Genereren van Induced regulatoire T-cellen uit primaire menselijke naïef en geheugen T-cellen

1. Isolatie van de humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) van Buffy Coat

1. Verwerven van een eenheid van buffycoat uit het ziekenhuis of in de omgeving bloed locatie in het centrum. Ons bloed centrum voorziet ons van ongeveer 40-60 ml buffycoat per eenheid verkregen van normaal bloed donoren.
2. Giet het bloed in een autoclaaf 500 ml glazen fles met steriel PBS tot buffycoat verdunnen. Het eindvolume van PBS + buffy coat moet 250 ml.
3. Vul tien 50 ml conische buizen met elk 20 ml Lymphoprep oplossing.
4. Voorzichtig bedekken de Lymphoprep oplossing met 25 ml van het verdunde buffy coat, zorg dat u de Lymphoprep oplossing verstoren.
5. Spin buizen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur bij 500 x g. Zorg ervoor dat het uitschakelen van de centrifuge van de rem, om zo niet de lymfocyt fractie verstoren.
6. Verzamelen van de PBMC aan het grensvlak tussen de Lymphoprep en het plasma-medium lagen met een pipet. Zuig de plasma-medium uit tot ongeveer 1 mlnog steeds betrekking op de buffy coat laag met de PBMC's. Gebruik een 10 ml pipet op PBMC's over te dragen aan een nieuwe 50 ml buis.
7. Tweemaal wassen cellen met PBS en vervolgens cellen te resuspenderen in 50 ml koud RPMI voor het tellen van een hemocytometer. Typische herstel is 8 x 10 ⁸ - 1 x 10 ⁹ PBMC's.

Deze procedure kan worden verlaagd voor kleinere hoeveelheden bloed. Verdunning van bloed monsters 1:01 in PBS.

2. Magnetische negatieve selectie van Total CD4 ⁺ T-cellen, CD4 ⁺ CD45RA ⁺ naïeve T-cellen of CD4 ⁺ CD45RO ⁺ geheugen T-cellen uit PBMC met EasySep Enrichment Kits (Stem Cell Technologies)

Te volgen stappen voor 1 x 10 ⁸ tot 4,25 x 10 ⁸ PBMC's.

1. Hersuspenderen PBMC tot een uiteindelijke concentratie van 5 x 10 ⁷ per ml in PBS dat 2% FBS en 1 mM EDTA. Verplaats cellen om een ​​verse 14 ml polypropyleen ronde bodem buis.
   Isolatie van totaal humaan CD4 ⁺ T-cellen door negatieve selectie: voeg menselijke CD4 ⁺ T-cellen Enrichment cocktail van antilichamen (50 pL per ml PBMCs) en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   1. Isolatie van menselijke naïeve T-cellen door negatieve selectie: voeg 50 ul van anti-CD45RO antilichaam per ml celsuspensie PBMC, mengen en incuberen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Voeg verrijking cocktail die bij de kit (50 pL per ml PBMCs), mengen en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
   2. Isolatie van het menselijk geheugen T-cellen door negatieve selectie: voeg het menselijk geheugen CD4 ⁺ T Cell Verrijking Cocktail van antilichamen (50 ul per ml van PBMC's), meng en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
2. Meng magnetische deeltjes in gelijke mate te verspreiden in de hele oplossing. Niet vortex nanodeeltjes uit naïef kit.
3. Voeg de magnetische deeltjes (100 pl per ml van PBMC's voor de totale CD4 ⁺ en naïeve T-cel selectie, 50 ul per ml van PBMC's voor het geheugen T-cel-selectie). Meng door voorzichtig pipetteren 2-3 en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten naïve T-cel selectie of 5 minuten geheugen of totale CD4 ⁺ T-cel selectie.
4. Voeg PBS dat 2% FBS en 1 mM EDTA het volume met tot 10 ml per buis. Meng door zachtjes te pipetteren 2-3 keer voor het plaatsen van niet-afgetopte buis in zilver EasySep magneet voor 5, 10 of 2,5 minuut voor het totale CD4 ⁺ T-cellen, naïef en geheugen subsets, respectievelijk.
5. Met buis nog in EasySep magneet, giet vloeistof in nieuwe 50 ml buis naar de cellen van belang te isoleren.
6. Herhaal de stappen 2.5 en 2.6 voor beter herstel.

