Fenotypisk analys och isoleringen av murina hematopoietiska stamceller och Linjen-bundna stamfäder

1. Framställning av cellsuspension från benmärg

1. Euthanize musen och placera djuret i en rostfri kastrull och spraya 70% etanol på sin mage och rygg. Samla lårben och skenben från bakbenen och ryggraden.
2. Noggrant bort alla mjukdelar rester från ryggraden med en vass spets sax och från ben ben med en gasbinda. Lagra ben i en 50 ml Falcon-rör med 30 ml RPMI-medium innehållande 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS), kompletterat med 50 | iM β-merkaptoetanol, 100 | iM MEM icke-essentiella aminosyror, 1 mM MEM natriumpyruvat, 2 mM L-glutamin, 100 | ig / ml streptomycin och 100 U / ml penicillin.
3. Täcka botten av ett tidigare steriliserat mortel med sterila filter.
4. Överföra de ben in i mortel och täcka dem med ett skikt av filter för att montera en friktionsyta.
5. Framställa en 50 ml Falcon-rör försett med en Falcon-filter.
6. Krossa benenmed hjälp av en mortelstöt tills man erhåller en homogen cellsuspension.
7. Överföra suspensionen in i röret.
8. Tillsätt till murbruk 5 ml färskt RPMI fullständigt medium för att tvätta och skörda de återstående cellerna.
9. Upprepa de sista två punkterna tills homogeniserade benen är klar.
10. Överföra och filtrera i ett nytt rör cellsuspensionen för att eliminera den kvarvarande vävnaden skräp.
11. Centrifugera röret vid 1500 rpm under 5 min och noggrant avlägsna supernatanten genom avsugning. Se till att inte störa cellpelleten.

2. Fenotypisk analys

1. Resuspendera och tvätta cellerna i individuella möss i 15 ml PBS och 2% FBS.
2. Centrifugera röret vid 1500 rpm under 5 min och noggrant avlägsna supernatanten genom avsugning. Se till att inte störa pelleten.
3. Häng upp pelleten i 5 ml PBS och 2% FBS och celler räknas.
4. Överföring 1 x 10 ⁶ celler / brunn i en 96 brunnar med rund bottenplatta.
5. Centrifugera plattan vid 1500 vpm under 5 minuter.
6. Förbered en blandning av mAbs riktade mot följande ytmarkörer. Späda ut dem vad som anges i PBS och 2% FBS för att färga cellerna.
   • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 konjugerade till PE-Cy5 1:200
   • c-Kit konjugerad till APC 1:100
   • Sca1 konjugerad till biotin 1:50
   • CD34 konjugerad till FITC 1:50
   • FcyR konjugerad till PE 1:100
   • IL-7R konjugerad till PE-Cy7 1:100
7. Kasta bort supernatanten och tillsätt 50 | il av mAb blandningen till varje brunn. Dissociera till enstaka celler genom pipettering.
8. Inkubera cellerna i 20 min i mörker vid 4 ° C.
9. Tvätta celler två gånger med 150 | il PBS och 2% FBS.
10. Centrifugera plattan vid 1500 rpm under 5 min och kasta supernatanten genom att vända på plattan.
11. Späd streptavidin i PBS och 2% FBS som anges för att färga cellerna.
    • Streptavidin conjugated till APC-Cy7 1:300
12. Tillsätt 50 pl av lösningen till varje brunn. Dissociera till enkelcellsuspension genom pipettering.
13. Inkubera cellerna i 10 minuter i mörker vid 4 ° C.
14. Tvätta celler två gånger med 150 | il PBS och 2% FBS.
15. Centrifugera plattan vid 1500 rpm under 5 min och avlägsna supernatanten.
16. Återsuspendera cellerna i 100 | il PBS och 2% FBS.
17. Skaffa prover på FACS.

