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 JoVE Immunology and Infection

Monocytes और लघु मानव रक्त के नमूने से वृक्ष के समान कोशिकाओं में वंश - विशिष्ट टोल की तरह रिसेप्टर की मध्यस्थता संकेतन का मात्रात्मक इमेजिंग

,

Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine

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Cite this Article: Monocytes और लघु मानव रक्त के नमूने से वृक्ष के समान कोशिकाओं में वंश - विशिष्ट टोल की तरह रिसेप्टर की मध्यस्थता संकेतन का मात्रात्मक इमेजिंग

Qian, F., Montgomery, R. R. Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood. J. Vis. Exp. (62), e3741, doi:10.3791/3741 (2012).

Protocol: Monocytes और लघु मानव रक्त के नमूने से वृक्ष के समान कोशिकाओं में वंश - विशिष्ट टोल की तरह रिसेप्टर की मध्यस्थता संकेतन का मात्रात्मक इमेजिंग

1. अलगाव और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उत्तेजना

  1. स्थानीय संस्थागत समीक्षा बोर्ड के दिशा निर्देशों के तहत लिखा सूचित सहमति के बाद स्वस्थ स्वयंसेवकों से 10-50 मिलीलीटर heparinized रक्त प्राप्त करते हैं. बुढ़ापे या बीमारी के अध्ययन के लिए रोगजनन, और प्रत्येक स्वयंसेवक या मरीज के लिए अपवर्जन शामिल किए जाने के मापदंड को स्पष्ट रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए.
  2. मानव परिधीय रक्त mononuclear (PBMCs) के कोशिकाओं का उपयोग कर CPT ट्यूबों या Ficoll के - Paque प्लस निर्माता (जीई हेल्थकेयर, न्यू जर्सी) 7 अलगाव (अभिकर्मकों, तालिका 1) के दिन और निर्देश आचरण प्रयोगों के अनुसार अलग.
  3. में 0.6 मिलीलीटर मध्यम अकेले में 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों या TLR ligands या अन्य सक्रिय एजेंट, जैसे के साथ प्रेरित सेते हैं (3 एक्स 10 ट्यूब / 6) PBMCs TLR7 / 8 R848 ligand (0.6 मिलीग्राम मध्यम प्लस TLR7 10 मिमी / 8 ligand 0.6 μl R848, अंतिम 10 माइक्रोन के लिए 10-60 (InvivoGen, CA) मिनट 9) एकाग्रता 37 ° C पर.

2. प्रयोगशालाप्रकोष्ठों के Eling

  1. लेबल सेल वंश और जीवित कोशिका के fluorescently संयुग्मित एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए निलंबन पर अन्य सतह मार्कर. 3 लेबल x 10 4 बजे 20 मिनट के लिए 6 PBMCs ° सी सतह एककेंद्रकश्वेतकोशिका या डीसी प्रजातियों (तालिका 2) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के एक कॉकटेल के साथ एक 1.5 मिलीग्राम Eppendorf ट्यूब में 100 पीबीएस / 2% FBS μl में. इष्टतम प्रतिरक्षी dilutions प्रारंभिक प्रयोगों और नमूने में निर्धारित किया जा सकता है बैचों में संसाधित किया जाना चाहिए करने के लिए बहुत - बहुत भिन्नता को कम करने. 0.1 के विक्रेता प्रतिरक्षी स्टॉक के लिए मिलीग्राम / एमएल एंटीबॉडी के 5 μl (01:20 मन्दन) का उपयोग करें. कक्षों की एक अलग ट्यूब केवल एक ही रंग के साधन पर फ्लोरोसेंट चैनल सेट संयुग्म के साथ लेबल का उपयोग करें.
  2. सतह लेबलिंग के बाद, आर टी पर 10 मिनट के लिए 4% पीएफए ​​/ पीबीएस में कोशिकाओं को ठीक. विश्लेषण के समय तक भंडारण के लिए, 500 XG और है ठंड बफर में resuspend कोशिकाओं (FBS DMSO के 10% से युक्त 90%) -80 पर डिग्री सेल्सियस पर परख के दिन तक अपकेंद्रित्र कोशिकाओं.
  3. मूल्यांकन प्रक्रिया बैचों ओ के लिएदाताओं के एक समूह से च अनुपचारित और प्रेरित कोशिकाओं को एक साथ परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए. विश्लेषण के दिन पर, पिघलना कोशिकाओं जल्दी में 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान, 500x जी ठंड बफर को दूर करने पर अपकेंद्रित्र.
  4. को intracellular साइटोकिन्स या अन्य मार्करों, 100 μl बी.डी. / पेर्म धो बफर (बी.डी. बायोसाइंसेज, न्यू जर्सी) में resuspend सेल निलंबन का पता लगाने के लिए कोशिकाओं permeabilize. उदाहरण के लिए, खरगोश एंटीबॉडी विरोधी NF-κB (p65) के 1:20 आरटी पर 20 मिनट, 500 XG पर अपकेंद्रित्र, महाप्राण (व्यंजन) सतह पर तैरनेवाला और के लिए (अंतिम एकाग्रता 10 μg / एमएल, सांताक्रूज जैव प्रौद्योगिकी, सीए) कमजोर पड़ने के साथ intracellular संकेत घटकों के लिए लेबल 100 μl बी.डी. पेर्म में resuspend कोशिकाओं / बकरी विरोधी खरगोश आईजीजी Alexa647 (Invitrogen, CA) के 1:250 कमजोर पड़ने वाले बफर धो और आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं.
  5. तुरंत इमेजिंग से पहले, DAPI (0.2 μg / एमएल, Invitrogen, सीए) या propidium आयोडाइड (पीआई, 20 एनजी / एमएल, Invitrogen, सीए) के साथ नाभिक counterstain.

