Fenotypeanalyser og Isolering av murine hematopoetiske stamceller og Lineage-engasjerte stamfedre

1. Utarbeidelse av cellesuspensjon fra benmargen

1. Avlive musen og plassere dyret i en rustfri kjele og spray 70% etanol på sin buk og rygg. Samle femur og tibia fra bakbena, og ryggsøylen.
2. Nøyaktig fjerne alle myke vev rester fra ryggsøylen med en skarp spiss saks og fra ben bein med en kompress. Oppbevar bein i en 50 ml Falcon rør med 30 ml RPMI medium som inneholder 10% varme inaktivert fosterets storfe serum (FBS), supplert med 50 mM β-mercaptoethanol, 100 mikrometer MEM Non-essensielle aminosyrer, 1 mm MEM Sodium Pyruvat, 2 mM L-glutamin, 100 mikrogram / ml streptomycin og 100 U / ml penicillin.
3. Dekk bunnen av en tidligere sterilisert mørtel med sterile filtre.
4. Overfør bein inn i morter og dekke dem med et lag av filtre for å montere en friksjon overflate.
5. Forbered en 50 ml Falcon rør utstyrt med en Falcon filter.
6. Knuse beinmed hjelp av en stampe inntil få en homogen cellesuspensjon.
7. Overfør suspensjon inn i røret.
8. Legg til mørtelen 5 ml fersk RPMI komplett medium å vaske og høste de gjenværende cellene.
9. Gjenta de to siste punktene før de homogeniserte knoklene vises tydelig.
10. Overfør og filtrere i en ny tube cellesuspensjonen for å eliminere gjenværende vev rusk.
11. Sentrifuger røret ved 1500 rpm i 5 min, og fjern forsiktig supernatanten ved aspirasjon. Pass på ikke å forstyrre den cellepelleten.

2. Fenotypeanalyser

1. Resuspender og vaske cellene enkelte mus i 15 mL PBS og 2% FBS.
2. Sentrifuger røret ved 1500 rpm i 5 min, og fjern forsiktig supernatanten ved aspirasjon. Pass på ikke å forstyrre pelleten.
3. Heng pellet i 5 mL PBS og 2% FBS og telle celler.
4. 1 Overføring × 10 ⁶ celler / brønn i 96 en brønner rund bunnplate.
5. Sentrifuger platen på 1500 rpm i 5 min.
6. Forbered en blanding av mAbs rettet mot følgende overflaten markører. Fortynn dem som angitt i PBS og 2% FBS å farge cellene.
   • CD4, CD8, CD3 og CD45R, CD19, GR1, Ter119, NK1.1 konjugert til PE-Cy5 1:200
   • c-Kit konjugert til APC 1:100
   • Sca1 konjugert til biotin 01:50
   • CD34 konjugert til FITC 01:50
   • FcγR konjugert til PE 1:100
   • IL-7R konjugert til PE-Cy7 1:100
7. Kast supernatanten og tilsett 50 mL av mAbs miks til hver brønn. Distansere inn enkeltceller ved pipettering.
8. Inkuber cellene for 20 min i mørke ved 4 ° C.
9. Vask cellene to ganger med 150 mL PBS og 2% FBS.
10. Sentrifuger platen på 1500 rpm i 5 min og kast supernatanten ved å snu platen.
11. Fortynn streptavidin i PBS og 2% FBS som indikert å farge cellene.
    • Streptavidin conjugated til APC-Cy7 1:300
12. Tilsett 50 mL av løsningen til hver brønn. Distansere i single cellesuspensjonen ved pipettering.
13. Inkuber cellene i 10 min i mørke ved 4 ° C.
14. Vask cellene to ganger med 150 mL PBS og 2% FBS.
15. Sentrifuger platen på 1500 rpm i 5 min og kast supernatanten.
16. Resuspender celler i 100 mL PBS og 2% FBS.
17. Tilegne prøver på FACS.

