Génération de cellules T régulatrices induites de l'homme primaires cellules T naïves et mémoire

1. Isolement des cellules humaines mononucléaires du sang périphérique (CMSP) de couche leuco-plaquettaire

1. Acquérir une unité de couche leuco-plaquettaire de l'hôpital ou à proximité emplacement en centre-sang. Notre centre de transfusion nous donne environ 40-60 ml de buffy coat unitaire obtenu à partir de donneurs de sang normaux.
2. Verser le sang dans un autoclave 500 ml flacon en verre contenant du PBS stérile pour diluer couche leuco-plaquettaire. Le volume final de PBS manteau + buffy devrait être de 250 ml.
3. Remplissez dix 50 ml tubes coniques chacun avec une solution à 20 ml Lymphoprep.
4. Doucement superposer la solution Lymphoprep avec 25 ml de la couche leuco-plaquettaire après dilution, en faisant attention de ne pas perturber la solution Lymphoprep.
5. Spin tubes pendant 30 minutes à température ambiante à 500 x g. Assurez-vous d'éteindre de frein de la centrifugeuse, de sorte à ne pas perturber la fraction des lymphocytes.
6. Collecter les PBMC à l'interface entre l'Lymphoprep et les couches de plasma moyen d'une pipette. Aspirer le hors-moyen jusqu'à ce que le plasma d'environ 1 mlcouvre encore la couche leuco-plaquettaire contenant des PBMC. Utiliser une pipette 10 ml de transférer à une nouvelle PBMC tube de 50 ml.
7. Laver les cellules deux fois avec du PBS, puis remettre en suspension les cellules dans 50 ml de RPMI froid pour compter sur un hémocytomètre. De récupération typique est de 8 x 10 ⁸ - 1 x 10 ⁹ PBMC.

Cette procédure peut être revus à la baisse pour les petits volumes de sang. Dilution des échantillons de sang total est de 1:1 dans du PBS.

2. Magnétique de sélection négative des lymphocytes CD4 ⁺ Total des cellules T ^CD4 + ^CD45RA + cellules T naïves ou CD4 ⁺ CD45RO ⁺ mémoire des cellules T à partir de PBMC en utilisant Kits d'enrichissement EasySep (cellules souches Technologies)

Étapes à suivre pour 1 x 10 ⁸ à 4,25 x 10 ⁸ PBMC.

1. PBMC Resuspendre à une concentration finale de 5 x 10 ⁷ par ml dans du PBS contenant 2% de FBS et 1 mM EDTA. Déplacer les cellules à une nouvelle tube 14 ml en polypropylène à fond rond.
   Isolement du total des CD4 + ^humains des cellules T par sélection négative: ajouter CD4 + ^humains Cocktails T enrichissement de cellules d'anticorps (50 pi par ml de PBMC), mélanger et laisser incuber pendant 10 minutes à température ambiante.
   1. Isolement de l'homme des cellules T naïves par une sélection négative: ajouter 50 ul d'anticorps anti-CD45RO anticorps par ml de suspension cellulaire PBMC, mélanger et laisser incuber pendant 15 minutes à température ambiante. Ajouter cocktail d'enrichissement fourni avec le kit (50 uL de mL par des PBMC), mélanger et incuber à température ambiante pendant 10 minutes.
   2. Isolement de cellules T humaines de mémoire par une sélection négative: ajouter CD4 mémoire de l'homme ⁺ cocktail T enrichissement de cellules d'anticorps (50 pi par ml de PBMC), mélanger et laisser incuber pendant 10 minutes à température ambiante.
2. Mélanger bien à des particules magnétiques aussi les distribuer à travers la solution. Avez nanoparticules pas créer de tourbillon de la trousse naïve.
3. Ajouter les particules magnétiques (100 pi par ml de PBMC pour CD4 ⁺ totaux et naïve sélection de cellules T, 50 pi par ml de PBMC pour la sélection des cellules T mémoire). Mélanger doucement pipetage 2-3 fois et incuber à température ambiante pendant 10 minutes pour la sélection des cellules T naïves ou 5 minutes pour les CD4 mémoire ou totale ^{+ de} sélection des cellules T.
4. Ajouter PBS contenant 2% de FBS et 1 mM d'EDTA pour porter le volume à 10 ml par tube. Mélanger doucement pipetage 2-3 fois avant de placer le tube non plafonné en argent EasySep aimant pour les minutes 5, 10 ou 2,5 pour les CD4 ^{+ de} cellules T totales, les sous-ensembles naïves et mémoires, respectivement.
5. Avec tube encore en aimant EasySep, verser le liquide dans un nouveau tube de 50 ml d'isoler des cellules d'intérêt.
6. Répétez les étapes 2.5 et 2.6 pour une meilleure récupération.

