Kvantitativ Imaging av Lineage-spesifikke Toll-like receptor-mediert signalering i monocytter og dendrittiske celler fra små prøver av Human Blood

1. Isolering og stimulering av immunceller

1. Skaff 10-50 ml heparinisert blod fra friske frivillige etter skriftlig informert samtykke i henhold til retningslinjene i den lokale Institutional Review Board. For studier av aldring eller sykdom patogenese, utestenging og inklusjonskriteriene for hver frivillig eller pasient må eksplisitt bestemt.
2. Isoler humane perifere mononukleære blodceller (PBMCs) med CPT-rør eller Ficoll-Paque Plus i henhold til produsentens instruksjoner (GE Healthcare, NJ) og utføre eksperimenter på den dagen isolasjon ⁷ (reagenser, tabell 1).
3. Inkuber PBMCs (3 x 10 ⁶ / tube) i 1,5 ml rør i 0,6 ml medium alene eller stimulert med TLR ligander eller andre aktiverende midler, f.eks den TLR7 / 8 ligand R848 (0,6 ml medium pluss 0,6 mL av 10 mM TLR7 / 8 ligand R848, endelig konsentrasjon 10 mm) ved 37 ° C for 10-60 min (InvivoGen, CA) ^9.

2. LabEling av celler

1. Etikett celle avstamning og andre overflate markører på live cellesuspensjoner hjelp fluorescently-konjugerte antistoffer. Label 3 x 10 ⁶ PBMCs i 20 min ved 4 ° C i 100 mL PBS / 2% FBS i et 1,5 ml Eppendorf rør med en cocktail av overflaten antistoffer spesifikke for monocytter eller DC linjene (tabell 2). Optimale antistoff fortynninger kan bestemmes i gangsetting og prøver skal behandles i bunker for å minimere lot til lot variasjon. For leverandøren antistoff lager på 0,1 mg / ml bruke 5 mL av antistoff (1:20 fortynning). Bruk en egen tube av celler merket med bare én farge konjugat for å sette opp de fluoriserende kanaler på instrumentet.
2. Etter overflate merking, fikse celler i 4% PFA / PBS for 10 min ved RT. For lagring inntil tidspunktet for analyse, sentrifuger cellene ved 500 xg og Resuspender celler i frysing buffer (90% FBS inneholder 10% DMSO) ved -80 ° C til den dagen analysen.
3. For vurdering, prosess batcher of ubehandlet og stimulert celler fra en gruppe givere sammen for å redusere variabiliteten. På dagen for analysen, tine cellene raskt i 37 ° C vannbad, sentrifuger ved 500x g å fjerne frysing buffer.
4. For å permeabilize celler for påvisning av intracellulære cytokiner eller andre markører, Resuspender cellesuspensjoner i 100 mL BD Perm / vaskebuffer (BD Biosciences, NJ). Etikett for intracellulære signalmolekyler komponenter med f.eks, 1:20 fortynning av kanin anti-NF-κB (p65) antistoff (endelig konsentrasjon 10 mg / ml, Santacruz Bioteknologi, CA) for 20 min ved RT, sentrifuger ved 500 xg, aspirer supernatanten og Resuspender celler i 100 mL BD Perm / Vaskebuffer inneholder 1:250 fortynning av geit anti-kanin IgG-Alexa647 (Invitrogen, CA) og inkuberes i 20 min ved RT.
5. Umiddelbart før bildebehandling, counterstain atomkjerner med DAPI (0,2 mikrogram / ml, Invitrogen, CA) eller propidium jodid (PI, 20 ng / ml, Invitrogen, CA).

3. ImageStream Analyse

1. Gjennomføre imaging ved ImageStream på grupperte prøver å redusere variasjonen mellom humane prøver. Instrument innstillinger for strøm av lasere var som følger: 200 mW for 488 nm, 10 MW for 658 nm og 250 MW for 405 nm.
2. Å analysere data filer (Fig. 1), første, gate på hendelser med normal PI intensitet og høy PI størrelsesforhold (bredde: høyde-forhold) for å skille enkeltceller (R1) fra rusk (lav PI intensitet) eller flercellede hendelser ( høy PI intensitet og lav sideforhold). Monocytter er innenfor en gate for CD14 positive celler. mDCs er innenfor en gate for celler som er høy for CD11c og lavt etter CD4 (R2) og også lav for Lin-1 markører (R3).
3. Bruk IDEAS programvare (Amnis, WA) for å gi en effektiv kvantitativt mål på graden av aktivering av hver celle. Bestem likheten (eller samlokalisering) av cytoplasmatisk transkripsjonsfaktor NF-κB med kjernefysisk fargestoff PI å indikere translokasjon inn i kjernen (R4). En høy korrelasjon av NF-κB/PI localization gjenspeiles i en høy likheten score og angir graden av aktivering ^10.
4. Sammenlign Likhetene forholdstall mellom ulike behandlingsgruppene eller pasientgrupper som indikerer relativ funksjonell effektivitet av cellene. Kvantifisere data mellom prøver gjennom statistisk sammenligning av absolutte verdier eller fold forskjeller. Bruk IDEAS programvare for å vise bilder av celler fra sentrale deler av befolkningen histogrammer (Fig. 2).

