Kvantitativ avbildning av Lineage-specifika Toll-like receptor-medierad signalering i monocyter och dendritiska celler från små Prover av blod

1. Isolering och Stimulering av immunceller

1. Skaffa 10-50 ml hepariniserat blod från friska frivilliga efter skriftligt informerat samtycke enligt riktlinjerna i den lokala institutionella Review Board. För studier av åldrande eller sjukdom patogenes, utslagning och inklusionskriterier för varje volontär eller patienten måste uttryckligen fastställas.
2. Isolera humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) med CPT rör eller Ficoll-Paque Plus enligt tillverkarens instruktioner (GE Healthcare, NJ) och experiment uppträdande på dagen av isoleringen ⁷ (reagens, tabell 1).
3. Inkubera PBMC (3 x 10 ⁶ / rör) i 1,5 ml rör i 0,6 ml medium enbart eller stimulerades med TLR ligander eller andra medel aktiverande, t.ex. TLR7 / 8 liganden R848 (0,6 ml medium plus 0,6 | il av 10 mM TLR7 / 8 liganden R848, slutkoncentration 10 pM) vid 37 ° C under 10-60 min (InvivoGen, CA) ^9.

2. LabEling av celler

1. Etikett cellsläktträd och andra markörer yta på levande cellsuspensioner med fluorescerande konjugerade antikroppar. Etiketten 3 x 10 ⁶ PBMC under 20 min vid 4 ° C i 100 | il PBS / 2% FBS i en 1,5 ml Eppendorf-rör med en cocktail av ytan antikroppar specifika för monocyt-eller DC-cellinjer (tabell 2). Optimala antikroppsutspädningar kan bestämmas i preliminära experiment och prover skall behandlas i satser för att minimera parti till parti variationen. För säljare antikropp lager av 0,1 mg / ml använd 5 pl antikropp (1:20 spädning). Använda en separat rör av celler märkta med endast en enda färg-konjugat för att ställa upp de fluorescerande kanaler på instrumentet.
2. Efter yta märkning, fixera cellerna i 4% PFA / PBS under 10 min vid rumstemperatur. För lagring tills tiden för analys centrifugrör celler vid 500 x g och återsuspendera celler i spärrande buffert (90% FBS innehållande 10% DMSO) vid -80 ° C tills dagen för analysen.
3. För bedömning, process partier of obehandlade och stimulerade celler från en grupp av givare tillsammans för att minimera variabiliteten. På dagen för analysen, tö cellerna snabbt i 37 ° C vattenbad, centrifugera vid 500x g för att avlägsna frysning buffert.
4. Att permeabilisera cellerna för detektering av intracellulära cytokiner eller andra markörer, återsuspendera cellsuspensioner i 100 | il BD Perm / tvättbuffert (BD Biosciences, NJ). Etiketten för intracellulära signalerande komponenter med t.ex. 1:20 spädning av kanin-anti-NF-kB (p65)-antikropp (slutlig koncentration 10 | ig / ml, SantaCruz Biotechnology, CA) under 20 min vid RT, centrifugera vid 500 x g, aspirat supernatanten och Återsuspendera cellerna i 100 | il BD Perm / tvättbuffert innehållande 1:250 utspädning av get-anti-kanin-IgG-Alexa647 (Invitrogen, CA) och inkubera under 20 min vid rumstemperatur.
5. Omedelbart före bildframställning, Motfärga kärnor med DAPI (0,2 | ig / ml, Invitrogen, CA) eller propidiumjodid (PI; 20 ng / ml, Invitrogen, CA).

3. ImageStream Analys

1. Genomföra avbildning av ImageStream på satsvis prover för att minska variabilitet mellan prover från människa. Instrument inställningar för makt lasrar var följande: 200 mW för 488 nm, 10 mW för 658 nm och 250 MW för 405 nm.
2. För att analysera datafiler (Fig. 1) för det första gate på händelser med normal PI intensitet och högt PI bildförhållande (bredd: höjd-förhållande) för att skilja enstaka celler (R1) från skräp (låg PI intensitet) eller flera cellulära händelser ( höga PI intensitet och låg aspect ratio). Monocyter ligger inom en grind för CD14 positiva celler. mDCs ligger inom en grind för celler som är höga för CD11c och låg för CD4 (R2) och även låg för Lin-1 markörer (R3).
3. Använda IDÉER mjukvara (Amnis, WA) för att ge en effektiv kvantitativt mått på graden av aktivering av varje cell. Bestämma likhet (eller sam-lokalisering) av den cytoplasmatiska transkriptionsfaktor NF-kB med nukleär färg PI för att indikera translokation in i kärnan (R4). En hög grad av korrelation av NF-κB/PI localisering återspeglas i en hög likhet poäng och anger graden av aktivering ^10.
4. Jämföra likheten förhållanden mellan olika behandlingsgrupper eller patientpopulationer för att indikera relativa funktionell effektivitet av cellerna. Kvantifiera data mellan prov genom statistisk jämförelse av absoluta värden eller lägga skillnader. Använd IDÉER programvara för att visa bilder av celler från viktiga delar av befolkningen histogram (Fig. 2).

