Geração de Células T reguladoras induzidas a partir de células T humanas primárias Naïve e Memória

1. Isolamento de Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de Buffy Coat

1. Adquirir uma unidade de revestimento buffy do hospital ou centro de localização nas proximidades de sangue. Nosso centro de sangue nos fornece cerca de 40-60 mL de buffy coat por unidade obtido a partir de doadores de sangue normais.
2. Derrame sangue em uma garrafa de vidro esterilizada contendo 500 mL PBS estéril para diluir buffy coat. O volume final de PBS + buffy coat deve ser de 250 mL.
3. Encha dez 50 mL tubos cónicos cada uma com 20 mL solução de Lymphoprep.
4. Suavemente sobrepor a solução Lymphoprep com 25 mL de buffy coat diluída, tendo cuidado para não perturbar a solução Lymphoprep.
5. Girar tubos durante 30 minutos à temperatura ambiente a 500 x g. Assegure-se para desligar o freio de centrífuga, de modo a não perturbar a fracção de linfócitos.
6. Recolher as PBMCs na interface entre o Lymphoprep e as camadas de plasma médio com uma pipeta. Aspirar o off plasma médio até cerca de 1 mLainda cobre a camada de buffy coat contendo as CMSPs. Usar uma pipeta 10 mL de transferir para um tubo de PBMCs mL novo 50.
7. Lave as células duas vezes com PBS e em seguida, ressuspender as células em 50 mL de RPMI frio para contagem num hemocitómetro. Recuperação típica é de 8 x 10 ⁸ - 1 x 10 ⁹ PBMCs.

Este procedimento pode ser reduzida para pequenos volumes de sangue. A diluição das amostras de sangue total é de 1:1 em PBS.

2. Seleção Negativa magnética de células CD4 ⁺ Total de células T, ^CD4 + CD45RA ^células T naive ou ^CD4 + CD45RO ⁺ células T de memória de PBMCs utilizando Kits de enriquecimento EasySep (células-tronco Technologies)

Passos a seguir para 1 x 10 ⁸ a 4,25 x 10 ⁸ PBMCs.

1. PBMCs Ressuspender a uma concentração final de 5 x 10 ⁷ por mL em PBS contendo 2% de FBS e 1 mM de EDTA. Mover células para a 14 mL de polipropileno novo tubo de fundo redondo.
   Isolamento do total de células CD4 ^{+ de} células T humanas por selecção negativa: adicionar T CD4 + ^humanas de cocktail de Enriquecimento Célula de anticorpos (50 uL por mL de PBMCs), misturar e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
   1. Isolamento de células T humanas naive por selecção negativa: adicionar 50 ul de anti-CD45RO anticorpo por mL de suspensão de células PBMC, misturar e incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente. Adicionar cocktail de enriquecimento fornecido com o kit (50 uL de por mL de PBMCs), misturar e incubar à temperatura ambiente durante 10 minutos.
   2. Isolamento de células T humanas de memória por selecção negativa: adicionar CD4 + ^humanas de memória T Cocktail Enriquecimento Célula de anticorpos (50 uL por mL de PBMCs), misturar e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente.
2. Misture bem para partículas magnéticas igualmente distribuí-los em toda a solução. Faça nanopartículas não vórtice de kit ingênuo.
3. Adicionar as partículas magnéticas (100 uL por mL de PBMCs para CD4 ⁺ totais e selecção de células T ingénuos, 50 uL por mL de PBMCs para a memória de selecção de células T). Mix com cuidado pipetando 2-3 vezes e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos para a selecção de células T naïve ou 5 minutos de memória ou total T ^CD4 + de seleção de célula.
4. Adicionar PBS contendo 2% de FBS e 1 mM de EDTA para levar o volume até 10 mL por tubo. Misture com cuidado pipetando 2-3 vezes antes de colocar tubo sem tampa em prata ímã EasySep para 5, 10 ou 2,5 minutos para CD4 total de ^células T, subconjuntos ingênuos e memória, respectivamente.
5. Com tubo ainda no ímã EasySep, despeje o líquido em novo tubo de 50 ml para isolar as células de interesse.
6. Repita os passos 2.5 e 2.6 para uma melhor recuperação.

