA-1 מצומדות כדי ביוטין 1:50
   • מצומדות כדי FITC 1:50 CD34
   • מצומדות כדי PE 1:100 FcγR
2. בצנטריפוגה צינור מ לשנים הקודמותשל סעיף בסל"ד 1500 דקות 5 ובזהירות להסיר את supernatant על ידי שאיפה.
3. מוסיפים את תערובת מבז כדי גלולה. לנתק את ההשעיה תא בודד על ידי pipetting.
4. דגירה תאים עבור 20 דקות בחושך ב 4 ° C.
5. לשטוף פעמיים את התאים עם 14mL של PBS ו FBS 2%.
6. בצנטריפוגה צינור בסל"ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant.
7. לדלל streptavidin כמפורט 500 PBS μL ו 2% FBS להכתים את התאים.
   • Streptavidin מצומדות כדי APC-Cy7 1:300
8. הוסף הפתרון הצינור. לנתק את ההשעיה תא בודד על ידי pipetting.
9. דגירה תאים עבור 10 דקות בחושך ב 4 ° C.
10. לשטוף פעמיים את התאים עם 14 מ"ל של PBS ו - 2% FBS.
11. בצנטריפוגה צינור בסל"ד 1500 דקות 5 וזורקים supernatant.
12. Resuspend תאים μL 500 של PBS ו FBS 2%.
13. להעביר ולסנן את ההשעיה תא צינור חדש 5 מ"ל כדי אליminate אגרגטים הסלולר זה יכול להפריע הליך המיון.
14. הוסף 5 μL של 7-AAD (להשתמש בו בדילול 1:100) על השעיית התא על מנת להוציא 7-AAD ⁺ מתים תאים ממוינים האוכלוסיות.
15. מיין תאים עם FACSAria BD פי פנוטיפים את הבאים:
    • LKS תאים: לין ^- C-Kit ⁺ SCA-1 ⁺
    • LT-HSCs: LKS CD34 ^-
    • ST-HSCs: LKS CD34 ⁺
    • GMPs: לין ^- C-Kit ⁺ SCA-1 FcγR ^{נמוכה גבוהה} CD34 ⁺
    • חברי הפרלמנט האירופי: לין ^- C-Kit ⁺ SCA-1 FcγR ^{נמוך נמוך} CD34 ^-
    • CMPs: לין ^- C-Kit ⁺ SCA-1 FcγR ^{נמוך נמוך} CD34 ⁺

5. נציג תוצאות

איור 1 מציג ודוגמא הליך gating אלקטרונייםהנפוצים הציון אבות הלימפה (CLPs) כמו ^- לין / c-Kit ^{וראה זה} / אינטרלוקין (IL)-7R ⁺ תאים, לין ^- / c-Kit ⁺ / SCA-1 ⁺ (LKS) ולין ^- / c-Kit ⁺ / SCA ^{וראה זה} -1 (C-Kit ⁺⁾ תאים, מ C-Kit ⁺ שער, אבות מיאלואידית משותף (CMPs) מזוהים FcγR ^{וראה זה} CD34 ⁺ תאים, אבות granulocyte / מונוציטים (GMPs) כמו FcγR ^היי CD34 ⁺ תאים megakaryocyte / אבות כדורית אדומה (חברי הפרלמנט האירופי) כמו FcγR ^Lo CD34 ^- תאים, משער LKS, LT-HSC ו ST-HSC מזוהים CD34 ^- ו CD34 ⁺ תאים, בהתאמה. מח העצם זו ההשעיה התא יכול להיות מועשר על C-Kit ⁺ תאים עם חרוזים מגנטיים (איור 2): LT-HSC ו ST-HSC לאחר מכן ניתן למיין על פי ביטוי CD34, כמו גם אבות אחרים על פי הפנוטיפ המתואר לעיל.

HSCs יכולה להיות אנה lyzed במיקרוסקופ הדמיה חיה confocal כפי שמוצג באיור 4, שם CD34 ^- תאים הוכתמו מתחם נוקלאוטיד מחייב quinacrine ¹¹ כמו גם הגרעין האדום (DRAQ5). ב HSCs, אבל לא GMPs, quinacrine חיובי שלפוחית ​​נראים ¹² הציטופלסמה. יתר על כן, HSCs מיון יכול לשמש בניסויים פונקציונליים כמו הפגינו 5 דמות, אשר מציג את העלייה cytosolic Ca ^{2 +} ב HSC-LT ידי הפעלת קולטנים-P2 purinergic בחשיפה טריפוספט-אדנוזין (ATP) ו ionomycin ^12.