3. Magnetisk Anrikning av c-kit ^+-celler

1. Framställa en buffertlösning innehållande PBS, pH 7,2, 0,5% bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM EDTA.
2. Resuspendera cellpelleten av benmärg härledd från minst 10 möss i 1 ml buffert innehållande c-Kit-mAb konjugerad med APC späddes 1:50.
3. Inkubera cellerna i 20 min i mörker vid 4 ° C.
4. Tvätta två gånger cellerna med 40 ml av buffertlösning.
5. Centrifugera röret vid 1.500 rpm i 5 min och ta försiktigt bort tHan supernatanten genom aspiration. Se till att inte störa pelleten.
6. Återsuspendera cellpellet och tillsätt 50 pl anti-APC Mikropärlor för varje avlivas musen direkt till pelleten.
7. Blanda väl och inkubera under 20 minuter i mörker vid 4 ° C.
8. Tvätta cellerna genom tillsats av 40 ml av buffertlösning och centrifugera vid 1500 rpm under 5 minuter. Aspirera supernatanten fullständigt.
9. Återsuspendera cellpelleten i multipel av 4 ml buffertlösning var tre möss avlivas.
10. Ställe MACS LS kolumner i det magnetiska fältet av en lämplig separator MACS. Använd 1 kolumn var tre möss avlivas.
11. Framställ kolonner av sköljning med 4 ml av buffertlösning.
12. Applicera cellsuspension på kolumnerna.
13. Samla omärkta celler som passerar genom och tvätta kolonnen med 4 ml av buffertlösning. Utföra tvättsteg genom tillsats av 4 ml buffert-lösning tre gånger. Lägg till ny buffert när kolumnen behållaren töms.
14. Ta bort kolumner från separatorn och Place var och en på toppen av 15 ml Falcon-rör.
15. Pipett 4 ml buffertlösning till varje kolonn. Omedelbart spola ut de magnetiskt märkta cellerna genom att trycka in kolven in i kolonnen.
16. Centrifugera rören vid 1500 rpm under 5 min och noggrant avlägsna supernatanten genom avsugning.
17. Ätersuspendera varje pellet med 1 ml buffertlösning och pellets grupp i en enda 15 ml Falcon-rör.

4. Sortering av hematopoietiska stamceller och Lineage bundna stamfäder

1. Förbered en blandning av mAbs riktade mot följande ytmarkörer. Späda ut dem vad som anges i 500 | il PBS och 2% FBS för att färga cellerna.
   • CD4, CD8, CD3, CD45R, CD19, Gr1, Ter119, NK1.1 konjugerade till PE-Cy5 1:200
   • c-Kit konjugerad till APC 1:100
   • Sca-1 konjugerad till biotin 1:50
   • CD34 konjugerad till FITC 1:50
   • FcyR konjugerad till PE 1:100
2. Centrifugera röret från previousektionen vid 1.500 rpm i 5 min och ta försiktigt bort supernatanten genom aspiration.
3. Tillsätt mAb blandning till pelleten. Dissociera till enkelcellsuspension genom pipettering.
4. Inkubera cellerna i 20 min i mörker vid 4 ° C.
5. Tvätta två gånger cellerna med 14 ml av PBS och 2% FBS.
6. Centrifugera röret vid 1500 rpm under 5 min och avlägsna supernatanten.
7. Späd streptavidin såsom anges i 500 | il PBS och 2% FBS för att färga cellerna.
   • Streptavidin konjugerat till APC-Cy7 1:300
8. Tillsätta lösningen till röret. Dissociera till enkelcellsuspension genom pipettering.
9. Inkubera cellerna i 10 minuter i mörker vid 4 ° C.
10. Tvätta två gånger cellerna med 14 ml PBS och 2% FBS.
11. Centrifugera röret vid 1500 rpm under 5 min och avlägsna supernatanten.
12. Återsuspendera cellerna i 500 | il av PBS och 2% FBS.
13. Överföra och filtrera cellsuspensionen i en ny 5 ml rör för att eliär tända cellulära aggregat som kan interferera med sorteringsproceduren.
14. Tillsätt 5 | il av 7-AAD (använda den utspäddes 1:100) till cellsuspensionen för att utesluta 7-AAD ⁺ döda celler från de sorterade populationer.
15. Sortera celler med en BD FACSAria enligt följande fenotyper:
    • LKS celler: Lin ^- c-Kit ⁺ Sca-1 ⁺
    • LT-HSC: LKS CD34 ^-
    • ST-HSC: er: LKS ^CD34
    • GMP: Lin ^- c-Kit ⁺ Sca-1 ^låg FcyR ^högt CD34 ⁺
    • Ledamöterna: Lin ^- c-Kit ⁺ Sca-1 ^låg FcyR ^låg CD34 ^-
    • CMPs: Lin ^- c-Kit ⁺ Sca-1 ^låg FcyR ^låg CD34 ⁺

5. Representativa resultat

Figur 1 visar och exempel på den elektroniska gating förfarandet tillpoäng vanliga lymfoidprogenitorer (CLPS) som Lin ^- / c-Kit ^lo / interleukin (IL)-7R ⁺ celler, Lin ^- / c-Kit ⁺ / Sca-1 ⁺ (LKS) och Lin ^- / c-Kit ⁺ / Sca -1 ^lo (c-Kit ^+)-celler, från c-Kit ⁺ grind, är vanliga myeloida stamceller (CMPs) identifierats som FcyR ^lo CD34 ⁺ celler, granulocyter / monocyt föregångare (GMP) som FcyR ^hi CD34 ⁺ celler och megakaryocyt / erytrocyter stamfäder (ledamöter) som FcyR ^lo CD34 ^- celler, från LKS porten, LT-HSC och ST-HSC identifieras som CD34 ^- och CD34 ⁺ celler. Denna suspension av benmärgsceller kan berikas för c-kit ^+-celler med magnetiska kulor (Fig. 2); LT-HSC och ST-HSC kan sedan sorteras i enlighet med CD34-uttryck såväl som andra progenitorer enligt fenotypen som beskrivits ovan.