4. Representative Resultater

Vi har kvantifisert signalveier som svar på en modell viral ligand ved å stimulere PBMCs med TLR7 / 8 ligand, R848 (Fig. 1). Vi samlet både cellulær lokalisering bilder og befolkningsstatistikk i våre eksempler grupper (Fig. 2). ImageStream tillater oss å gate celle undergrupper direkte fra PBMCs og bilde celle responser fra gated, men usorterte celle populasjoner. Her har vi kvantifisert effekten av TLR signaling på kjernefysisk lokalisering av NF-κB (p65) i Lin1-, CD4 dim, CD11c + myeloid DCS (mDCs). Ved studiestart, observerte vi en høy andel av unstimulated celler med transkripsjonsfaktor NF-κB (p65) i cytoplasma. Etter stimulering, behandlede celler har en betydelig høyere likhet score på NF-B (p65) med kjernefysiske beis PI, som indikerer at NF-κB (p65) translocated inn i kjernen etter stimulering (median likhet score er 1,52 og 3,01, henholdsvis, fig. 2). Lignende resultater er registrert i TLR5-stimulerte monocytter ^9.

Figur 1. Farging og Gating strategi for å kvantifisere effektene av stimulering på menneskelige mDCs. NF-κB transkripsjonsfaktor regulerer uttrykk av tallrike immunsystem gener. Denne studien måler den kjernefysiske lokalisering av NF-κB (p65) i mDCs fra en representant gjenstand etter TLR7 / 8 liga nd stimulering. I fokus enkeltceller ble identifisert ved gating på PI positive hendelser med høye kjernefysiske størrelsesforhold (R1). mDCs (Lin1-, CD4dim, CD11c +) var inngjerdet i R3. Nuclear lokalisering av NF-κB (p65) er plottet i R4. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. . Translokasjon av NF-κB i mDCs etter stimulering translokasjon av NF-κB (p65) i cellekjernen etter stimulering (R4) er avbildet i populasjoner av ubehandlede og stimulert mDCs, median likheten scorer er 1,52 i ubehandlet prøven og 3,01 i stimulert utvalget (A). Digitale bilder fanget samtidig av de ubehandlede eller R848-stimulerte celle populasjoner viser representative celler og intensiteten av NF-B translocated inn i cellekjernen (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.

De kritiske trinn i bruk av ImageStream for translasjonsforskning studier er utvalget av aktuelle sammenligningsgruppene og optimalisering og validering av antistoffspesifisitet. Forskjeller mellom faggruppene i merket målet vil være lett synlig gjennom histogrammer og celle bilder. I kombinasjon med en grundig analyse av endringer i relevante reseptorer og signalveier, vil disse dataene gi verdifull innsikt i mekanismer som ligger til grunn immun feilregulering i spesialiserte kohorter. Teknikken vil være begrenset av tilgjengeligheten av spesifikke antistoffer av tilstrekkelig affinitet for relevante mål. I tillegg er instrumentet mest egnet for en multi-bruker anlegget og analyse programvare krever litt omsorg for å mestre.

Denne teknologien er en kraftfull teknikk for translasjonsforskning undersøkelser av menneskelige sykdommer. Fremskritt innen genom sekvensering og array-teknologi har tillatt identifisering av varianter innblandet i mnoen sykdommer, men sjelden identifiserer virkningsmekanismen av nominert genet. Våre undersøkelser gir en blåkopi for translasjonsforskning undersøkelser i enkelte fag slik som kjernefysisk til cytoplasma ratio på NF-κB etter stimulering. Fra en liten blodprøve, kan vi identifisere differensial behandler eller signal i en ætt bestemt måte i et emne egne celler. Ved hjelp av denne metoden, har vi kvantifisert cellulære responser i monocytter i en stor kohort av unge og eldre fag og demonstrerte endringer i celle signalisering i aldring ^9. ImageStream kan brukes mer generelt for å markere viktige mekanismer i cellene i mange undersøkelser som terapi respondere og ikke-respondere, eller for en enkelt fag før og etter behandling, eller under flare og remisjon. Med rikelig modifikasjoner mulige for valg av faggrupper under studien og celletyper, og cellulære mekanismer for å undersøke, de fremtidige anvendelser av ImageStream er mange og should tillate betydelige fremskritt i mange translasjonelle områder.