3. Condições de cultura celular para induzir as células T reguladoras

1. Um dia antes passos 1 e 2, o revestimento placas de cultura de tecidos por primeira diluição anticorpo anti-CD3 (OKT3 clone) a uma concentração de 1 ug / mL em PBS estéril. Para uma placa de 6 poços adicionar 2 mL de PBS + anti-CD3 por poço, para uma placa de 12 poços adicionar 1 mL ou para uma placa de 24 poços adicionar 500 uL por poço. Manter a placa revestida a 4 ° C até à utilização.
2. Preparar meio de polarização através da adição de 10% inactivado pelo calor de soro fetal bovino (FBS), 100 U / mL de penicilina, estreptomicina 100 ug / mL e 50 uM β-mercaptoetanol para RPMI-1640 pré-suplementado com 2,06 mM mM Glutamax-I e 25 tampão HEPES. Em seguida, adicionar 2 ng / mL de TGF-β e 5 ng / mL de IL-2. Aqui, pode-se adicionar ligantes ou inibidores de interesse para a mídia. Ressuspender as células a partir do passo 2, a uma concentração de 2 x 10 ⁶ células / ml de meio de polarização.
3. Pré-aquecer as placas a 37 ° C e aspirar o PBS de anti-CD3 poços revestidos antes de adicionar as células. Adicionar 4 mL por poço de suspensão de células para uma placa de 6 poços, 2 mL de células para uma placa de 12 poços ou 1 mL de células para uma placa de 24 bem. Encha poços vazios com PBS para reduzir a evaporação demeios de comunicação. Incubar durante 3 dias a 37 ° C / 5% de CO _2.
4. No dia 3 pós de revestimento, girar para baixo da placa numa centrífuga durante 5 minutos a 500 x g. Sem perturbar as células T na parte inferior da placa, remover metade dos meios de comunicação e substituir com meios frescos. Alternativamente, se o bem torna-se cheia com células (concentração acima de 3 x 10 ⁶ / mL), dividir o volume igualmente em outra placa de anti-CD3 revestido e adicionar meios frescos para trás até ao volume original. Incubar durante dois a três dias mais a 37 ° C / 5% de CO _2.

4. Fluorescência-activated cell sorting (FACS) de três populações de células T

1. Preparar tampão de lavagem de FACS pela adição de 0,5% (w / v) de albumina sérica bovina (BSA) e 2 mM de EDTA para PBS estéril. Tampão a 4 ° C para obter a frio.
2. Remover as células de cultura de células bem e enxaguar cada poço com 2 mL de PBS para assegurar a recuperação completa das células. Coloque todas as células em 50 tubos de polipropileno mL e centrifugar a 500 xg durante 10minutos a 4 ° C.
3. Contar as células em um hemocitómetro para determinar a densidade celular.
4. O local de 3-5 x 10 células por tubo ⁵ em quatro separadas 5 mL tubos de fundo redondo de poliestireno para os controlos de compensação. Coloque células restantes em tubos de 50 ml de polipropileno, não mais do que 35 x 10 ⁶ células por tubo.
5. Girar para baixo células durante 5 minutos a 4 ° C e meios de comunicação aspirado. Ressuspender as células a serem classificados em 90 uL de tampão de lavagem fria por 1 x 10 ⁶ células. Ressuspender em 100 L de tampão de lavagem a frio dos tubos de controle de compensação.
6. Para as células a ser ordenados, combinar 2 uL de anti-CD25-PE, 3 uL de anti-CD45RA-PE-Cy5 e 1 uL de anti-CD127-APC por 1 x 10 ⁶ células. Adicionar nenhum anticorpo para o primeiro tubo de compensação de controlo, 2 uL de anti-CD25-PE para o segundo tubo, 3 uL de anti-CD45RA ^- PE-Cy5 ao terceiro tubo uL de anti-e1 CD127-APC para o tubo de quarto. Incubar todos os tubos em gelo durante 45 minutos no escuro.
7. Aspirar células tampão e ressuspender a uma concentração de 1 x 10 células por ⁷ mL de tampão de lavagem. Adicionar 1,5 ul de DNase II por mL de células antes de filtrar através de um coador de 40 uM de células de nylon. Mover as células a várias 5 mL redondos tubos de polipropileno de fundo com não mais do que 3,5 mL por tubo. Ressuspender as células controle de compensação em 300 uL de tampão de lavagem.
8. Defina a compensação em MoFlo citômetro de fluxo para minimizar a detecção cruzada pela, PE APC e PE-Cy5 filtros. Definir portas para classificar iTregs (CD25 CD127 ^{Hi -/LOW} CD45RA ^- células), virgens (CD25-CD45RA ⁺⁾ e memória (CD25 ^- CD45RA ^-) células T em 5 mL tubos de fundo redondo de isopor contendo 1 mL soro de bezerro recém-nascido.

