マイクロCTイメージングのための準備として、逆行性灌流およびマウスの冠動脈血管系の充填

1。出発前の準備

1. それぞれ、血管拡張バッファー（PBS中4mgの/ Lのパパベリン+ 1グラム/ Lアデノシン）、またはPBS中4％パラホルムアルデヒド（PFA）で圧力灌流装置の各側面を埋める。
2. 1:100ヘパリン（5000U/mlストック）の0.1ミリリットルでそれを充填し、上ベベルと〜120度の角度に針を曲げて1/2ccインスリンシリンジ（恒久的に接続されている29Gと½ "針）を準備が増加します。 0.3ミリリットル飽和KCl溶液で満たされた1 mlのシリンジ（26G½ "針付き）と同じです。

2。心臓を露出し、大動脈をcannulating

1. 選択した麻酔薬を使用して、マウスを麻酔。 （私たちは、ケタミン/キシラジン混合物の過剰使用：130 mg / kgのケタミンと生理食塩水の8.8 mg / kgのキシラジンのIP注射）を
2. アップ解剖トレイ、腹側に麻酔マウスをピン。正中切開で腹腔を開き、皮膚を撤回臓器を公開します。後部下大静脈（PVC）の領域を露出させる一方の側に腸に移動します。
3. PVCにヘパリン溶液を注入します。あなたが針を抽出するように、漏れを防止し、PVC壁の血栓やアザラシまで数秒のためにそれを保持するために綿棒で針の穴をカバーしています。マウスの循環を通して分散させるためにヘパリン2-3分待ちます。
4. あなたは心臓の鼓動を観察することができるように横隔膜と胸郭を解剖。徐々に心臓の逮捕まで、PVCのKCl溶液を注入します。
5. ダイアフラムの領域前方をそのまま残し、ダイヤフラムと消費税マウスの後部の下にあるすべての臓器を削除します。心臓への近位部は、後続のステップで見つけることは容易であるので、絞りの近くにPVCを切断するように注意して、ダイヤフラムを取り外します。
6. 大動脈の切り口を探します。大動脈の下に6から0編組絹縫合糸の1つの長い長さ数ミリメートルあちこち前方に置きメートル縫合糸は、バック自体に倍増されるようにカット終了。大動脈下縫合の2個があるので、半分にこの長い縫合糸をカットします。大動脈（図1A、B）の切断端に血管カテーテルを挿入し、代わりに血管カテーテルを保持し、漏れから大動脈内の任意の背圧を防止するために、ダブルノットで各縫合糸を結ぶ。