4. Representativa resultat

Vi har kvantifierats signalvägar som svar på en modell viralt ligand genom att stimulera PBMC med TLR7 / 8-ligand, R848 (fig. 1). Vi samlade både cellulära lokalisering bilder och statistik befolkningen i vårt urval grupper (Fig. 2). ImageStream ger oss möjlighet att gate cellundergrupper direkt från PBMC och bild svar cell från gated, men osorterat cellpopulationer. Här har vi kvantifierat effekten av TLR signaling på nukleär lokalisering av NF-kB (p65) i Lin1-, CD4-dim, CD11c + myeloid DCS (mDCs). Vid baslinjen, observerade vi en hög procentandel av ostimulerade celler med transkriptionsfaktor NF-kB (p65) i cytoplasman. Efter stimulering, behandlade celler har en signifikant högre similaritetspoäng av NF-B (p65) med nukleär färgning PI, vilket indikerar att NF-kB (p65) translokeras till kärnan efter stimulering (median likhetsvärden poäng är 1,52 och 3,01, respektive, fig.. 2). Liknande resultat observeras i TLR5 stimulerade monocyter ^9.

Figur 1. Färgning och gating strategi för att kvantifiera effekterna av stimulering på mänskliga mDCs. NF-kB transkriptionsfaktor reglerar expression av ett flertal immunsystemet gener. Denna studie mäter den nukleära lokaliseringen av NF-kB (p65) i mDCs från en representativ patient efter TLR7 / 8 liga ND stimulering. I fokus enstaka celler identifierades genom gating PI positiva händelser med höga nukleära bildformat (R1). mDCs (Lin1-, CD4dim, CD11c +) var gated i R3. Nuclear lokalisering av NF-kB (p65) plottas i R4. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. . Translokation av NF-kB i mDCs efter stimulering Den translokation av NF-kB (p65) in i kärnan efter stimulering (R4) är avbildad i populationer av obehandlade och stimulerades mDCs; medianen similaritetspoäng är 1,52 i det obehandlade provet och 3,01 i det stimulerade provet (A). Digitala bilder in samtidigt av de obehandlade eller R848-stimulerad cellpopulationer visar representativa celler och intensiteten av NF-B translokeras till cellkärnan (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

De kritiska steg i användningen av ImageStream för translationella studier är valet av relevanta jämförelsegrupper och optimering och validering av antikropp specificitet. Skillnaderna mellan ämnet grupper i det märkta målet kommer att vara uppenbara genom histogram och bilder cell. I kombination med en noggrann analys av förändringar i relevanta receptorer och signalvägar, kommer dessa data ger värdefull insikt i mekanismerna som ligger bakom immun dysreglering i specialiserade kohorter. Tekniken kommer att begränsas av tillgängligheten av specifika antikroppar i tillräcklig affinitet för relevanta mål. Dessutom är det instrument lämpar sig bäst för en flera användare anläggningen och analysprogram kräver viss omsorg för att bemästra.

Denna teknik är en kraftfull teknik för translationella undersökningar av mänskliga sjukdomar. Framsteg inom genomet sekvensering och array teknik har möjliggjort identifiering av varianter inblandad i meteralla sjukdomar, men sällan identifierar verkningsmekanismen för den utsedda genen. Våra studier ger en modell för translationella undersökningar i enskilda ämnen, såsom nukleär cytoplasma förhållande NF-kB efter stimulering. Från ett litet urval av blod, kan vi identifiera differential bearbetning eller signalering i en släktlinje specifikt sätt i ett ämne egna celler. Med denna metod har vi kvantifierat cellulära svar i monocyter av en stor kohort av unga och äldre patienter och visat förändringar i cell signalering i åldrande ^9. ImageStream kan tillämpas mer allmänt att belysa viktiga mekanismer i cellerna i många undersökningar, såsom terapi responders och icke-responders, eller för en enskild patient före och efter behandling, eller under slöjor och remission. Med rikliga modifieringar som möjligt för val av ämnesgrupper enligt studien, celltyper och cellulära mekanismer för att undersöka de framtida tillämpningar av ImageStream är många och should kan betydande framsteg i många translationella områden.