Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

1. Preparação de suspensão de células da medula óssea

1. Euthanize o mouse e colocar o animal em uma panela inoxidável e spray de etanol 70% em seu abdômen e nas costas. Colete fêmur e da tíbia das pernas traseiras e coluna vertebral.
2. Precisão remover todos os resíduos de tecidos moles da coluna vertebral com uma tesoura ponta afiada e das pernas ossos com uma gaze. Ossos loja em um tubo Falcon 50 mL com 30 mL de meio RPMI contendo 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS), suplementado com 50 mM β-mercaptoetanol, 100 iM MEM não-aminoácidos essenciais, 1 mM de piruvato de sódio MEM, 2 mM de L-glutamina, 100 ug / ml de estreptomicina e 100 U / ml de penicilina.
3. Cobrir o fundo de uma argamassa previamente esterilizado com filtros estéreis.
4. Transfira os ossos na argamassa e cobrir com uma camada de filtros, a fim de montar uma superfície de atrito.
5. Prepara-se uma 50 mL tubo Falcon fornecido com um filtro de Falcon.
6. Esmagar os ossoscom a ajuda de um pilão até a obtenção de uma suspensão de células homogéneas.
7. Transferir a suspensão dentro do tubo.
8. Adicionar ao mL argamassa 5 de meio RPMI fresco completo para lavar e colher as células restantes.
9. Repita os dois últimos pontos até os ossos aparecem homogeneizadas claro.
10. Transferir e filtrar num tubo novo a suspensão de células a fim de eliminar os detritos tecido restante.
11. Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o pellet celular.

2. Análise fenotípica

1. Ressuspender as células e lava-se de ratinhos individuais em 15 mL de PBS e FBS 2%.
2. Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento.
3. Suspender o sedimento em 5 ml de PBS e FBS 2% e contagem de células.
4. Transferência de 1 × 10 ⁶ células / poço em um fundo de poços 96 rodadaplaca.
5. Centrifugar a placa a 1500 rpm durante 5 min.
6. Prepara-se uma mistura de mAbs dirigidos contra os marcadores de superfície que se seguem. Diluir-los, como indicado em PBS e 2% de FBS para corar as células.
   • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 conjugado com PE-Cy5 1:200
   • c-Kit conjugado a APC 1:100
   • SCA1 conjugado com biotina 1:50
   • CD34 conjugado com FITC 1:50
   • FcγR conjugado com PE 1:100
   • IL-7R conjugado com PE-Cy7 1:100
7. Descartar o sobrenadante e adicionar 50 uL de mistura de mAbs a cada poço. Dissociar-se em células individuais por pipetagem.
8. Incubar as células durante 20 min no escuro a 4 ° C.
9. Lave as células duas vezes com 150 uL de PBS e 2% de FBS.
10. Centrifugar a placa a 1500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante invertendo a placa.
11. Diluir estreptavidina em PBS e 2% de FBS como indicado para corar as células.
    • Estreptavidina conjugate para APC-Cy7 1:300
12. Adicionar 50 uL da solução a cada poço. Dissociar-se em suspensão de células individuais por pipetagem.
13. Incubar as células durante 10 min no escuro a 4 ° C.
14. Lave as células duas vezes com 150 uL de PBS e 2% de FBS.
15. Centrifugar a placa a 1500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante.
16. Ressuspender as células em 100 uL de PBS e FBS 2%.
17. Adquirir amostras em FACS.

3. Enriquecimento magnético de ^Células + c-Kit

1. Preparar uma solução tampão contendo PBS, pH 7,2, 0,5% de albumina de soro bovino (BSA), e 2 mM de EDTA.
2. Ressuspender o sedimento de células de medula óssea derivado de, pelo menos, 10 ratinhos em 1 mL de solução tampão contendo c-Kit mAb conjugado a APC diluído 1:50.
3. Incubar as células durante 20 min no escuro a 4 ° C.
4. Lavar duas vezes as células com 40 mL de solução tampão.
5. Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover tele sobrenadante por aspiração. Certifique-se de não perturbar o sedimento.
6. Ressuspender o sedimento de células e adicionar 50 uL de anti-APC micropérolas para cada rato sacrificados directamente para o sedimento.
7. Misturar bem e incubar durante 20 min no escuro a 4 ° C.
8. Lave as células por adição de 40 mL de solução tampão e centrifuga-se a 1.500 rpm durante 5 min. Aspirar completamente o sobrenadante.
9. Ressuspender o sedimento de células em múltiplo de 4 mL de solução tampão de três em três ratinhos sacrificados.
10. Colocar MACS colunas LS no campo magnético de um separador de MACS adequados. Use uma coluna a cada três ratos submetidos à eutanásia.
11. Preparar colunas, por lavagem com 4 mL de solução tampão.
12. Aplicar suspensão de células para as colunas.
13. Recolher células não marcadas que passam através da coluna e lava-se com 4 mL de solução tampão. Realizar passos de lavagem, adicionando 4 ml de solução tampão de três vezes. Adicionar tampão novo quando o reservatório coluna é esvaziada.
14. Remover colunas do separador e place cada um em cima de 15 tubos mL Falcon.
15. Pipetar 4 mL de solução tampão para cada coluna. Imediatamente lavar as células magneticamente marcadas, empurrando o êmbolo para dentro da coluna.
16. Centrifugar os tubos a 1500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração.
17. Ressuspender cada pellet com 1 mL de solução tampão e pelotas de grupo em um único tubo de 15 mL Falcon.

