Kvantitativ afbildning af Lineage-specifikke Toll-lignende receptor-medieret signalering i monocytter og dendritiske celler fra små prøver af humant blod

1. Isolering og stimulering af immunceller

1. Opnå 10-50 ml hepariniseret blod fra raske frivillige efter skriftligt informeret samtykke i henhold til retningslinjerne i den lokale Institutional Review Board. For undersøgelser af aldring eller sygdom patogenese, eksklusion og inklusion kriterier for hver enkelt frivillig eller patienten skal udtrykkeligt bestemmes.
2. Isolere humane perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) under anvendelse af CPT rør eller Ficoll-Paque Plus ifølge producentens instruktioner (GE Healthcare, NJ) og udføre eksperimenter på dagen for isolation ⁷ (reagenser, tabel 1).
3. Inkuber PBMC'er (3 x 10 ⁶ / rør) i 1,5 ml rør i 0,6 ml medium alene eller stimuleret med TLR ligander eller andre aktiverende midler, fx TLR7 / 8 ligand R848 (0,6 ml medium plus 0,6 ul 10 mM TLR7 / 8 ligand R848, slutkoncentration 10 uM) ved 37 ° C i 10-60 min (InvivoGen, CA) ^9.

2. Labeling af celler

1. Label celleafstamning og andre overflademarkører på levende cellesuspensioner ved hjælp af fluorescens-konjugerede antistoffer. Etiketten 3 x 10 ⁶ PBMC'er i 20 minutter ved 4 ° C i 100 ul PBS / 2% FBS i en 1,5 ml Eppendorf-rør med en cocktail af overflade antistoffer specifikke for monocyt eller DC slægter (tabel 2). Optimale antistof fortyndinger kan bestemmes i indledende eksperimenter, og prøver skal behandles i portioner for at minimere parti-til-parti variation. For sælgeren antistof lager af 0,1 mg / ml anvende 5 ul af antistof (1:20 fortynding). Anvende en separat rør af celler mærket med kun en enkelt farve konjugat til at etablere de fluorescerende kanaler på instrumentet.
2. Efter overflade mærkning rette celler i 4% PFA / PBS i 10 minutter ved stuetemperatur. Til opbevaring, indtil tidspunktet for analyse. Centrifuge celler ved 500 x g og resuspender cellerne i frysning puffer (90% FBS indeholdende 10% DMSO) ved -80 ° C indtil dagen for assayet
3. For at kunne vurdere, proces partier of ubehandlede og stimulerede celler fra en gruppe af donorer sammen for at minimere variabilitet. På dagen for analysen optønings-celler hurtigt ved 37 ° C vandbad, centrifugeres ved 500x g for at fjerne frysning buffer.
4. At permeabilisere celler til påvisning af intracellulære cytokiner eller andre markører, resuspender cellesuspensioner i 100 ul BD Perm / vaskebuffer (BD Biosciences, NJ). Etiket for intracellulære signalsystemer komponenter med f.eks 1:20 fortynding af kanin-anti-NF-KB (p65)-antistof (slutkoncentration 10 mg / ml, SantaCruz Biotechnology, CA) i 20 minutter ved stuetemperatur, centrifugeres ved 500 xg, aspirat supernatant og Resuspender celler i 100 pi BD Perm / vaskepuffer indeholdende 1:250 fortynding af gede-anti-kanin-IgG-Alexa647 (Invitrogen, CA) og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur.
5. Umiddelbart forud for billeddannelse, kontrastfarve kerner med DAPI (0,2 ug / ml, Invitrogen, CA) eller propidiumiodid (PI; 20 ng / ml, Invitrogen, CA).

3. ImageStream Analyse

1. Gennemføre imaging af ImageStream på gruppevise prøver at mindske variationen mellem humane prøver. Instrumentindstillinger for effekt af lasere var som følger: 200 mW til 488 nm, 10 MW til 658 nm og 250 MW til 405 nm.
2. For at analysere datafiler (fig. 1), første, skydeventiler om begivenheder med normal PI intensitet og høj PI formatforhold (bredde: højde forhold) til at skelne enkelte celler (R1) fra affald (lav PI intensitet) eller multi-cellulære hændelser ( høj PI intensitet og lav aspect ratio). Monocytter er i en port for CD14-positive celler. mDCs er inden for en port for celler, der er høj for CD11c og lav for CD4 (R2), og ligeledes lav for Lin-1-markører (R3).
3. Benytte ideer software (Amnis, WA) til tilvejebringelse af en effektiv kvantitativ måling af graden af ​​aktivering af hver celle. Bestemme ligheden (eller co-lokalisering) af den cytoplasmiske transskriptionsfaktoren NF-KB med nuklear farvestof PI at indikere translokation ind i nucleus (R4). En høj korrelation på NF-κB/PI localisering afspejles i en høj lighedsscore og viser graden af aktivering ^10.
4. Sammenligne ligheden forholdet mellem de forskellige behandlingsgrupper og patientpopulationer at indikere relative funktionelle effektivitet af cellerne. Kvantificere data mellem prøver gennem statistisk sammenligning af absolutte værdier eller fold forskelle. Benytte ideer software til at vise billeder af celler fra centrale dele af befolkningen histogrammer (fig. 2).