5. Ensaio de supressão

1. Faça SUPPRession meio de ensaio por adição de 100 U / mL de penicilina, 100 ug / mL de estreptomicina, 5 ng / mL de IL-2 e 2 ng / mL de TGF-β ao AIM-V.
2. No dia do ensaio, purificar CD4 ^{+ de} células T heterólogas a partir de buffy coat, como indicado nos passos 1 e 2. Estas serão as células alvo para o ensaio de supressão e não contém células ^CD25 + Treg, como pode ser visto na Figura 2, dia 0.
3. Células de etiqueta com CellTrace kit como as instruções do fabricante, excepto utilizando apenas 1 ul de solução-mãe 5 mM por mL de células, em vez de 2 uL. Mantendo fora da luz directa, adicionar 18 uL de DMSO a fornecida pelo kit CellTrace para um frasco de CFSE para fazer uma solução estoque de 5 mM. Ressuspender o número necessário de células alvo (até um máximo de 1 x 10 ⁷⁾ em pré-aquecido PBS + 0,1% (w / v) de BSA para uma concentração final de 1 x 10 ⁶ células / ml. Adicionar 1 mL de 5 mM CFSE por mL de células e incubar em um banho de água 37 ° C durante 5 minutes. Adicionar 5 volumes de completa, gelada RPMI com FBS 10% para extinguir a coloração e incubar em gelo durante 5 minutos. Lave as células duas vezes mais com frio RPMI completo e ressuspender 1 x 10 células por ⁵ 100 uL de meio de ensaio de supressão.
4. Grânulos inspector Treg supressão são a uma concentração stock de 2 x 10 ⁷ grânulos / mL. Pellet um número de pérolas igual ao número total de células por experimento por centrifugação rápida em um tubo de Eppendorf. Lavar uma vez com RPMI grânulos e re-sedimento. Após a aspiração de RPMI, grânulos Ressuspenda de modo que a quantidade apropriada de grânulos por poço estão em 8 uL de meio de ensaio de supressão.
5. Para uma placa de fundo redondo bem 96 cultura de tecidos, adicionar CFSE coradas células (1 x 10 ⁵ células / mL), grânulos de inspector e células polarizadas e ordenadas (1 x 10 ⁵ células / mL) em meio de ensaio fresco de supressão de um alvo desejado (manchado CFSE): razão (ordenadas) efectora em um volume final de 200 uL. Todas as condições são definidas em tripliCates.
6. Preparar a primeira de duas condições de controlo por adição de 100 uL de células coradas CFSE, 8 uL de pérolas de inspector e 1 x 10 ⁵ de fresco, de células não coradas em 92 uL de meio de ensaio supressor por poço. Preparar o segundo controlo com os mesmos componentes celulares, como acima, mas sem Tregs grânulos inspector.
7. Cobrir a placa em folha de alumínio e incubar a 37 ° C / _5% de CO2 durante cinco dias.
8. No escuro, colete células de cada poço por pipetagem e coloque em um tubo de 5 mL de poliestireno de fundo redondo. Centrifugar células a 500 xg durante 5 minutos a 4 ° C, aspirado meios, e ressuspender em 300 ul de FACS frio tampão de lavagem a partir do passo 4. Analisar o primeiro 3 x 10 ⁴ CFSE ⁺ eventos ao vivo a partir do portão de linfócitos representando as células-alvo em um histograma com software da Quest Cell.

6. Os resultados representativos

Exemplo de pseudo de citometria de fluxo pontilham parcelas ao longo de um tempo de cinco dias-coudiferenciação iTreg rse monitorização com base na relação co-expressão de CD25 com FoxP3, CTLA-4 e CD45RA pode ser visto na Figura 2. O histograma na Figura 3 mostra um ensaio de supressão sucesso, em que ordenadas iTregs (CD25 ^Hi CD45RA ^- CD127 células ^-/LOW). São apenas o subconjunto de uma cultura de cinco dias, que adquiriu capacidade reguladora / supressor A Figura 4 mostra a indução de Tregs a partir de uma piscina ingénuo de células T (painéis superiores) e uma memória de pool de células T (painéis inferiores), após cinco dias de cultura em meio de iTreg padrão. CFSE coloração de células iniciais demonstram que tanto as células T naive (painel superior direito) ou memória (painel inferior direito) para diferenciar iTregs (mais FoxP3-células que expressam) somente após várias rodadas de divisão celular.