3. Conditions de culture cellulaire pour induire les lymphocytes T régulateurs

1. La veille les étapes 1 et 2, les plaques manteau de culture de tissus en diluant d'abord anticorps anti-CD3 (OKT3 clone) à une concentration de 1 ug / ml dans du PBS stérile. Pour une plaque à 6 puits, ajouter 2 mL de PBS + anti-CD3 par puits, pour une plaque 12 puits, ajouter 1 ml ou pour une plaque de 24 puits, ajouter 500 ul par puits. Maintenir la plaque revêtue à 4 ° C jusqu'à utilisation.
2. Préparer le milieu de polarisation en ajoutant 10% inactivé par la chaleur du sérum fÅ“tal bovin (FBS), 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / mL de streptomycine et 50 uM β-mercaptoéthanol à RPMI-1640 pré-complété avec 2,06 mM Glutamax-I et 25 mM tampon HEPES. Ensuite, ajoutez 2 ng / ml de TGF-β et 5 ng / ml d'IL-2. Ici, on peut ajouter des ligands ou des inhibiteurs d'intérêt pour les médias. Remettre en suspension les cellules de l'étape 2 à une concentration de 2 x 10 ⁶ cellules / ml de milieu de polarisation.
3. Pré-chauffer les assiettes à 37 ° C et aspirer le PBS sur l'anti-CD3 puits revêtus avant d'ajouter les cellules. Ajouter 4 ml par puits de la suspension cellulaire pour une plaque à 6 puits, 2 ml de cellules pour une plaque 12 puits ou 1 ml de cellules pour une plaque de 24 puits. Remplir les puits vides avec du PBS pour réduire l'évaporation demultimédia. Incuber pendant 3 jours à 37 ° C / 5% de CO _2.
4. Le placage après 3 jours, ralentit la plaque dans une centrifugeuse pendant 5 minutes à 500 x g. Sans déranger les cellules T sur fond de la plaque, retirer la moitié des médias et les remplacer par des milieux frais. Par ailleurs, si le bien devient surpeuplée avec des cellules (concentration supérieure à 3 x 10 ⁶ / ml), diviser le volume aussi dans une autre plaque de revêtement anti-CD3 et d'ajouter du milieu frais de retour au volume d'origine. Incuber pendant deux à trois jours de plus à 37 ° C / 5% de CO _2.

4. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) de trois populations de cellules T