3. ImageStream विश्लेषण

  1. ImageStream द्वारा इमेजिंग Batched नमूने पर मानव नमूनों के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए आचरण. लेसरों की शक्ति के लिए साधन सेटिंग्स निम्नानुसार है: 488 एनएम, 658 एनएम और 405 एनएम के लिए 250 मेगावाट के लिए 10 मेगावाट के लिए 200 मेगावाट.
  2. (: ऊंचाई अनुपात चौड़ाई) मलबे (कम तीव्रता पीआई) या बहु सेलुलर घटनाओं से एकल कक्षों (r1) भेद (डेटा फ़ाइलें (1 छवि), पहले, सामान्य पीआई तीव्रता और उच्च PI पहलू अनुपात के साथ घटनाओं पर फाटक का विश्लेषण उच्च पीआई तीव्रता और कम पहलू अनुपात). Monocytes CD14 सकारात्मक कोशिकाओं के लिए एक गेट के भीतर हैं. mDCs कोशिकाओं है कि CD11c और सीडी 4 (R2) के लिए कम और लिन एक मार्कर (R3) के लिए भी कम के लिए उच्च रहे हैं के लिए एक गेट के भीतर हैं.
  3. विचारों सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें (Amnis, WA) प्रत्येक कोशिका के सक्रियण की डिग्री के एक प्रभावी मात्रात्मक उपाय प्रदान. Cytoplasmic प्रतिलेखन कारक परमाणु डाई पीआई के साथ NF-κB की समानता (या सह स्थानीयकरण) निर्धारित करने के लिए नाभिक (R4) में स्थानान्तरण का संकेत है. NF-κB/PI locali की एक उच्च सहसंबंधzation एक उच्च समानता स्कोर में परिलक्षित होता है और सक्रियण के 10 डिग्री को दर्शाती है.
  4. विभिन्न उपचार समूहों या रोगी कक्षों के सापेक्ष कार्यात्मक दक्षता संकेत मिलता आबादी के बीच समानता के अनुपात की तुलना. निरपेक्ष मान या गुना मतभेद के सांख्यिकीय तुलना के माध्यम से नमूने के बीच डेटा यों. विचारों सॉफ्टवेयर का प्रयोग करने के लिए जनसंख्या histograms (छवि 2) के प्रमुख क्षेत्रों से कोशिकाओं की छवियों को प्रदर्शित करने के लिए.

4. प्रतिनिधि परिणाम

हम ligand / 8 TLR7, R848 (1 छवि) के साथ PBMCs उत्तेजक द्वारा एक मॉडल वायरल ligand के जवाब में संकेत दे रास्ते मात्रा है. हम हमारे नमूना समूह (छवि 2) में दोनों सेलुलर स्थानीयकरण छवियों के और जनसंख्या के आँकड़े एकत्र. ImageStream हमें सीधे गेट सेल सबसेट के लिए gated है, लेकिन unsorted सेल आबादी से PBMCs और छवि सेल प्रतिक्रिया से अनुमति देता है. यहाँ हम TLR के प्रभाव मात्रामें NF κB (p65) के परमाणु स्थानीयकरण पर ignaling Lin1, सीडी 4 मंद, CD11c + myeloid DCS (mDCs) के. बेस लाइन पर, हम प्रतिलेखन NF-κB cytoplasm में कारक (p65) के साथ unstimulated कोशिकाओं के एक उच्च प्रतिशत मनाया. उत्तेजना के बाद इलाज किया कोशिकाओं के एक काफी उच्च NF बी की समानता में परमाणु दाग पीआई के साथ (p65) स्कोर है, यह दर्शाता है कि NF κB (p65) उत्तेजना के बाद नाभिक में translocated (औसत समानता स्कोर 1.52 और 3.01, क्रमशः, अंजीर. ) 2. इसी तरह के परिणाम TLR5 उत्तेजित 9 monocytes में नोट कर रहे हैं.