4. Seleção de Células-Tronco Hematopoéticas e Lineage Progenitores comprometidos

1. Prepara-se uma mistura de mAbs dirigidos contra os marcadores de superfície que se seguem. Diluir-los, como indicado em 500 uL de PBS e FBS a 2% para corar as células.
   • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 conjugado com PE-Cy5 1:200
   • c-Kit conjugado a APC 1:100
   • Sca-1 conjugada com biotina 1:50
   • CD34 conjugado com FITC 1:50
   • FcγR conjugado com PE 1:100
2. Centrifugar o tubo a partir da previoua secção a 1.500 rpm durante 5 min e cuidadosamente remover o sobrenadante por aspiração.
3. Adicionar a mistura de mAbs para o sedimento. Dissociar-se em suspensão de células individuais por pipetagem.
4. Incubar as células durante 20 min no escuro a 4 ° C.
5. Lavar duas vezes as células com 14 mL de PBS e FBS 2%.
6. Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante.
7. Diluir estreptavidina, como indicado em 500 uL de PBS e 2% de FBS para corar as células.
   • Estreptavidina conjugada com APC-Cy7 1:300
8. Adicionar a solução para o tubo. Dissociar-se em suspensão de células individuais por pipetagem.
9. Incubar as células durante 10 min no escuro a 4 ° C.
10. Lavar duas vezes as células com 14 mL de PBS e 2% de FBS.
11. Centrifugar o tubo a 1.500 rpm durante 5 min e descartar o sobrenadante.
12. Ressuspender as células em 500 uL de PBS e FBS 2%.
13. Transferir e filtrar a suspensão de células em um tubo novo mL 5, a fim de eliminate agregados celulares que podem interferir com o processo de classificação.
14. Adicionar 5 uL de 7-AAD (usá-lo diluído 1:100) à suspensão de células a fim de excluir 7-AAD ⁺ células mortas das populações ordenados.
15. Células de classificação com um FACSAria BD de acordo com os seguintes fenótipos:
    • Células LKS: Lin ^- c-Kit ^{+ Sca-1} +
    • LT-HSCs: LKS CD34 ^-
    • ST-HSCs: LKS CD34 ⁺
    • BPF: lin ^- c-Kit ⁺ Sca-1 FcγR ^{baixa alta} CD34 ⁺
    • Deputados: lin ^- c-Kit ⁺ Sca-1 FcγR ^{baixo baixo} CD34 ^-
    • CMPs: lin ^- c-Kit ⁺ Sca-1 FcγR ^{baixo baixo} CD34 ⁺

5. Os resultados representativos

A Figura 1 mostra e exemplo do procedimento gating electrónico paraA pontuação comuns progenitores linfóides (CLPs) como Lin ^- / c-Kit ^Io / interleucina (IL)-7R ^{+ de} células; Lin ^- / c-kit ⁺ / Sca-1 ⁺ (LKS) e Lin ^- / c-Kit ⁺ / Sca -1 ^{Lo (c-kit} +) células, a partir do c-Kit ⁺ portão, comuns progenitores mielóides (CMPS) são identificadas como FcγR ^Io células ^CD34 +, progenitores de granulócitos / monócitos (BPF) como FcγR ^hi células ^CD34 + e megacariócitos / progenitores de eritrócitos (MPE) como FcγR ^eis CD34 ^- células; a partir do portão LKS, LT-HSC e ST-HSC são identificados como CD34 ^- e células CD34 ^+, respectivamente. Esta suspensão de células de medula óssea pode ser enriquecida para ^células + c-Kit com esferas magnéticas (Fig. 2); LT-HSC e ST-HSC pode então ser classificados de acordo com a expressão de CD34, bem como outras células progenitoras de acordo com o fenótipo descrito acima.