3. Magnetic Anrikning av c-Kit ⁺ celler

1. Forbered en bufferløsning som inneholder PBS, 7,2 pH, 0,5% bovint serum albumin (BSA), og 2 mM EDTA.
2. Resuspender cellen pellet av bein squash stammer fra minst 10 mus i 1 mL bufferløsning som inneholder c-Kit MAB konjugert til APC utvannet 01:50.
3. Inkuber cellene for 20 min i mørke ved 4 ° C.
4. Vask to ganger cellene med 40 mL buffer løsning.
5. Sentrifuger røret ved 1500 rpm i 5 min og fjern forsiktig than supernatanten ved aspirasjon. Pass på ikke å forstyrre pelleten.
6. Resuspender cellepelleten og tilsett 50 mL av Anti-APC MicroBeads for hver avlives musen direkte til pellets.
7. Bland godt og inkuber i 20 min i mørke ved 4 ° C.
8. Vask cellene ved å legge 40 mL bufferløsning og sentrifuger ved 1500 rpm i 5 min. Aspirer supernatanten helt.
9. Resuspender cellepelleten i multiplum av 4 mL bufferløsning hver tredje mus avlives.
10. Plasser MACS LS kolonner i magnetfelt av en egnet MACS separator. Bruk en kolonne hver tredje mus avlives.
11. Forbered kolonner ved å skylle med 4 mL buffer løsning.
12. Påfør cellesuspensjon på kolonnene.
13. Samle umerkede celler som passerer gjennom og vaske kolonne med 4 mL buffer løsning. Utfør vaske skritt ved å legge 4 mL bufferløsning tre ganger. Legg til ny buffer når kolonnen reservoaret tømmes.
14. Fjern kolonner fra separator og Place hver på toppen av 15 ml falcon rør.
15. Pipetter 4 mL bufferløsning på hver kolonne. Skyll ut magnetisk merkede celler ved å skyve stempelet inn i kolonnen.
16. Sentrifuger rørene på 1500 rpm i 5 min, og fjern forsiktig supernatanten ved aspirasjon.
17. Resuspender hver pellet med 1 mL bufferløsning og gruppe pellets i en enkelt 15 ml falk tube.

4. Sortering av hematopoetiske stamceller og Lineage engasjerte stamfedre

1. Forbered en blanding av mAbs rettet mot følgende overflaten markører. Fortynn dem som angitt i 500 mL PBS og 2% FBS å farge cellene.
   • CD4, CD8, CD3 og CD45R, CD19, GR1, Ter119, NK1.1 konjugert til PE-Cy5 1:200
   • c-Kit konjugert til APC 1:100
   • SCA-1 konjugert til biotin 01:50
   • CD34 konjugert til FITC 01:50
   • FcγR konjugert til PE 1:100
2. Sentrifuger røret fra previous seksjon ved 1500 rpm i 5 min, og fjern forsiktig supernatanten ved aspirasjon.
3. Legg til mAbs blandingen til pellets. Distansere i single cellesuspensjonen ved pipettering.
4. Inkuber cellene for 20 min i mørke ved 4 ° C.
5. Vask to ganger cellene med 14ml PBS og 2% FBS.
6. Sentrifuger røret ved 1500 rpm i 5 min og kast supernatanten.
7. Fortynn streptavidin som angitt i 500 mL PBS og 2% FBS å farge cellene.
   • Streptavidin konjugert til APC-Cy7 1:300
8. Legg løsningen på røret. Distansere i single cellesuspensjonen ved pipettering.
9. Inkuber cellene i 10 min i mørke ved 4 ° C.
10. Vask to ganger cellene med 14 mL PBS og 2% FBS.
11. Sentrifuger røret ved 1500 rpm i 5 min og kast supernatanten.
12. Resuspender celler i 500 mL PBS og 2% FBS.
13. Overfør og filtrere cellesuspensjon i en ny 5 ml tube for å Eliminate mobilnettet aggregater som kan forstyrre den sortering prosedyren.
14. Tilsett 5 mL av 7-AAD (bruk den utvannet 1:100) til cellen suspensjon for å utelukke 7-AAD ⁺ døde celler fra de sorterte populasjoner.
15. Sortere celler med en BD FACSAria etter følgende fenotyper:
    • LKS celler: Lin ^- c-Kit ⁺ SCA-1 ⁺
    • LT-HSCs: LKS CD34 ^-
    • ST-HSCs: LKS CD34 ⁺
    • GMPs: lin ^- c-Kit ⁺ SCA-1 ^lav FcγR ^høy CD34 ⁺
    • Parlamentsmedlemmene: lin ^- c-Kit ⁺ SCA-1 ^lav FcγR ^lav CD34 ^-
    • CMPs: lin ^- c-Kit ⁺ SCA-1 ^lav FcγR ^lav CD34 ⁺

5. Representative Resultater

Figur 1 viser og eksempel elektronisk gating prosedyren tilpoengsum vanlige lymfoide stamceller (CLPs) som Lin ^- / c-Kit ^LO / interleukin (IL)-7R ⁺ celler; Lin ^- / c-kit ⁺ / SCA-1 ⁺ (LKS) og Lin ^- / c-Kit ⁺ / Sca -1 ^Lo (c-Kit ⁺⁾ celler, fra c-Kit ⁺ gate er vanlige myeloide stamceller (CMPs) identifisert som FcγR ^lo CD34 ⁺ celler, granulocytt / monocytt stamfedre (GMPs) som FcγR ^hi CD34 ⁺ celler og megakaryocyte / erytrocyttantigener stamfedre (parlamentsmedlemmene) som FcγR ^lo CD34 ^- celler; fra LKS gate, LT-HSC og ST-HSC er identifisert som CD34 ^- og CD34 ⁺ celler, henholdsvis. Dette benmargen cellesuspensjon kan bli beriket for c-kit ⁺ celler med magnetiske perler (Fig. 2), LT-HSC og ST-HSC kan deretter sorteres etter CD34 uttrykk så vel som andre stamfedre henhold til fenotypen beskrevet ovenfor.