באיור 1. נציג ניתוח נקודה העלילה של לין-BM תאים. הליך gating אלקטרונית על cytometer זרימת לזהות להבקיע אבות hematopoietic ו HSCs מן ההשעיה מח עצם התא מוכתם כמתואר בטקסט פרוטוקול.

pload/3736/3736fig2.jpg "/>
איור 2. תוכנית להעשרת סלקטיבית של C-Kit ⁺ תאים ממח העצם.

איור 3 מחזור התא ניתוח אלקטרונית LKS סגורות CD34 ^-. HSCs ב בריאים ועכברים עם IBD מוכתמים נוגדנים-67 קי ו DAPI. התאים היו קבועים permeabilized עם Lyse / תקן ו פרם מאגרים ואחריו מכתים עם מצומדות FITC Ki-67 ו DAPI ב 1 מיקרוגרם / מ"ל. תאים רכיבה הם בקושי אם בכלל לזיהוי LKS CD34 ^- תא HSCs של פקדים בריא ^12.

. איור 4 לחיות מיקרוסקופיה הדמיה confocal של FACS מיון CD34 ^- HSCs ו GMPs מוכתמים quinacrine נוקלאוטיד מחייב את המתחם הגרעיני ואדום (DRAQ5). את הרביעים קטנים להראות quinacrine קופהשלפוחית ​​itive זוהה בציטופלסמה של HSCs אך לא GMPs.

איור 5. Cytosolic Ca ^{2 +} עליות HSCs מיון עמוסות פורעה-2 ו מגורה עם ה-ATP ו ionomycin. עקבות של תאים בודדים מוצגים. כל התאים היו מגיבים ATP תאי מראה עלייה בולטת cytosolic Ca ^{2 +} אחרי תוספת של ATP.

השיטה המתוארת כאן מאפשר ניתוח מהיר ומדויק של hematopoiesis בעכברים בודדים (איור 1). זה ניתוח במסגרות ניסיוניות שונות, כולל מודלים Murine של דלקת, אוטואימוניות, כשל חיסוני, מחלות ניווניות, הפרעות מטבוליות וסרטן, מאפשרת מענה את ההשפעה של התנאים פתולוגיים על hematopoiesis. איור 3 מציג ניתוח של פעילות רכיבה על התא LKS מגודרת באופן אלקטרוני CD34 ^- תאים בעכברים בריאים ועכברים עם מחלות מעי דלקתיות (IBD) ¹³ על ידי מכתימה עם Ki-67 מב ו DAPI. זה האחרון להציג גידול משמעותי של תאים S / G ₂ / M שלבי מחזור התא. זה ניתוח cytometry זרימת מדגים את ההשפעה של דלקת תא T מתווכת על פעילות רכיבה על אופניים HSC ^12.
שילוב של תיוג מגנטי והעשרה של תאים במח העצם ביטוי c-Kit עם תא ומיון cytometr זרימתy מאפשר בידוד של מטוהרים מאוד אבות היווצרות הדם ואת השושלת HSCs. האוכלוסיות סלולריים שהתקבלו ניתן להשתמש במספר מבחני ללמוד ביולוגיה של התא (איור 4), התמרה האות (איור 5), ביטוי גנים מוסדר מבחינה התפתחותית ו במבחנה, כמו גם בפוטנציאל תפקודית vivo של תת תאים נפרדים. אכן, מועשר מגנטית C-Kit ⁺ התאים שימשו לא מוקרן המארחים נקלטים בהצלחה ללמוד וריאציה דינמי של פעילות רכיבה על אופניים HSCs במצב יציב דלקת ^14. בידינו ההליך המתואר כאן מאפשר התאוששות יעילה יותר ומהירה יותר של תאים במח העצם מאשר עצם שטיפה עם תשואה ממוצעת של 200,000 תאים LKS לכל עכבר. מספר קטן מאוד של HSCs הצייתניים כי יכול להיות מבודד קישואים אספו עצם של עכברים רבים מהווה מגבלה עבור גישות ניסיוניות הדורשים תאים נוספים. כדי לייתר את מגבלה זו, במקרים רבים ראשונייםמחקרים ניתן לבצע על שפע תאים LKS יותר לדמיין ניתוח ממוקד יותר דייקן שיבוצעו ב ^- CD34 HSCs הצייתניים.