3。血流とMicrofil注入

1. 圧力灌流装置（図2）に血管カテーテルを接続し、100から110 mmHgの運転圧力に灌流装置をポンプで血管拡張バッファ（図1C）で血管を灌流を開始します。バッファは、液体を確実にすることによって、coronariesを通して灌流されていることを確認しダブルは、PVCから終了します。少なくとも3分間、またはPVCを出る流体がクリアされるまで灌流し続けています。 （灌流しながら次のステップに進みます。）
2. リブとピンバック（または削除）心臓を露出させる胸郭を解剖。一度公開され、CAである心はガーゼのバッファーに浸漬した部分から心臓にバッファの滴を絞って乾燥させないreful。大動脈弓を公開するために胸腺を離れてオフにします。流体がcoronariesを通してではなく、これらの大きい、低抵抗血管（図1Dの）を介して流用されていることを確認するために6から0まで編んだシルク糸を使用して、3つの主要な大動脈の枝を連結。
3. 15分間固定して心臓を灌流し、少なくとも2分間血管拡張バッファーですすぎます。一方、注射後の心臓（図1E）の外に漏れるのMicrofilを防ぐために両方の前部静脈Cavaeを連結。場所は、PVCと大動脈周囲の縫合糸が充填後まで締めないでください。
4. Microfilを準備します（試薬の表で指定された）と1 mlの注射器にロードします。カテーテル（Microfilシリンジに潅流チューブから切り替えたときに気泡の導入を防ぐために）をカバーするのに十分な水で解剖トレイを記入してください。血apを切断カテーテルからparatusと準備Microfilシリンジを接続します。
5. 冠状動脈の良好な充填が（図1F、3A）明らかになるまで、大動脈にMicrofilを注入：動脈は、最初に記入し、その後MicrofilはMicrofilの色を持つ組織のフラッシュのように毛細血管に "流出"します。それは小型船から出てくるように一回静脈側では、Microfilの疎水性の性質は、それが最初に独立した球体として表示されます。連続した列が静脈を一杯になるまでMicrofilを注入し続けています。 Microfilは、血管内の連続であるときに完全な充填が明らかとなり、それがPVCを介して終了します。
6. 充填が完了した後、すぐに以前の船舶のうちMicrofilを絞ってから、心臓組織の弾性の性質を防止するためにPVCと大動脈の周囲に配置された縫合糸を締めます。
7. （解剖トレイから水に浸した濡れたガーゼで心臓をカバーMicrofilが重合されるまで）は、乾燥し、それが室温で約1時間放置を防ぐことができます。そのような心の奥に満ち船舶の早期ビューを取得しようとして心を持ち上げたり、回転などの重合プロセスの間、心臓の任意の外部からの圧力を避ける。これはMicrofilで改行を引き起こし、心のより弾性領域にいくつかの血管からMicrofilを絞ることができます。
8. 心臓を取り出して、4℃で一晩4％PFAでそれをポスト修正℃にその後、4℃、70％エタノールに保存心臓血管系は現在、μCTイメージングのための準備ができています。

4。代表的な結果

効果的にMicrofilで灌流されている船舶は、船舶全体の連続的な、切れ目のないMicrofil（図3A）を持ちます。冠状血管の充填の程度は、目で判断することができる。静脈epicardially ¹⁸に配置され、簡単に（図3A、矢印）が観察できます。動脈、これは^、18以上の心筋が、心臓の表面（図3A、矢印）からも見ることができます。心臓組織は、毛細血管の非常に高い密度を有し、したがって、ときに毛細血管塗りとしてキャピラリーフィリングにも明らかである、心臓の組織がMicrofilの色（図3A、スター）でフラッシュします。このように、埋めるために失敗した血管網が原因Microfilの欠如（図3B、C）に顕著になります。

Microfilの疎水性の性質は、それ自体に収縮充填容器内の "改行"を引き起こすことになりますので、Microfilの不連続性（図3Bのアスタリスク）が頻繁に表示されます。血管内の圧力は、心臓から血管の出口点の適切な提携オフを通して維持されている場合、これらの "改行"は削減することができます。他の不連続性がmicrofil内の気泡によって発生することができます。灌流APからの切り替え時の空気の導入を防ぐために、血管カテーテルが完全に水に沈めていることを確認してください Microfilシリンジにparatus。気泡が導入されている場合は、それはしばしばバブルが冠状血管の通って押し出されたまでMicrofil灌流を続けることによって、単に削除することができます。

血管床の一部が（図3B、矢印）がブロックされている場合、血管のネットワークは完全に埋めることはできません。ヘパリンは血栓の形成を阻害しながら、時折閉塞はまだ手順を開始する、またはその他の未知の要因に起因する前に起因する不完全なヘパリン血流に発生する可能性があります。閉塞が発生した場合は、血管の塗りつぶしを完了するには、閉塞を外れないための方法は、我々の知る限り、ありません。少なすぎる圧力はMicrofilは、すべての血管床と毛細血管網（図3C）に強制されないので、充填時に使用されている場合、不完全な充填にも発生する可能性があります。逆に、あまりにも多くの圧力が毛細血管周囲の組織（図3D）にMicrofilバーストと浸出する可能性があります。