4. Repræsentative resultater

Vi har kvantificeret signaleringsveje som reaktion på en model viral ligand ved at stimulere PBMC med TLR7 / 8 ligand, R848 (fig. 1). Vi indsamlede både cellulære lokalisering billeder og befolkningsstatistikker i vores prøvegrupperne (fig. 2). ImageStream giver os mulighed for at gate celledelmængder direkte fra PBMC'er og image celle responser fra gated, men usorteret cellepopulationer. Her har vi kvantificeret effekten af ​​TLR signaling om nuklear lokalisering af NF-KB (p65) i Lin1-, CD4 dim, CD11 c + myeloid udviklingslandene (mDCs). Ved baseline observerede vi en høj procentdel af ikke-stimulerede celler med transskriptionsfaktoren NF-KB (p65) i cytoplasmaet. Efter stimulering, har behandlede celler en markant højere lighedsscore af NF-B (p65) med nuklear farvning PI, hvilket indikerer, at NF-KB (p65) translokeres ind i kernen efter stimulering (median lighedsscorer er 1,52 og 3,01, henholdsvis fig. 2). Lignende resultater er angivet i TLR5-stimulerede monocytter ^9.

Figur 1. Farvning og Indløbs strategi at kvantificere effekten af stimulation på humane mDCs. NF-KB transkriptionsfaktor regulerer ekspressionen af ​​mange immunsystemet gener. Denne undersøgelse måler kernelokalisering af NF-KB (p65) i mDCs fra et repræsentativt individ efter TLR7 / 8 liga nd stimulering. In-fokus enkelte celler blev identificeret ved gating på PI positive begivenheder med høje nukleare sideforhold (R1). mDCs (Lin1-, CD4dim, CD11c +) blev gated i R3. Nuklear lokalisering af NF-KB (p65) er plottet i R4. Klik her for at se større figur .

Figur 2. . Translokation af NF-KB i mDCs efter stimulering af translokation af NF-KB (p65) i kernen efter stimulering (R4) er afbildet i populationer af ubehandlede og stimuleret mDCs, median lighedsscore er 1,52 i den ubehandlede prøve og 3,01 i den stimulerede prøve (A). Digitale billeder indsamles samtidig med de ubehandlede eller R848-stimuleret cellepopulationer viser repræsentative celler og intensiteten af ​​NF-B translokeret i cellekernen (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.

De kritiske trin i brug af ImageStream for translationelle undersøgelser er udvælgelsen af ​​relevante sammenligningsgrupper og optimering og validering af antistof specificitet. Forskelle mellem emnegrupper i det mærkede mål vil være indlysende ved histogrammer og celle billeder. I kombination med en grundig analyse af ændringer i de relevante receptorer og signalveje, vil disse data give værdifuld indsigt i mekanismer, der ligger til grund for forstyrrelse i immunsystemet i specialiserede grupper. Teknikken vil være begrænset af tilgængeligheden af ​​specifikke antistoffer med tilstrækkelig affinitet til de relevante mål. Desuden er det instrument, mest egnet til en flerbruger-anlæg og analyse softwaren kræver en vis forsigtighed for at mestre.

Denne teknologi er en kraftfuld teknik til translationelle undersøgelser af humane sygdomme. Fremskridt inden for genomsekvensering og array teknologi har tilladt identifikation af varianter impliceret i meventuelle sygdomme, men sjældent identificere virkningsmekanisme af de nominerede genet. Vores undersøgelser giver et oplæg til translationelle undersøgelser i enkelte fag som det nukleare til cytoplasma forholdet mellem NF-xB efter stimulering. Fra en lille blodprøve, kan vi identificere forskellen behandling eller signalering på en afstamning bestemt måde i et individs egne celler. Ved hjælp af denne metode, har vi kvantificeret cellulære reaktioner i monocytter af en stor kohorte af unge og ældre patienter og påvist ændringer i celle signalering i aldring ^9. ImageStream kan anvendes mere bredt for at fremhæve de vigtigste mekanismer i celler i mange undersøgelser såsom terapi responders og non-respondenter, eller for et enkelt emne før og efter behandlingen, eller under opblussen og bedring. Med rigelige modifikationer mulige for valg af faggrupper under undersøgelsen, celletyper og cellulære mekanismer til at undersøge, er de fremtidige anvendelser af ImageStream talrige og skuldred tillader betydelige fremskridt på mange translationelle områder.