Количественные Визуализация Lineage конкретных Toll-подобный рецептор-опосредованной сигнализации в моноцитах и ​​дендритных клеток из малых образцов крови человека

1. Выделение и стимуляция иммунных клеток

1. Получить 10-50 мл гепаринизированной крови здоровых добровольцев после письменного информированного согласия в соответствии с руководящими принципами местного Экспертный совет организации. Для изучения старения и патогенезе заболевания, исключение и включение критериев для каждого добровольца или пациент должен быть явно определен.
2. Изолировать человека мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) с помощью СРТ труб или Ficoll-Paque Plus в соответствии с инструкциями производителя (GE Healthcare, Нью-Джерси) и проводить эксперименты в день изоляции ⁷ (реагенты, таблица 1).
3. Инкубируйте МНПК (3 х 10 ⁶ / трубка) в 1,5 мл труб в 0,6 мл среды в одиночку или стимулированных лигандами TLR или других агентов активации, например, TLR7 / 8 лигандов R848 (0,6 мл среды плюс 0,6 мкл 10 мМ TLR7 / 8 лиганда R848, конечной концентрации 10 мкМ) при 37 ° С в течение 10-60 мин (InvivoGen, Калифорния) ^9.

2. Лабораторияeling клеток

1. Этикетка линии клеток и других поверхностных маркеров в прямом суспензии клеток с использованием флуоресцентной конъюгированных антител. Этикетка 3 х 10 ⁶ МНПК в течение 20 мин при 4 ° С в 100 мкл PBS / 2% FBS в 1,5 мл Eppendorf трубки с коктейлем поверхности антител, специфичных для моноцитов и DC линий (табл. 2). Оптимальное разведения антител можно определить предварительные эксперименты и образцы должны быть обработаны в партии, чтобы свести к минимуму многие-к-много вариаций. Для поставщиков антитела запас 0,1 мг / мл использовать 5 мкл антител (1:20 разведение). Использование отдельной трубки клетки помечены только один цвет сопряженных создать люминесцентные каналы на инструменте.
2. После того, как поверхность маркировки, исправить клеток в 4% PFA / PBS в течение 10 мин при комнатной температуре. Для хранения до времени анализа, центрифуги клетки при 500 мкг и ресуспендирования клеток в замораживании буфера (90% FBS, содержащей 10% ДМСО) при -80 ° C до дня анализа.
3. Для оценки процесса о партияхе необработанной и стимулировать клетки от группы доноров вместе, чтобы минимизировать изменчивость. В день анализа, оттепель клетки быстро в 37 ° С водяной бане, центрифуги на 500x г удалить замораживанием буфера.
4. Для permeabilize клетки для обнаружения внутриклеточных цитокинов или других маркеров, Ресуспендируйте клеточные суспензии в 100 мкл BD Пермь / промывочного буфера (BD Biosciences, NJ). Этикетка для внутриклеточных сигнальных компонентов, например, 1:20 разведение кроликов анти-NF-kB (p65) антител (конечная концентрация 10 мкг / мл, Сантакрус биотехнологии, штат Калифорния) в течение 20 минут при комнатной температуре, центрифуги 500 мкг, аспирации и супернатант ресуспендирования клеток в 100 мкл Перми BD / Мойте буфер, содержащий 1:250 разведение коз анти-IgG кролика-Alexa647 (Invitrogen, CA) и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре.
5. Непосредственно перед изображениями, контрастирующая окраска ядер с DAPI (0,2 мкг / мл, Invitrogen, CA) или пропидия йодид (PI, 20 нг / мл, Invitrogen, Калифорния).

3. Анализ ImageStream

1. Проведение изображений на ImageStream на пакетные образцы уменьшить изменчивость между человеческими образцами. Инструмент настройки мощности лазеров были следующими: 200 мВт на 488 нм, 10 мВт на 658 нм и 250 мВт на длине волны 405 нм.
2. Для анализа файлов с данными (рис. 1), во-первых, ворота на события с нормальной интенсивностью PI и PI высокий аспект отношения (ширина: высота соотношение), чтобы отличить одно клеток (R1) от мусора (низкой интенсивности ИП) или многоклеточных событий ( высокая интенсивность PI и низким соотношением сторон). Моноциты находятся в ворота CD14-положительных клеток. Главгосслужбы Украины в пределах ворот для клеток, которые являются высокими для CD11c и низкими CD4 (R2), а также низкий Лин-1 маркеры (R3).
3. Используйте ИДЕИ ПО (Amnis, Вашингтон), чтобы обеспечить эффективный количественный показатель степени активации каждой ячейке. Определить сходства (или со-локализации) цитоплазматической фактора транскрипции NF-kB с ядерным красителем PI указать перемещение в ядро ​​(R4). Высокая корреляция NF-κB/PI локализациюзации находит свое отражение в высокой степенью сходства и указывает на степень активации ^10.
4. Сравните сходство отношений между различными группами лечения или групп пациентов, чтобы указать относительную эффективность функционирования клеток. Количественная данных между выборками по статистическое сравнение абсолютных значений или кратные различия. Используйте ИДЕИ ПО для просмотра изображений клеток из ключевых сегментов населения гистограмм (рис. 2).

