Imagem quantitativa da linhagem específica Toll-like receptor-mediados sinalização em monócitos e células dendríticas a partir de pequenas amostras de sangue humano

1. Isolamento e Estimulação de células imunes

1. Obter 10-50 ml de sangue heparinizado de voluntários saudáveis ​​após consentimento informado por escrito sob as diretrizes do Conselho de Revisão Institucional locais. Para estudos de envelhecimento ou a doença de exclusão, patogênese e os critérios de inclusão para cada voluntário ou paciente deve ser explicitamente determinada.
2. Isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), utilizando tubos de CPT ou Ficoll-Paque Plus acordo com as instruções do fabricante (GE Healthcare, NJ) e as experiências de conduta no dia do isolamento ⁷ (Reagentes, Tabela 1).
3. Incubar PBMCs (3 x 10 ⁶ / tubo) em tubos de 1,5 ml em 0,6 ml de meio por si só ou estimuladas com ligandos TLR ou outros agentes de activação, por exemplo, o ligando TLR7 / 8 R848 (0,6 ml de meio mais 0,6 uL de 10 mM TLR7 / 8 ligando R848 concentração final, 10 uM) a 37 ° C durante 10-60 min (InvivoGen, CA) ^9.

2. LabEling de Células

1. Linhagem celular rótulo e outros marcadores de superfície sobre a suspensão de células vivas utilizando anticorpos fluorescente-conjugados. Etiqueta 3 x 10 ⁶ PBMCs de 20 min a 4 ° C em 100 ul de PBS / 2% de FBS em um tubo Eppendorf de 1,5 ml com um cocktail de anticorpos específicos da superfície para linhagens de monócitos ou DC (Tabela 2). Diluições de anticorpos óptimo pode ser determinado em experiências preliminares e as amostras devem ser processado em lotes para minimizar de lote para lote-variação. Para o estoque fornecedor de anticorpo de 0,1 mg / ml utilizar 5 uL de anticorpo (diluição 1:20). Use um tubo separado de células marcadas com apenas um conjugado de cor única para definir os canais fluorescentes no instrumento.
2. Após a marcação de superfície, fixar as células em 4% PFA / PBS durante 10 min à TA. Para armazenamento até ao momento da análise, as células de centrifugação a 500 xg e Ressuspender as células em tampão de congelação (90% de FBS contendo DMSO a 10%) a -80 ° C até que o dia do ensaio.
3. Para avaliação, processo de lotes of células não tratadas e estimuladas a partir de um grupo de dadores em conjunto para minimizar a variabilidade. No dia da análise, as células descongelamento rapidamente em 37 ° C banho de água, de centrifugação a 500 xg para remover o tampão de congelação.
4. Para permeabilizar as células para a detecção de citocinas intracelulares ou outros marcadores, suspensões de células Ressuspenda em 100 uL de tampão BD Perm / Wash (BD Biosciences, NJ). Rótulo para intracelulares componentes de sinalização com, por exemplo, diluição 1:20 de coelho anti-NF-kB anticorpo (p65) (concentração final 10 ug / ml, Santacruz Biotechnology, CA) durante 20 min a RT, de centrifugação a 500 xg, o sobrenadante aspirado e Ressuspender as células em 100 uL Perm BD / Tampão de lavagem contendo 1:250 de diluição de cabra anti-IgG de coelho-Alexa647 (Invitrogen, CA) e incubar durante 20 min à TA.
5. Imediatamente antes de imagiologia, contracoloração núcleos com DAPI (0,2 ug / ml, Invitrogen, CA) ou iodeto de propídio (PI; 20 ng / ml, Invitrogen, CA).

3. Análise ImageStream

1. Conduzir imagem por ImageStream em amostras de lote para reduzir a variabilidade entre amostras humanas. As definições do aparelho para alimentação dos lasers eram como se segue: 200 mW para 488 nm, 10 mW para 658 nm e 250 mW para 405 nm.
2. Para analisar os arquivos de dados (Fig. 1), em primeiro lugar, portão em eventos com intensidade PI normal e alta relação de aspecto PI (largura: relação da altura) para distinguir células individuais (R1) de detritos (PI intensidade baixa) ou multi-celulares (eventos PI intensidade alta e baixa relação de aspecto). Os monócitos são dentro de um portão de células CD14 positivas. mDCs estão dentro de uma porta para as células que são altos para CD11c e de baixo para CD4 (R2) e também para baixo Lin-1 marcadores (R3).
3. Use IDEAS software (Amnis, WA) para fornecer uma medida eficaz quantitativa do grau de activação de cada célula. Determinar semelhança (ou co-localização) do factor de transcrição NF-kB citoplasmática com corante nuclear PI para indicar translocação para o núcleo (R4). A alta correlação de NF-κB/PI localização reflecte-se numa pontuação de semelhança elevado e indica o grau de activação ^10.
4. Comparar os índices de similaridade entre os grupos de tratamento diferentes ou populações de doentes para indicar a eficiência relativa funcional das células. Quantificar os dados entre as amostras através da comparação estatística dos valores absolutos ou diferenças de dobra. Use software IDEAS para exibir imagens de células a partir de segmentos de chaves de histogramas da população (Fig. 2).