1. Préparer FACS tampon de lavage en ajoutant 0,5% (p / v) de sérum albumine bovine (BSA) et 2 mM d'EDTA à PBS stérile. Lieu de tampon à 4 ° C pour obtenir le froid.
2. Supprimer des cellules de culture de cellules bien et rincez chaque puits avec 2 ml de PBS pour assurer une récupération complète des cellules. Placez toutes les cellules dans 50 tubes en polypropylène mL et centrifuger à 500 xg pendant 10minutes à 4 ° C.
3. Compter les cellules sur un hémocytomètre pour déterminer la densité de cellules.
4. Lieu 3-5 x 10 ⁵ cellules par tube à quatre distinctes 5 mL tubes ronds en polystyrène de fond pour les contrôles de compensation. Placez les cellules restantes dans 50 des tubes en polypropylène mL, pas plus de 35 x 10 ⁶ cellules par tube.
5. Isoler les cellules pendant 5 minutes à 4 C des médias et aspirer °. Remettre en suspension les cellules à trier dans 90 pl de tampon de lavage à froid pour 1 x 10 ⁶ cellules. Remettre en suspension dans 100 pl de tampon de lavage à froid des tubes de commande de compensation.
6. Pour les cellules à trier, combiner 2 ul d'anticorps anti-CD25-PE, 3 ul d'anticorps anti-CD45RA-PE-Cy5 et 1 ul d'anticorps anti-CD127-APC pour 1 x 10 ⁶ cellules. Ajouter pas d'anticorps au tube de commande de compensation d'abord, 2 pi d'anticorps anti-CD25-PE au deuxième tube, 3 ul d'anticorps anti-CD45RA ^- PE-Cy5 au tube et1 pL troisième anti-CD127-APC du quatrième tube. Incuber tous les tubes sur la glace pendant 45 minutes dans le noir.
7. Aspirer les cellules tampons et resuspendre à une concentration de 1 x 10 ⁷ cellules par ml de tampon de lavage. Ajouter 1,5 ul de DNase II par ml de cellules avant de filtrer à travers un filtre 40 uM en nylon cellule. Déplacer des cellules à plusieurs tubes 5 ml fond rond en polypropylène avec pas plus de 3,5 ml par tube. Remettre en suspension les cellules de contrôle de compensation dans 300 ul de tampon de lavage.
8. Réglez la correction sur le cytomètre en flux pour minimiser la détection MoFlo croix par le PE, APC et PE-Cy5 filtres. Réglez portes pour trier iTregs (CD25 CD127 ^{Salut -/LOW} CD45RA ^- cellules), naïfs (CD25-CD45RA ⁺⁾ et de la mémoire (CD25 ^- CD45RA ^-) des cellules T dans 5 ml tubes ronds en polystyrène de fond contenant 1 ml de sérum de veau nouveau-né.