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図1。 Microfil灌流スキームの概要 。 （A）大動脈とPVCは、ダイアフラムの約レベルでカットされます。 （B）上行大動脈は、血管カテーテルでカニューレ挿入されています。 （D）大動脈弓からの3つの主要な枝が連結されている間（C）血管拡張バッファは、（図示せず）の圧力灌流装置によって駆動され、血管を通って灌流されています。両方の前部静脈のカヴァが連結されている間（E）4％PFAはcoronariesを通して灌流されています。それは塩化ビニル（PVC）から出るが観察されるまで、（F）注射器を使用して、Microfilはcoronariesを通して灌流されています。

図2。灌流装置2つの三角フラスコ、血管拡張バッファまたは4％PFAのどちらかで満たされた各々が、参加し、彼らのsidearmsに接続されたチューブを介して加圧されています。システムは、ポンプマニュアルを加圧されているバルブ、圧力計、圧力のモニタリングとメンテナンスを可能にするためにフラスコのいずれかに接続されています。小さなチューブはゴム栓を介して上下に各フラスコ内の流体に拡張します。圧力はこれらの小さなチューブより各フラスコからsidearmsポンプ流体から入力します。チューブは、一度に1つのフラスコから流れるように流体ができます活栓にマージします。

図3。 Microfilled心をサンプリングします 。 （A）も満たされる船舶は、（もしあれば）Microfilで改行をいくつか持っているし、心臓組織はいっぱい毛細血管（スター、およびCと比較して）によるMicrofilの帯びた色になります。両方の動脈（矢印 - 左前下行枝）と静脈（矢印 - 左冠状静脈）は心臓の表面を介して表示されます。 （B）microfilで休憩（アスタリスク）と同様に完全にマイクを防止するいくつかの血管の閉塞による心浸透をrofil。ブロックされた血管は血液が灌流プロセス中にフラッシュされていないとして、赤（矢印）のままです。 （C）不完全に満たされた血管と心臓。組織がMicrofilが毛細血管に浸透しなかったことを示す、Microfilの黄色の色で撮影していないことに注意してください。 （D）心のどこMicrofilが周囲の組織（矢​​印）に漏れることを引き起こして、充填中の毛細血管が破裂。

心臓組織は非常に高い代謝需要を持っているため、冠状血管系によって提供される血液から栄養と酸素の安定供給を必要とします。血管の狭窄や閉塞が原因で冠状動脈の機能を低下させる冠状血管の疾患は、組織低酸素および虚血につながると、心筋梗塞や心臓の筋肉への取り返しのつかない損傷の危険性が影響を受けた患者を置くことができます。これらの血管の病気の状態の理解が必要であり、冠状血管を勉強するために我々の能力に重要では脈管構造を視覚化したものです。ここでは、放射線不透過性材料で血管を充填することによってex vivoでのイメージングのためのマウス冠状血管系を調製するための方法を提示します。このプロトコルは、特に毛細血管を含むすべての冠状血管の完全充填し、その後可視化を確保するために設計されています。

すべての毛細血管の完全な充填、充填アジャンを確保するためにトン、Microfilは、血管のネットワーク内の小型化、高抵抗容器にMicrofilを強制的に部分的に閉じたシステムに注入する必要があります。 生体内充填システムで私たちの内にこの部分クロージャを作成するには、大動脈弓から分岐する3より大きい、低抵抗の動脈を結紮。これは他のすべての潜在的な "漏れ"のポイントを除外するものではありませんが、残りの船は（主に肋間動脈）それらを介して失われた任意の圧力は、冠動脈血管系の完全な充填を妨害しないことを十分に小さいものです。 Microfilは、心臓内のすべての血管を灌流した後、心臓や血管組織の生得的な弾性の性質は、いくつかの船のMicrofilを絞り出すます。 Microfilのこの損失を防ぐために、我々は、冠状血管が完全に灌流された後、すべての大規模かつアクセス可能な出口点、すなわち、両方上大cavae、後大静脈と大動脈を結紮。このように、圧力がmであるMicrofilがMicrofilは正常な生理的血圧の下に血管構造に適合することができ、重合するまで、心にaintained。