HSCs pode ser ana lisados ​​em microscopia confocal de imagem ao vivo, como mostrado na Figura 4, onde CD34 ^- células foram coradas com o composto de nucleótidos de ligação quinacrina ^11, bem como nuclear vermelho (DRAQ5). Em HSCs, mas não BPF, quinacrina-positivas vesículas são visíveis na ¹² citoplasma. Além disso, HSCs ordenados pode ser utilizado em experiências funcionais, tal como demonstrado na figura 5, que mostra o aumento em Ca ^{2 +} citosólico em LT-HSC pela activação dos receptores purinérgicos P2 após a exposição a adenosina-trifosfato (ATP) e ionomicina ^12.

Figura 1. Representante análise gráfico de pontos de Lin-BM células. Procedimento gating electrónico no citómetro de fluxo para identificar e marcar progenitores hematopoiéticos e HSCs de suspensão de células de medula óssea coradas como descrito no texto de protocolo.

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Figura 2. Um esquema para o enriquecimento selectivo de ^células + c-kit da medula óssea.

Figura 3 análise do ciclo celular de LKS fechados eletronicamente CD34 ^-. HSCs em controles normais e ratos com IBD corados com o anticorpo Ki-67 e DAPI. As células foram fixadas e permeabilizadas com Lyse / Fix e Perm buffers seguida de coloração com conjugado com FITC Ki-67 e DAPI menos 1 ug / ml. Ciclismo células são mal se em tudo detectável no LKS CD34 ^- HSCs compartimento de controles saudáveis ^​​12.

. Figura 4 Viva microscopia confocal da imagem FACS classificadas CD34 ^- HSCs e BPF coradas com a quinacrina composto nucleotide-binding e vermelho nuclear (DRAQ5). Os quadrantes mostram pequenas quinacrina posvesículas tivo detectada no citoplasma das HSCs mas não GMPs.

Figura 5. Citosólica de Ca ^{2 +} elevações na HSCs ordenados carregadas com Fura-2 e estimuladas com ATP e ionomicina. Traços de células individuais são mostrados. Todas as células foram responsivos à ATP extracelular mostrando um aumento proeminente na citosólica de Ca ^{2 +} após a adição de ATP.

O método aqui descrito permite a análise rápida e precisa da hematopoiese em ratinhos individuais (Figura 1). Esta análise em várias configurações experimentais, incluindo modelos murinos de inflamação, auto-imunidade, imunodeficiências, doenças degenerativas, doenças metabólicas e câncer, permite abordar o impacto de condições patológicas na hematopoiese. Figura 3 mostra a análise da atividade de ciclo celular em LKS eletronicamente fechados CD34 ^- células de camundongos saudáveis ​​e camundongos com doença inflamatória intestinal (DII) ¹³ por coloração com Ki-67 mab e DAPI. O último exibido um aumento significativo de células em S / G ₂ / M fases do ciclo celular. Esta análise em citometria de fluxo demonstra o impacto da inflamação mediada por células T sobre a actividade de ciclismo ¹² HSC.
Combinação de rotulagem magnético e enriquecimento de células da medula óssea expressando c-Kit com classificação celular em cytometr fluxoy permite o isolamento de células progenitoras altamente purificada linhagem hematopoiética e HSCs. As populações de células obtidas podem ser utilizadas em um número de ensaios para estudar a biologia celular (Figura 4), ​​a transdução de sinal (Figura 5), a expressão do gene regulado developmentally e in vitro, bem como no potencial funcional in vivo de subpopulações de células distintas. Na verdade, magneticamente enriquecido ^c-kit + células foram usadas com sucesso para enxertar não irradiados anfitriões para estudar a variação dinâmica da atividade HSCs ciclismo em estado estacionário e inflamação ^14. Em nossas mãos o procedimento descrito aqui permite a recuperação mais eficiente e mais rápida de células da medula óssea do osso lavagem com um rendimento médio de 200.000 células por LKS mouse. O número muito pequeno de HSCs quiescentes que podem ser isoladas a partir de medulas ósseas de dados agregados de vários mouses constitui um limite para abordagens experimentais que requerem mais células. Para obviar a esta limitação, em muitos casos preliminaresestudos podem ser realizados em células mais abundantes LKS prever análises mais focadas e pontuais a serem executadas em CD34 ^- HSCs quiescentes.