HSCs kan være ana lyzed i levende bildebehandling konfokalmikroskopi som vist i figur 4, hvor CD34 ^- celler ble farget med nucleotide-bindende sammensatte quinacrine ¹¹ samt kjernekraft rød (DRAQ5). I HSCs, men ikke GMPs, quinacrine-positive vesikler er synlige i cytoplasma ^12. Videre kan sortert HSCs brukes i funksjonelle eksperimenter som vist i figur 5, som viser økningen i cytosoliske Ca ^{2 +} i LT-HSC ved aktivering av purinergic P2 reseptorer ved eksponering for adenosin-trifosfat (ATP) og ionomycin ^12.

Figur 1. Representant prikk tomt analyse av Lin-BM celler. Electronic gating prosedyre ved strømningscytometer å identifisere og scorer blodkreft stamfedre og HSCs fra beinmarg cellesuspensjon beiset som beskrevet i protokollen teksten.

pload/3736/3736fig2.jpg "/>
Figur 2. En ordning for selektiv anrikning av c-Kit ⁺ celler fra benmargen.

Figur 3 Cellesyklus analyse av elektronisk gated LKS CD34 ^-. HSCs i friske kontroller og mus med IBD farget med Ki-67 antistoff og DAPI. Celler ble fikset og permeabilized med Lyse / Fiks og Perm buffere etterfulgt av farging med FITC konjugert Ki-67 og DAPI på en mikrogram / ml. Sykling celler er knapt om i det hele påvises i LKS CD34 ^- HSCs kupé av friske kontrollpersoner ^12.

. Figur 4. Live avbildning konfokalmikroskopi av FACS sortert CD34 ^- HSCs og GMPs farget med nucleotide-bindende sammensatte quinacrine og kjernekraft rød (DRAQ5). De små kvadrantene viser quinacrine positive blemmer oppdaget i cytoplasma av HSCs men ikke GMPs.

Figur 5. Cytosoliske Ca ^{2 +} forhøyede sortert HSCs lastet med Fura-2 og stimulert med ATP og ionomycin. Spor fra enkeltceller vises. Alle cellene var lydhør til ekstracellulær ATP viser fremtredende økning i cytosoliske Ca ^{2 +} etter tilsetting av ATP.

Metoden beskrevet her muliggjør rask og nøyaktig analyse av hematopoiesis i enkelte mus (figur 1). Denne analysen i ulike eksperimentelle innstillinger, inkludert murine modeller av betennelse, autoimmunitet, immunsvikt, degenerative sykdommer, metabolske forstyrrelser og kreft, kan ta opp virkningen av patologiske tilstander på hematopoiesis. Figur 3 viser analysen av cellen sykling aktivitet på elektronisk gated LKS CD34 ^- celler fra friske mus og mus med inflammatorisk tarmsykdom (IBD) ¹³ ved farging med Ki-67 MAB og DAPI. Sistnevnte viste en betydelig økning av celler i S / G ₂ / M faser av cellesyklus. Denne analysen i flowcytometri demonstrerer effekten av T-celle mediert inflammasjon på HSC sykling aktivitet ^12.
Kombinasjon av magnetisk merking og berikelse av benmargceller uttrykke c-Kit med celle sortering i flyt cytometry tillater isolering av høyrent blodkreft avstamning stamfedre og HSCs. De innhentet celle populasjoner kan brukes i en rekke analyser for å studere cellebiologi (figur 4), signaltransduksjon (figur 5), developmentally regulert genuttrykk og in vitro, samt in vivo funksjonelle potensialet i forskjellige celle undergrupper. Ble faktisk magnetisk beriket c-Kit ⁺ celler brukt for å kunne innpode ikke-bestrålte verter å studere dynamisk variasjon av HSCs sykling aktivitet i steady state og betennelse ^14. I våre hender prosedyren beskrevet her gir mer effektiv og raskere gjenoppretting av benmargceller enn bein spyling med en gjennomsnittlig yield på 200.000 LKS celler per mus. Den svært lite antall av sovende HSCs som kan isoleres fra sammenslåtte bein squash med flere mus utgjør en grense for eksperimentelle tilnærminger som krever flere celler. For å obviate til denne begrensningen, i mange tilfeller foreløpigestudier kan utføres på flere rikelig LKS celler å se for seg mer fokuserte og punktlig analyser som skal utføres i CD34 ^- sovende HSCs.