4. Os resultados representativos

Temos quantificada vias de sinalização em resposta a um ligando modelo viral, estimulando PBMC com o ligando TLR7 / 8, R848 (Fig. 1). Foram coletadas duas imagens de localização celular e estatísticas populacionais em grupos de nossa amostra (Fig. 2). ImageStream nos permite subpopulações de células porta diretamente de PBMCs e respostas celulares de imagem de populações de células fechadas, mas não classificado. Aqui nós quantificamos o efeito de TLR signaling na localização nuclear do NF-kB (p65) em Lin1, CD4 dim, CD11c + mielóide DCs (mDCs). Na linha de base, observou-se uma percentagem elevada de células não estimuladas com o factor de transcrição NF-kB (p65) no citoplasma. Após a estimulação, as células tratadas têm uma pontuação de semelhança significativamente maior de NF-B (p65) com PI mancha nuclear, indicando que o NF-kB (p65) translocado para o núcleo, após a estimulação (pontuações de similaridade mediana são 1,52 e 3,01, respectivamente, a fig. 2). Resultados semelhantes são observados nas TLR5 monócitos estimulados ^9.

Figura 1. Coloração e Estratégia Gating para quantificar os efeitos da estimulação em mDCs humanos. O factor de transcrição NF-kB regula a expressão de numerosos genes do sistema imunológico. Este estudo mede a localização nuclear de NF-kB (p65) em mDCs de um sujeito representativo após TLR7 / 8 liga estimulação nd. Em foco células individuais foram identificados pela passagem no PI eventos positivos, com altas proporções nucleares (R1). mDCs (Lin1, CD4dim, CD11c +) foram fechado em R3. Localização nuclear do NF-kB (p65) é representada em R4. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. . Translocação de NF-kB em mDCs após a estimulação A translocação de NF-kB (p65) para dentro do núcleo após a estimulação (R4) é descrito em populações de mDCs não tratadas e estimuladas; a pontuação de semelhança mediana é 1,52 na amostra não tratada e 3,01 em a amostra estimulado (A). As imagens digitais colhidas simultaneamente das populações de células não tratadas ou R848-estimulado mostram as células representativas e da intensidade do NF-B translocado para o núcleo da célula (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura.

Os passos críticos no uso de ImageStream para estudos translacionais são a seleção de grupos de comparação relevantes e otimização e validação da especificidade do anticorpo. As diferenças entre os grupos de indivíduos no alvo marcada serão facilmente aparentes através de histogramas e imagens de células. Em combinação com uma análise aprofundada das alterações nos receptores e vias de sinalização relevantes, estes dados fornecerá informações valiosas sobre os mecanismos que estão subjacentes alteração no sistema imunológico em grupos especializados. A técnica será limitada pela disponibilidade de anticorpos específicos de afinidade suficiente para alvos relevantes. Além disso, o instrumento é mais adequado para uma instalação de multi-utilizador e do software de análise requer algum cuidado para dominar.

Esta tecnologia é uma poderosa técnica para investigação de translação de doenças humanas. Os avanços na sequenciação do genoma e tecnologia de matriz permitiram a identificação de variantes implicado em mtodas as doenças, mas raramente identificam o mecanismo de ação do gene indicado. Nossos estudos fornecem um modelo para investigações de translação em sujeitos individuais, como a nuclear a relação citoplasmática de NF-kB após a estimulação. De uma pequena amostra de sangue, pode-se identificar diferencial de processamento ou de sinalização de um modo específico em linhagem próprias células de um sujeito. Usando este método, temos quantificado respostas celulares em monócitos de um grande grupo de jovens e idosos e mostraram alterações na sinalização celular no envelhecimento ^9. ImageStream pode ser aplicado de forma mais ampla para destacar os principais mecanismos de células em muitas investigações, tais como terapia respondedores e não respondedores, ou para um sujeito individual, antes e após o tratamento, ou durante o surto e remissão. Com modificações abundantes possíveis para escolha de grupos de indivíduos em estudo, tipos de células, e os mecanismos celulares para investigar, as futuras aplicações de ImageStream são numerosos e should permitir avanços significativos em muitas áreas de translação.