5. Essai répression

1. Assurez-supprles médias de dosage ESSION en ajoutant 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 5 ng / ml d'IL-2 et 2 ng / ml de TGF-β à l'AIM-V.
2. Le jour de l'essai, de purifier CD4 ^{+ de} cellules T hétérologues de couche leuco-plaquettaire, comme indiqué dans les étapes 1 et 2. Ceux-ci seront les cellules cibles pour le dosage de suppression et ne contient pas ^CD25 + Treg, comme on peut le voir sur la figure 2, Jour 0.
3. Cellules d'étiquettes avec CellTrace kit que par les instructions du fabricant, à l'exception en utilisant seulement 1 pl de solution à 5 mm Stock par ml de cellules au lieu de 2 pl. Garder hors de la lumière directe, ajouter 18 ul du DMSO fourni par le kit CellTrace à un flacon de CFSE pour obtenir une solution stock 5 mM. Remettre en suspension le nombre requis de cellules cibles (jusqu'à un maximum de 1 x 10 ⁷⁾ dans du PBS préchauffé + 0,1% (p / v) de BSA à une concentration finale de 1 x 10 ⁶ cellules / ml. Ajouter 1 ul de 5 mM CFSE par ml de cellules et incuber dans un bain à 37 ° C eau pendant 5 minutes. Ajouter 5 volumes de complet, RPMI glacée avec FBS 10% pour étancher la coloration et incuber sur de la glace pendant 5 minutes. Laver les cellules deux fois plus de froid RPMI complet et remettre en suspension 1 x 10 ⁵ cellules par 100 pl de médias de dosage de suppression.
4. Treg perles inspecteur d'extinction sont à une concentration stock de 2 x 10 ⁷ billes / mL. Pellet un certain nombre de billes égal au nombre total de cellules par l'expérience par centrifugation rapide dans un tube Eppendorf. Laver une fois avec du RPMI perles et re-pastille. Après aspiration de RPMI, Remettre les billes de telle sorte que la quantité appropriée de perles par puits sont à 8 pl des médias de dosage de suppression.
5. Dans une plaque de 96 puits de culture ronde en bas des tissus, ajouter CFSE cellules colorées (1 x 10 ⁵ cellules / ml), des perles de l'inspecteur et des cellules polarisées et triés (1 x 10 ⁵ cellules / mL) dans les médias frais d'analyse de suppression d'une cible souhaitée (teinté CFSE): effecteur (triés) rapport dans un volume final de 200 pl. Toutes les conditions sont définies en trois exemplairesCates.
6. Préparer la première des deux conditions de contrôle par l'ajout de 100 ul de cellules colorées CFSE, 8 pi de perles inspecteur et 1 x 10 ⁵ de frais, les cellules non colorées dans 92 uL milieu de dosage suppresseur par puits. Préparer le deuxième contrôle avec les mêmes composants cellulaires comme ci-dessus mais sans Treg perles inspecteur.
7. Couvrir la plaque de papier d'aluminium et incuber à 37 ° C / 5% de CO ₂ pendant cinq jours.
8. Dans l'obscurité, recueillir des cellules provenant de chaque puits par pipetage et le lieu dans un 5 ml de fond en polystyrène tube rond. Centrifuger les cellules à 500 xg pendant 5 minutes à 4 ° C, les médias aspirer, et remettre en suspension dans 300 ul du tampon de lavage à froid FACS de l'étape 4. Analyser le premier 3 x 10 ⁴ CFSE ⁺ les événements de la porte en direct des lymphocytes représentant cellules cibles dans un histogramme avec le logiciel Cell Quest.

6. Les résultats représentatifs

Exemple de pseudo-cytométrie de flux parsèment parcelles sur une durée de cinq jours de temps-course différenciation iTreg surveillance basée sur le rapport de co-expression de CD25 avec FoxP3, CTLA-4 et CD45RA peut être vu dans la figure 2. L'histogramme de la figure 3 montre un test de suppression de succès dans laquelle triés iTregs (CD25 ^Salut CD45RA ^- CD127 cellules ^-/LOW). Sont le sous-ensemble seulement d'une culture de cinq jours qui a acquis la capacité de réglementation / suppresseur de la figure 4 montre l'induction des Treg à partir d'un pool de cellules T naïves (panneaux supérieurs) et un pool de cellules T mémoire (panneaux inférieurs), après cinq jours de culture dans un milieu iTreg standard. Coloration des cellules CFSE initiales montrent que, soit des cellules T naïves (en haut à droite) ou de la mémoire (en bas à droite) se différencient en iTregs (plus FoxP3 cellules exprimant) seulement après plusieurs cycles de division cellulaire.

Figure 1. Schéma de la procédure expérimentale. PBMC are séparé du sang périphérique humain par centrifugation de gradient de sélection négative avant magnétique de cellules CD4 ⁺ CD25 ^- Les cellules T. Après cinq à six jours de culture, les cellules subissent FACS et sont co-incubées avec des cellules CFSE hétérologues cibles marquées pour mesurer l'activité suppresseur.

Figure 2 purifiés humains CD4 ⁺ CD25 primaires ^-. Cellules T sont cultivées dans iTreg moyenne. Un aliquot de cellules est prélevé juste après l'isolement (jour 0) et aux jours 1, 3 et 5 de la culture cellulaire pour suivre les progrès de CD45RA, FoxP3, CTLA-4 et des marqueurs CD25. Le profil correspond à iTreg CD45RA ^-, FoxP3 ^Salut, CTLA-4 et CD25 ^{Salut Salut} (mis en évidence dans la fenêtre en graphique).