毛細血管の可視化が必要とされていない場合、あるいは、それが唯一の動脈または静脈の唯一の血管床を埋めることも可能です。 Microfilのより粘性のバージョンは、高粘度希釈剤を（フローテックから入手可能）を用いて混在させることができます。より粘性灌流液は、毛細血管に浸透することができず、静脈側から灌流した場合のみ、したがって動脈のみ、または静脈の可視化を可能にします。さらに、ここで紹介するプロトコルは、簡単に他の種または非成体マウスに適合させることができます。適切な動物のサイズに合わせて手順をスケーリングするには、単にカテーテル、灌流チューブ漏れを最小限にし、伸ばしたり、破壊しないようにするには、動物の大動脈への適切なサイズである必要があります。流体のボリューム（すなわち、ヘパリン注入飽和KCl、及びMicrofil）も適切にスケーリングする必要があります。

我々のプロトコルは、特にμCTによるMicrofilおよびイメージングの注入のために設計されました、しかし、それは容易にμCT解析、または他のex vivoでのイメージング技術のいずれについても、他の充填剤に適応することができます。他のイメージング法（例えば、アクリル）を介して血管を充填し、研究するために使用される多くの物質はラジオ不透明な物質を注入することができるようにμCT互換性のある充填材を探しているときに、放射線不透過性色素のいくつかのオプションは、鉛顔料⁹またはオスミウム溶液として、ある^3。かかわらず利用充填剤の、μCT画像は、結果が血管の測定と同様に埋め冠状血管^6,7,14,19の分岐パターンの構造に関する情報を提供するために3Dモデルに再構築することができるという利点を提供しています。さらに、μCTによるイメージングは​​、このように、追加を可能にし、周囲の組織を維持するスキャン後alyses。したがって、充填し、スキャンした心は組織学的分析のために処理することができ、様々なマーカーを染色した切片は、動脈/静脈のアイデンティティ、平滑筋のコートの存在、または追加の組織学的指標を相関させるためにμCTのデータを整列させることができる。

他の一般的な血管イメージング技術はまた、血管の充填を必要とする我々のプロトコルは、簡単にこれらの他の充填剤のいずれかでcoronariesを灌流するために適応させることができます。電子顕微鏡をスキャンする（SEM）の容器を充填し、腐食鋳造と呼ばれるプロセスで確立された血管のキャストから軟組織を溶解する必要があります。周囲の軟組織のサポートなしで血管の形状を維持するために、充填剤は、強力な非脆性である必要があります。頻繁にアクリル樹脂（例えばMercox、バトソンの^{）3,20,21。} SEMは、μCT画像²²のそれに非常に優れたスキャン解像度は、腐食のキャストを提供していますがここに示す操作手順は、追加の組織解析を防ぐために、組織を破壊します。冠状動脈血管系のex vivoでのイメージング、光学投影断層撮影法（OPT）、もう一つの方法は、アルカリホスファターゼによって生成された紫色の沈殿物などの沈殿可視または近可視光を検出するため、発色に加えて、蛍光シグナルの検出を可能にすることができますBCIP / NBTの変換（5 -ブロモ-4 -クロロ-3 -インドリルphosphate/4-nitroブルーテトラゾリウム^{）23から25。}血管の可視化は、従って、蛍光物質で充填することによってどちらかを達成することができます（例えばPU4ii：ポリウレタン樹脂^3、またはフルオレセインデキストラン^26を注入）、または蛍光またはいずれかを介してそのような全体のマウント免疫などの非充填の方法を通じて、組織化学的発色沈殿物（例えば、BCIP / ^NBT）23。 OPTイメージングは​​、μCT（約1ミクロンまで）のそれよりわずかに良い解像度を達成することができますが、充填およびimmunodeteの両方のctionメソッドは、周囲の軟部組織は、化学的に組織学的解析のポストスキ​​ャンのためのいくつかの抗原を混乱させる可能性がある、クリアしなければなりません。