4. Представитель Результаты

Мы количественно сигнальных путей в ответ на вирусную модель лигандов, стимулируя МНПК с TLR7 / 8 лиганда, R848 (рис. 1). Мы собрали и сотовых изображения локализации и демографической статистики в нашей выборке групп (рис. 2). ImageStream позволяет подмножества ворота клетки непосредственно из МНПК и ответы изображение клетки от закрытого, но несортированный клеточных популяций. Здесь мы количественно эффект TLR сignaling по ядерной локализации NF-kB (p65) в Lin1-, CD4 тусклый, CD11c + миелоидных ДК (Главгосслужбы Украины). В начале исследования мы наблюдали высокий процент стимулированных клеток с фактором транскрипции NF-kB (p65) в цитоплазме. После стимуляции, обработанные клетки имеют значительно более высокий балл сходства NF-B (p65) с ядерными пятно PI, о том, что NF-kB (p65) перемещаться в ядро после стимуляции (медиана оценки подобия 1.52 и 3.01, соответственно, на рис. 2). Аналогичные результаты были отмечены в TLR5-стимулированные моноциты ^9.

Рисунок 1. Окрашивание и Память Стратегии в количественном отношении воздействие на стимуляцию человека Главгосслужбы. NF-kB транскрипционный фактор регулирует экспрессию многочисленных генов иммунной системы. Данное исследование измеряет ядерной локализации NF-kB (p65) в Главгосслужбы одного из представителей тему после TLR7 / 8 Лиги ой стимуляции. В фокусе одной клетки были идентифицированы путем стробирования на PI позитивных событий с высоким ядерным пропорциями (R1). Главгосслужбы (Lin1-, CD4dim, CD11c +) были закрытого в R3. Ядерная локализации NF-kB (p65) построена в R4. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .

Рисунок 2. . Транслокация NF-kB в Главгосслужбы после стимуляции транслокации NF-kB (p65) в ядро после стимуляции (R4) изображен в популяциях необработанных и стимулировали Главгосслужбы, средняя оценка 1.52 сходство в необработанном образце и 3.01 в вынужденное образца (A). Цифровые изображения собраны одновременно с необработанной или R848-стимулированной клеточных популяций показывают, представитель клеток и интенсивность NF-B перемещаться в ядро ​​клетки (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить цифру.

Критические шаги в использовании ImageStream для поступательного исследования выбор соответствующих групп сравнения и оптимизации и проверки антител специфику. Различия между группами в теме помечены цель будет очевидным через гистограммы и клеточных изображений. В сочетании с тщательным анализом изменений в соответствующие рецепторы и сигнальные пути, эти данные будут предоставлять ценную информацию о механизмах, лежащих в основе иммунной регуляции в специализированных группах. Техника будет ограничено наличием специфических антител в достаточной близости для соответствующих целей. Кроме того, инструмент лучше всего подходит для многопользовательской установки и программного обеспечения для анализа требует некоторой осторожности освоить.

Эта технология является мощным средством для поступательного исследования человеческих заболеваний. Достижения в области секвенирования генома и массив технологии позволили определение вариантов замешан в млюбых заболеваний, но редко определить механизм действия назначенных ген. Наши исследования дают основой для поступательного исследования отдельных предметов, таких как ядерная к цитоплазматической отношение NF-kB после стимуляции. Из небольшой образец крови, мы можем определить дифференциальные обработки или сигнализации в линии определенным образом в собственных клеток пациента. Используя этот метод, мы количественно клеточных реакций в моноцитах большой когорте молодых и пожилых пациентов и продемонстрировал изменения в клеточной сигнализации в старении ^9. ImageStream может применяться более широко, чтобы выделить ключевые механизмы в клетках во многих работах, таких как терапия реагирования и не отвечающих, а также для индивидуального субъекта до и после лечения, или во время вспышки и ремиссии. При обильном модификаций возможность выбора тематических групп исследуемых типов клеток и клеточных механизмов для расследования, в будущем приложения ImageStream многочисленны и Shoulбы позволить значительных успехов во многих областях поступательно.