Figure 3. Purifiée CD4 ⁺ CFSE lacellules Beled (1 x 10 ⁵ / puits) sont cultivées avec Treg perles inspecteur d'extinction dans la présence de cellules triées naïf, mémoire ou iTreg (3 x 10 ⁴ / puits). Après cinq jours, les cellules sont récoltées et le profil CFSE des cellules colorées est analysée par cytométrie de flux. La présence de cellules iTreg abolit complètement la prolifération des cellules T CD4 ^+. Les chiffres sont indicatifs du pourcentage de cellules CFSE-étiquetés qui ont subi la division.

Figure 4 humaine purifiée primaire naïf. (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RA ⁺⁾ et de la mémoire (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RO ⁺⁾ des cellules T sont colorées avec CFSE et cultivées dans iTreg moyennes. Après cinq jours, les cellules sont phénotypés et les taux de division cellulaire estimé. Comme indiqué dans la figure 2, le sous-ensemble iTreg différencier les deux sous-ensembles correspond àCD45RA ^- CD25 FoxP3 ^{Salut Salut} et CTLA-4 ^Salut (ces deux derniers non représenté). Comparatives profils de coloration CFSE identifier iTregs (ici en tant que plus les cellules exprimant T FoxP3) que les cellules les plus prolifératifs au cours de la culture de cinq jours.

Alors que le transfert de Treg détient d'énormes promesses thérapeutiques dans la lutte contre le rejet de greffe auto-immunité et d'autres troubles immunitaires ou inflammatoires à médiation, les méthodes pour leur production efficace et un maintien stable n'ont pas encore été développé. Comme seulement 1-5% des cellules T humaines circulant sont Tregs, leur expansion contrôlée et la différenciation de surmonter ce manque comme un obstacle majeur de la mise en œuvre des Tregs dans la clinique. D'autre part, comme nous avons appris de l'essai TGN1412 ^13, il est scientifiquement et éthiquement nécessaire de profondément comprendre les événements moléculaires qui orchestrent les décisions de l'homme sort de la cellule T avant la mise en œuvre toute thérapeutique. Avec cette méthode de iTreg différenciation, les populations issues de naïfs, la mémoire, les cellules T effectrices et iTregs faciliter l'expression des gènes ou des comparaisons fonctionnelles entre les populations de cellules qui en dérivent d'un seul donneur de sang périphérique humain. Dans nos mains, les cellules ont été triéspar rapport à biopuces et QRT-PCR analyses pour mesurer les changements génétiques, en Western blot pour examiner les principaux événements de signalisation, ou en patch-clamp à mesurer l'utilisation fonctionnelle des canaux ioniques ^14.

Notre système offre l'avantage supplémentaire de la capacité de manipuler les aspects clés du processus de différenciation autour d'un cadre central et la lecture. Ainsi, on peut pré-tri PBMC de modifier la population de cellules d'entrée ou comprennent des inhibiteurs de petites molécules et des ligands au milieu de culture. On peut également transfecter des cellules de surexprimer ou d'assommer une protéine d'intérêt ou d'introduire une construction rapporteur. Comme un avantage supplémentaire, nous pouvons modifier les conditions de la culture afin de maximiser le pourcentage de iTregs générés. Dans l'ensemble, cet être humain culture primaire de cellules T définit une plate-forme expérimentale très robuste avec une pertinence physiologique beaucoup plus grande que ceux créés dans les systèmes murins. Il est important, il peut aussi maintenir une valeur thérapeutique direct. En effet, comme most actuelles à base de Treg approches thérapeutiques impliquer dans le développement in vitro ou ex vivo ou manipulation de cellules, notre système peut être considéré comme un canal important sur ​​la route vers l'inclusion des Treg thérapie cellulaire dans la norme des soins. Expansions futures sur ce système adaptera Tregs de s'activer sur la rencontre avec des antigènes spécifiques in vivo inflammatoires plutôt que l'activation polyclonale décrit.