イメージング血管充填または免疫を必要としない、とのようなin vivoで行うことができます冠状血管系には、いくつかの方法もあります。ひとつのテクニック、造影高分解能超音波（CEHRUS）は、造影剤としてガス充填マイクロバブルを利用しています。血流中にこれらのマイクロバブルの注入が停止して毛細管レベルにリアルタイム流量測定と血液の流れの可視化を可能にする、それが撮像された船舶^2,27-31の3Dビューを提供していません。もう一つの方法は、磁気共鳴血管造影（MRA）は、イメージ冠状血管^32-34、およびMRAにおける最近の進歩は、リアルタイム血流測定^35,36を得るために、そのイメージング機能を拡張したために使用されている。 MRAは、VEの3次元再構成を生成することができながら、ssels撮像され、MRAの解像度は現在約100ミクロンに制限されるため、小型船を（毛細血管、動脈と静脈）を識別するために失敗します。

CEHRUSとMRAの両方が生きている動物で実行できるので、繰り返しと非侵襲的モニタリングの血流と血管の開発の利点を提供します。しかし、MRAの比較的低い解像度とCEHRUSから3D機能の欠如は、全体として冠動脈ネットワークのイメージングを排除する。 in vivoでの技術の時間をかけて血管網の機能に関する貴重な情報（すなわち、フロー· ​​データ）を提供しつつ、血管の充填剤または免疫を必要とするex vivoでのイメージング技術は、冠動脈血管系の高分解能3次元情報を得るために重要です。 。エンドポイントとin vivoでの時間経過の分析に組み合わせてex vivoでのイメージングは、冠動脈血管系の研究のための強力なシステムを提供します。

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Disclosures: マイクロCTイメージングのための準備として、逆行性灌流およびマウスの冠動脈血管系の充填

Acknowledgements: マイクロCTイメージングのための準備として、逆行性灌流およびマウスの冠動脈血管系の充填

Materials: マイクロCTイメージングのための準備として、逆行性灌流およびマウスの冠動脈血管系の充填

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 ml syringes	BD Biosciences	BD-309602
1/2cc insulin syringes with permanently attached 29G ½’ needles	BD Biosciences	BD-309306
2" x 2" Gauze pads	Med101store.com	SKU 2208
24G ¾" Angiocath IV catheter	BD Biosciences	BD-381112
26G ½"gauge needles	BD Biosciences	BD-305111
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251	1g/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Papaverine)
Angled Graefe Forceps	Fine Science Tools	11052-10
Cotton-tipped applicators: 6" non-sterile	Cardinal Health	C15055-006
Curved Surgical Scissors	Fine Science Tools	14085-09
Dissecting stereoscope and light source	Nikon Instruments	NA	NA
Dissecting Tray, 11.5 x 7.5 inches	Cole-Parmer	YO-10915-12	Filled with tar for pinning down the mouse
Fine Curved Forceps	Aesculap	FD281R	Need two
Heparin, 5000 U/ml stock	APP Pharmaceuticals	NDC 63323-047-10	1:100 dilution in water
KCl	Fisher Scientific	P217	Saturated solution in H2O
Ketamin (Ketaset), 100 mg/ml stock	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Mixed as 130 mg/kg body weight, with Xylazine in 0.9% saline
Microfil	FlowTech	MV-122 (yellow). Other color options are also available.	Mix 1:1 by weight, with 10% by volume of curing agent. Prepare just before injection, and vortex to ensure it is well mixed
Non-sterile Suture: 6-0, braided silk	Harvard Apparatus	723287
Papaverine	American Regent Inc.	NDC 0517-4010-01	4mg/L in PBS for Vasodilation Buffer (with Adenosine)
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Prepared as 4% solution
Perfusion Apparatus			See figure 2
Spring Scissors	Fine Science Tools	15018-10
Xylazine (Anased), 20 mg/gl stock	Lloyd, Inc.	NADA #139-236	Mixed as 8.8 mg/kg body weight, with Ketamin in 0.9% saline

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