3. Cultuur van de Cel Te regulatoire T-cellen induceren

1. De dag voor stap 1 en 2, laag weefselkweekplaten door eerst verdunnen anti-CD3-antilichaam (OKT3 kloon) tot een concentratie van 1 ug / ml in steriele PBS. Voor een 6 wells plaat 2 ml PBS + anti-CD3 per putje toe te voegen, voor een 12 wells plaat voeg 1 ml of voor een 24 wells plaat voeg 500 ul per putje. Houd de gecoate plaat staan ​​bij 4 ° C tot gebruik.
2. Bereid polarisatie medium door toevoeging van 10% hitte-geïnactiveerd foetaal koeienserum (FBS), 100 U / mL penicilline, 100 pg / ml streptomycine en 50 uM β-mercapto-ethanol met RPMI-1640 vooraf aangevuld met 2,06 mM Glutamax I-en 25 mM HEPES buffer. Vervolgens voegt 2 ng / ml TGF-β en 5 ng / ml IL-2. Hier kan een toe te voegen liganden of remmers van belang zijn voor de media. Resuspenderen cellen uit stap 2 in een concentratie van 2 x 10 ⁶ cellen / ml polarisatie medium.
3. Voorverwarmen platen bij 37 ° C en zuig de PBS van anti-CD3-beklede putjes voor het toevoegen cellen. Voeg 4 mL per putje celsuspensie voor een 6 wei-plaat, 2 ml cellen voor een 12 wei-plaat of 1 ml cellen voor een 24 wei-plaat. Vul lege putten met PBS om verdamping te verminderen vanmedia. Incubeer gedurende 3 dagen bij 37 ° C / 5% CO _2.
4. Op dag 3 na plating, draaien beneden plaat in een centrifuge gedurende 5 minuten bij 500 x g. Zonder te storen T-cellen aan de onderkant van de plaat, verwijdert u de helft van de media en te vervangen door vers medium. Anderzijds, als het goed wordt overvol met cellen (concentratie van meer dan 3 x 10 ⁶ / ml), splitsen van het volume even in een andere anti-CD3 gecoate plaat en opnieuw toevoegen verse media tot oorspronkelijke volume. Incubeer twee tot drie dagen bij 37 ° C / _5% CO2.

4. Fluorescentie-Activated Cell Sorting (FACS) van de drie populaties van T-cellen

1. Bereid FACS wasbuffer door toevoeging van 0,5% (w / v) bovine serum albumine (BSA) en 2 mM EDTA steriele PBS. Plaats buffer bij 4 ° C te koud.
2. Goed te verwijderen cellen van celkweek en spoel elke well met 2 ml PBS om volledige cel herstel te verzekeren. Plaats alle cellen in 50 ml polypropyleen buizen en centrifugeer op 500 xg gedurende 10minuten bij 4 ° C.
3. Tel de cellen op een hemocytometer de cel dichtheid bepalen.
4. Plaats 3-5 x 10 ⁵ cellen per buis in vier afzonderlijke 5 ml ronde bodem polystyreen buizen voor vergoeding controles. Plaats resterende cellen in 50 ml polypropyleenbuizen niet meer dan 35 x 10 ⁶ cellen per buis.
5. Spin down cellen gedurende 5 minuten bij 4 ° C en zuig media. Resuspenderen cellen worden gesorteerd in 90 pi koude wasbuffer per 1 x 10 ⁶ cellen. Resuspenderen in 100 ul van koud wassen de buffer van de compensatieregeling, buizen.
6. Om de cellen te sorteren, combineren 2 pi anti-CD25-PE, 3 pi anti-CD45RA-PE-Cy5 en 1 pi anti-CD127 APC per 1 x 10 ⁶ cellen. Voeg geen antilichaam tegen de eerste compensatieregelaar buis, 2 pi anti-CD25-PE de tweede buis 3 pi anti-CD45RA ^- PE-Cy5 de derde buis en1 pi anti-CD127 APC de vierde buis. Incubeer alle buizen op ijs gedurende 45 minuten in het donker.
7. Zuig buffer en hersuspenderen cellen in een concentratie van 1 x 10 ⁷ cellen per ml wasbuffer. Voeg 1,5 ul van DNase II per ml van de cellen voor het filteren door middel van een 40 uM nylon cel zeef. Verplaatsen cellen meervoudige 5 ml met ronde bodem polypropyleenbuizen met niet meer dan 3,5 ml per buis. Resuspendeer compensatieregeling, cellen in 300 ul van wassen buffer.
8. Stel schadevergoeding MoFlo flowcytometer cross detectie te minimaliseren door de PE, APC en PE-Cy5 filters. Stel poorten naar iTregs (CD25 ^Hi CD127 ^-/LOW CD45RA ^- cellen) te sorteren, naïef (CD25-CD45RA ⁺⁾ en geheugen (CD25 ^- CD45RA ^-) T-cellen in 5 ml ronde bodem polystyreen buizen met een serum van pasgeboren kalf.