HSC kan ana lyserades i live imaging konfokalmikroskopi som visas i figur 4, där CD34 ^- celler färgades med nukleotid-bindande förening kinakrin ¹¹ samt nukleär röd (DRAQ5). I HSC: er, men inte genetiskt modifierade växter, kinakrin-positiva vesiklar är synliga i cytoplasman ^12. Dessutom kan sorteras HSC: er användas i funktionella experiment som visas i figur 5, som visar ökningen i cytosolisk Ca ^{2 +} i LT-HSC genom aktivering av purinerga P2-receptorer vid exponering för adenosin-trifosfat (ATP) och jonomycin ^12.

Figur 1. Representativa plot-analys av Lin-BM-celler. Elektronisk gating förfarande vid flödescytometer för att identifiera och poäng hematopoetiska progenitorceller och HSC från benmärg cellsuspension färgade som beskrivs i protokollet texten.

pload/3736/3736fig2.jpg "/>
Figur 2. Ett system för selektiv anrikning av c-kit ^+-celler från benmärg.

Figur 3 Cellcykelanalys av elektroniskt styrda LKS CD34 ^-. HSC hos friska kontroller och möss med IBD som färgats med Ki-67 antikropp och DAPI. Cellerna fixerades och permeabiliserades med Lyse / Fix och Perm buffertar följt av färgning med FITC-konjugerat Ki-67-och DAPI vid 1 | ig / ml. Cyklande celler är knappt eller inte alls upptäckas i LKS CD34 ^- HSC fack friska kontroller ^12.

. Figur 4 Live avbildning konfokalmikroskopi av FACS sorterade CD34 ^- HSC och god tillverkningssed som färgats med nukleotid-bindande förening kinakrin och nukleära röd (DRAQ5). De små kvadranter visar kinakrin postiva vesiklar detekteras i cytoplasman av HSC: er men inte genetiskt modifierade växter.

Figur 5. Cytosolisk Ca ^{2 +} förhöjda sorterade HSC lastade med Fura-2 och stimulerades med ATP och jonomycin. Spår från enstaka celler visas. Alla celler reagerar på extracellulära ATP visar framstående ökning i cytosoliska Ca ^{2 +} efter tillsats av ATP.

Den metod som beskrivs här möjliggör snabb och noggrann analys av hematopoies i individuella möss (figur 1). Denna analys i olika experimentella inställningar, inklusive musmodeller av inflammation, autoimmunitet, immunbrist, degenerativa sjukdomar, metabola sjukdomar och cancer kan ta itu med konsekvenserna av patologiska tillstånd på blodbildningen. Figur 3 visar analysen av cellcykeln aktivitet på elektronisk gated LKS CD34 ^- celler från friska möss och möss med inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) ¹³ från färgning med Ki-67-mAb och DAPI. Den senare visas en signifikant ökning av celler i S / _G2 / M faser av cellcykeln. Denna analys i flödescytometri visar effekterna av T-cell-medierad inflammation på HSC cykling aktivitet ^12.
Kombination av magnetisk märkning och anrikning av benmärgsceller som uttrycker c-kit med cellsortering i flödet cytometry kan isolering av höggradigt renat hematopoetiska härstamning föregångare och HSC. De erhållna cellpopulationer kan användas i ett antal analyser för att studera cellbiologi (figur 4), signaltransduktion (figur 5), utvecklingsmässigt reglerad genexpression och in vitro såväl som in vivo funktionell potential distinkta cellundergrupper. I själva verket var magnetiskt berikade c-Kit ⁺ celler används för att framgångsrikt ympa icke bestrålade värdar för att studera dynamiska variationen av HSC cykla aktivitet i steady state och inflammation ^14. I våra händer som beskrivs här kan bli effektivare och snabbare återhämtning av benmärgsceller än ben spolning med en genomsnittlig avkastning på 200.000 LKS celler per mus. Det mycket låga antalet passiva HSC som kan isoleras från poolade benmärg av flera möss utgör en gräns för experimentella metoder som kräver fler celler. För att undanröja denna begränsning, i många fall preliminärastudier kan utföras på fler rikliga LKS cellerna att förutse mer fokuserade och punktlig analyser som skall utföras i CD34 ^- passiva HSC.