Figura 1. Esquemática do procedimento experimental. PBMCs are separados do sangue periférico humano através de centrifugação de gradiente de antes da seleção negativa magnética de células CD4 ⁺ CD25 ^- células T. Depois de cinco a seis dias em cultura, as células submetidas FACS e são co-incubados com heterólogos CFSE células alvo marcadas para medir a actividade supressora.

A Figura 2 humana purificada CD4 ⁺ primárias CD25 ^-. Células T são cultivadas em meio iTreg. Uma alíquota de células são recolhidas apenas depois do isolamento (dia 0) e nos dias 1, 3 e 5 de cultura de células para monitorizar o progresso de CD45RA, FoxP3, CTLA-4 e CD25 marcadores. O perfil corresponde a iTreg CD45RA ^-, FoxP3 ^{Hi, Hi} CTLA-4 e CD25 ^Hi (em destaque na janela de gráfico).

Figura 3. Purificada CD4 ⁺ CFSE lacélulas Beled (1 x 10 ⁵ / poço) são cultivadas com Tregs grânulos inspector de supressão, na presença de ordenados células de memória, ou ingénuo iTreg (3 x 10 ⁴ / poço). Após cinco dias, as células são colhidas e do perfil de CFSE das células coradas é analisada por citometria de fluxo. A presença de células iTreg completamente abolida a proliferação de células T CD4 ^+. Os números são indicativos de percentagem de células CFSE-rotulados que tenham sido submetidos a divisão.

Figura 4 purificada humana primária ingênuo. (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RA ⁺⁾ e memória (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RO ⁺⁾ células T são corados com CFSE e cultivadas em iTreg médio. Após cinco dias, as células são fenotipado e as taxas de divisão celular estimado. Como indicado na Figura 2, o subconjunto iTreg diferenciados a partir de ambos os subconjuntos corresponde àCD45RA ^- CD25 FoxP3 ^{Hi Hi} e CTLA-4 ^Hi (dois últimos não mostrado). Perfis de coloração comparativos CFSE identificar iTregs (aqui como mais elevados nas células que expressam Foxp3 T) como as células mais proliferativas durante a cultura de cinco dias.

Enquanto a transferência Treg promissora terapêutico no combate enorme rejeição do enxerto autoimunidade e outras desordens imunitárias ou inflamatórias mediadas, métodos para a sua geração eficiente e manutenção estável ainda não tenham sido desenvolvidos. Como apenas 1-5% de circulação de células T humanas são Tregs, a sua expansão controlada e diferenciação supera esta escassez como um impedimento principal da aplicação de Tregs na clínica. Por outro lado, como aprendemos com o julgamento TGN1412 ^13, que é científica e eticamente necessário entender profundamente os eventos moleculares que orquestram T humanas decisões celulares destino antes de implementar qualquer esquema terapêutico. Com este método de iTreg diferenciação, as populações resultantes de naive, memória, as células T efectoras e iTregs facilitar a expressão do gene ou comparações funcionais entre populações de células que derivam de um único dador de sangue periférico humano. Nas nossas mãos, as células foram classificadascomparados em microarray e qRT-PCR análises para medir mudanças genéticas, em borrões ocidentais para examinar os principais eventos de sinalização, ou em patch clamping funcionalmente medir o uso de canal iônico ^14.

O nosso sistema oferece a vantagem adicional de a capacidade de manipular os aspectos essenciais do processo de diferenciação em torno de um quadro central e de leitura. Assim, pode-se pré-classificação PBMCs de alterar a população de células ou de entrada incluem inibidores de moléculas pequenas e ligandos para o meio de cultura. Pode-se também transfectar células expressassem ou derrubar uma proteína de interesse ou introduzir um repórter construir. Como um benefício adicional, pode-se alterar as condições de cultura para maximizar a percentagem de iTregs gerados. Em geral, esta cultura de células T humanas primárias delineia uma plataforma muito robusta experimental com uma relevância fisiológica muito maior do que os que foram criados em sistemas de murinos. Importante, ele também pode manter um valor direto terapêutico. Com efeito, como most atuais Treg abordagens terapêuticas envolvem in vitro ou ex vivo desenvolvimento ou a manipulação de células, nosso sistema pode ser visto como um canal importante no caminho para a inclusão da terapia com células Treg no padrão de atendimento. Futuras expansões neste sistema adaptará Tregs para se tornar ativada após encontro com antígenos específicos in vivo inflamatória ao invés de a ativação policlonal descrito.