5. Onderdrukking Assay

1. Maak suppression assay media door toevoeging van 100 U / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 5 ng / ml IL-2 en 2 ng / ml TGF-β AIM-V.
2. De dag van de test, te zuiveren heterologe CD4 ⁺ T-cellen van de buffy coat, zoals aangegeven in stap 1 en 2. Dit zijn de doelwitcellen de onderdrukking assay en bevat geen CD25 ⁺ cellen Treg, zoals te zien in figuur 2 dag 0.
3. Label cellen CellTrace kit volgens fabrikant, behalve dat slechts 1 pi van 5 mM voorraadoplossing per ml cellen in plaats van 2 pl. Houden uit direct zonlicht, voeg 18 ul van de DMSO door de CellTrace kit tot een flacon van CFSE om een ​​5 mM stockoplossing te maken. Resuspenderen het vereiste aantal doelcellen (maximaal 1 x 10 ⁷⁾ in voorverwarmde PBS + 0,1% (w / v) BSA tot een eindconcentratie van 1 x 10 ⁶ cellen / ml. Voeg 1 ul van 5 mM CFSE per ml cellen en incuberen op 37 ° C waterbad gedurende 5 minutes. Voeg 5 volumes van volledige, ijskoude RPMI met 10% FBS tegen vlekken te lessen en op ijs incubeer gedurende 5 minuten. Was de cellen twee keer met koud volledige RPMI en resuspendeer 1 x 10 ⁵ cellen per 100 ui van onderdrukking test media.
4. Treg onderdrukking inspecteur kralen op een voorraad concentratie van 2 x 10 ⁷ kralen / ml. Pellet een aantal korrels gelijk aan het totale aantal cellen per experiment snel centrifugeren in een Eppendorf buis. Ze wast kralen met RPMI en re-pellet. Na aspiratie van RPMI, Resuspendeer kralen, zodat de juiste hoeveelheid korrels per goed zijn in 8 ul van onderdrukking test media.
5. Om een 96 ronde bodem weefselkweek plaat toe CFSE-gekleurde cellen (1 x 10 ⁵ cellen / ml) inspecteur kralen en gepolariseerd gesorteerde cellen (1 x 10 ⁵ cellen / ml) in vers onderdrukking assay media voor een gewenst doel (CFSE gekleurd): effector (gesorteerd) verhouding in een eindvolume van 200 ul. Alle voorwaarden zijn vastgelegd in tripliCates.
6. Bereid de eerste van twee controle condities door het toevoegen van 100 pi van CFSE gekleurde cellen, 8 ul van inspecteur kralen en 1 x 10 ⁵ van verse, ongekleurde cellen in 92 microliter suppressor voedingsbodem per well. Bereid de tweede controle met dezelfde cellulaire componenten als hierboven, maar zonder Treg inspecteur kralen.
7. Afdekplaat aluminiumfolie en incuberen bij 37 ° C / _5% CO2 gedurende vijf dagen.
8. In het donker verzamelen cellen uit elk putje van pipetteren en in een 5 ml met ronde bodem polystyreenbuis. Centrifugeer cellen bij 500 g gedurende 5 minuten bij 4 ° C, aspiraat media en hersuspenderen in 300 ul koud FACS wasbuffer vanaf stap 4. Analyseer de eerste 3 x 10 ⁴ CFSE ⁺ gebeurtenissen uit de live-lymfocyt gate die doelcellen in een histogram met Cell Quest software.

6. Representatieve resultaten

Voorbeeld van een flowcytometrische pseudocolor dot plots over een termijn van vijf dagen-course controle iTreg differentiatie van de relatieve co-expressie van CD25 met Foxp3 kan CTLA-4 CD45RA te zien in Figuur 2. Het histogram in figuur 3 met succes onderdrukking assay waarin gesorteerde iTregs (CD25 ^Hi CD45RA ^- CD127 ^-/LOW cellen). De subset van vijf dagen cultuur heeft verkregen regulerende / suppressor vermogen Figuur 4 toont de inductie van Tregs van een naïeve T-cel pool (boven panelen) en een geheugen T-cel pool (onderste panelen), na vijf dagen cultuur in de standaard iTreg medium. CFSE kleuring van de eerste cellen aan te tonen dat ofwel naïef (rechtsboven paneel) of memory T-cellen (rechts onder panel) naar iTregs (hoogste Foxp3 expressie cellen) te onderscheiden pas na enkele rondes van celdeling.

Figuur 1. Schematische experimentele procedure. PBMC are afgescheiden van de menselijke perifeer bloed via gradiënt centrifugatie voor magnetische negatieve selectie van CD4 ⁺ CD25 ^- T-cellen. Na vijf tot zes dagen in cultuur, cellen ondergaan FACS en zijn co-geïncubeerd met heterologe CFSE gelabelde doelcellen aan suppressor activiteit te meten.

Figuur 2 Gezuiverd humane primaire CD4 ⁺ CD25 ^-. T cellen worden gekweekt in medium iTreg. Een deel van cellen verzameld net na isolatie (dag 0) en 1, 3 en 5 van celkweek de voortgang van CD45RA, Foxp3, CTLA-4 en CD25 markeringen houden. De iTreg profiel komt overeen met CD45RA ^-, Foxp3 ^Hi, CTLA-4 ^Hi en CD25 ^Hi (gemarkeerd in de in-grafiek venster).

Figuur 3. Gezuiverde CD4 ⁺ CFSE labeled cellen (1 x 10 ⁵ / putje) zijn gekweekt met Treg onderdrukking inspecteur korrels bij aanwezigheid van gesorteerde naïeve geheugen of iTreg cellen (3 x 10 ⁴ / putje). Na vijf dagen worden de cellen geoogst en de CFSE profiel van de gekleurde cellen geanalyseerd door flowcytometrie. De aanwezigheid van iTreg cellen heft volledig de proliferatie van CD4 ⁺ T-cellen. Aantallen zijn een indicatie van het percentage van CFSE-gelabelde cellen die hebben ondergaan divisie.

Figuur 4 Gezuiverd menselijke primaire naïef. (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RA ⁺⁾ en geheugen (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RO ⁺⁾ T-cellen worden gekleurd met CFSE en gekweekt in iTreg medium. Na vijf dagen worden de cellen fenotype en de celdeling tarieven geschat. Zoals aangegeven in fig. 2, iTreg deelverzameling onderscheiden van beide subsets overeen metCD45RA ^- CD25 ^Hi Foxp3 ^Hi en CTLA-4 ^Hi (laatste twee niet getoond). Vergelijkende CFSE kleuring profielen te identificeren iTregs (hier als de hoogste uitdrukking Foxp3 T-cellen) als de meest proliferatieve cellen tijdens de vijf-daagse cultuur.

Terwijl Treg overdracht bezit enorme therapeutische belofte bij de bestrijding van auto-immuniteit afstoting van het transplantaat en andere immuun-of inflammatoire-gemedieerde aandoeningen, methoden voor hun efficiënte generatie en stabiele onderhoud zijn nog niet ontwikkeld. Aangezien slechts 1-5% van de circulerende humane T-cellen zijn Tregs, hun gecontroleerde expansie en differentiatie lost dit gebrek als een belangrijke afschrikkende werking van de uitvoering van Tregs in de kliniek. Aan de andere kant, zoals we geleerd van de TGN1412 proef ^13, het is wetenschappelijk en ethisch noodzakelijk om diepgaand inzicht in de moleculaire gebeurtenissen die orkestreren humane T cel beslissingen over het lot voor de uitvoering van alle therapeutische regime. Met deze methode van iTreg differentiatie, de daaruit voortvloeiende populaties van naïeve, geheugen, effector T-cellen en iTregs vergemakkelijken genexpressie of functionele vergelijkingen tussen populaties van cellen die afkomstig zijn van een humaan perifeer bloed donor. In onze handen zijn gesorteerde cellen zijnvergeleken in microarray en qRT-PCR-analyses tot genetische veranderingen, in het westen van blots te meten om de belangrijkste signalering gebeurtenissen te onderzoeken, of in patch klemmen om functioneel te meten ion kanaal gebruik ^14.

Ons systeem biedt het extra voordeel van de mogelijkheid om de belangrijkste aspecten van het differentiatie proces rond een centrale kader en uitlezing te manipuleren. Zo kan men voorsorteren PBMC de ingang celpopulatie wijzigen of zijn kleine molecule inhibitoren en liganden aan het kweekmedium. Men kan ook transfecteren cellen overexpressie of neer te slaan een eiwit van interesse of een reporter constructie voeren. Als extra voordeel kunnen veranderen we de omstandigheden van de cultuur het percentage van de gegenereerde iTregs maximaliseren. Al deze humane primaire T celkweek schetst een zeer robuuste experimenteel platform een ​​fysiologisch relevante veel groter dan die in muizen systemen. Belangrijk is, kan het ook het behoud van een directe therapeutische waarde. Zoals most huidige Treg-gebaseerde therapeutische benaderingen te betrekken in vitro of ex vivo ontwikkeling of manipulatie van cellen, kan ons systeem worden gezien als een belangrijk kanaal op de weg naar integratie van Treg celtherapie bij de standaard van zorg. Toekomstige uitbreidingen op dit systeem zal op maat van Tregs te worden geactiveerd bij ontmoeting met de specifieke in vivo ontstekingsreactie antigenen in plaats van de beschreven polyklonale activatie.