चित्रा 1
आकृति 1. धुंधला और Gating रणनीति मानव mDCs पर उत्तेजना का प्रभाव मात्रा ठहराना. NF-κB प्रतिलेखन कारक कई प्रतिरक्षा प्रणाली जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है. इस अध्ययन लिगा TLR7 / 8 के बाद एक प्रतिनिधि विषय से mDCs में NF κB (p65) के परमाणु स्थानीयकरण उपाय एन डी उत्तेजना. में ध्यान एकल कक्षों gating के द्वारा उच्च परमाणु पहलू अनुपात (R1) के साथ पीआई सकारात्मक घटनाओं पर पहचान की गई. mDCs (Lin1, CD4dim, CD11c +) R3 में gated थे. NF κB (p65) के परमाणु स्थानीयकरण R4 में प्लॉट किए जाते है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. NF-κB की उत्तेजना बाद mDCs में स्थानान्तरण (R4) उत्तेजना के बाद नाभिक में NF κB (p65) के स्थानान्तरण अनुपचारित और उत्तेजित mDCs की आबादी में दिखाया गया है, मंझला समानता स्कोर 1.52 और अनुपचारित नमूने में 3.01 में है उत्तेजित नमूना (एक). डिजिटल छवियाँ अनुपचारित या R848 उत्तेजित सेल आबादी का एक साथ एकत्र प्रतिनिधि कोशिकाओं और NF बी की तीव्रता सेल नाभिक (बी) में translocated दिखा._upload/3741/3741fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion: Monocytes और लघु मानव रक्त के नमूने से वृक्ष के समान कोशिकाओं में वंश - विशिष्ट टोल की तरह रिसेप्टर की मध्यस्थता संकेतन का मात्रात्मक इमेजिंग

ImageStream की translational अध्ययन के लिए उपयोग में महत्वपूर्ण कदम प्रासंगिक तुलना समूहों और अनुकूलन और एंटीबॉडी विशिष्टता के सत्यापन का चयन कर रहे हैं. लेबल लक्ष्य में विषय समूहों के बीच अंतर histograms और सेल छवियों के माध्यम से आसानी से स्पष्ट हो जाएगा. प्रासंगिक रिसेप्टर्स और संकेत दे रास्ते में परिवर्तन का एक गहन विश्लेषण के साथ संयोजन में, इन आंकड़ों तंत्र है कि विशेष साथियों में प्रतिरक्षा dysregulation आबाद में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा. तकनीक प्रासंगिक लक्ष्य के लिए पर्याप्त समानता के विशिष्ट एंटीबॉडी की उपलब्धता सीमित हो जाएगा. इसके अलावा, एक बहु - उपयोक्ता सुविधा के लिए सबसे उपयुक्त उपकरण है और विश्लेषण सॉफ्टवेयर मास्टर करने के लिए कुछ ध्यान की आवश्यकता है.

इस प्रौद्योगिकी मानव रोगों के translational अनुसंधान के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है. जीनोम अनुक्रमण और सरणी प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में अग्रिम अनुमति दी है मीटर में फंसा वेरिएंट की पहचानकिसी भी रोग है, लेकिन शायद ही कभी नामित जीन की कार्रवाई के तंत्र की पहचान. हमारे अध्ययन NF-κB की उत्तेजना के बाद cytoplasmic अनुपात करने के लिए परमाणु के रूप में अलग - अलग विषयों में translational अनुसंधान के लिए एक खाका प्रदान करते हैं. रक्त का एक छोटा सा नमूना से, हम एक विषय की अपनी कोशिकाओं में एक वंश विशेष तरीके में अंतर है प्रसंस्करण या संकेत की पहचान कर सकते हैं. इस पद्धति का उपयोग करके, हम युवा और बुजुर्ग बुढ़ापे में 9 संकेतन सेल में और विषयों प्रदर्शन परिवर्तन की एक बड़ी काउहोट के monocytes में सेलुलर प्रतिक्रियाओं की मात्रा है. ImageStream अधिक मोटे तौर पर लागू किया जा सकता है चिकित्सा responders और गैर responders, के रूप में या पहले और इलाज के बाद, या चमक और छूट के दौरान एक व्यक्ति के विषय के लिए कई जांच में कोशिकाओं में कुंजी तंत्र पर प्रकाश डाला. प्रचुर मात्रा में अध्ययन के तहत इस विषय समूहों, सेल प्रकार, और सेलुलर तंत्र के लिए जांच की पसंद के लिए संभव संशोधन के साथ, ImageStream का भविष्य अनुप्रयोगों के कई और shoulकई translational क्षेत्रों में उल्लेखनीय प्रगति की अनुमति चाहते हैं.

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Disclosures: Monocytes और लघु मानव रक्त के नमूने से वृक्ष के समान कोशिकाओं में वंश - विशिष्ट टोल की तरह रिसेप्टर की मध्यस्थता संकेतन का मात्रात्मक इमेजिंग

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements: Monocytes और लघु मानव रक्त के नमूने से वृक्ष के समान कोशिकाओं में वंश - विशिष्ट टोल की तरह रिसेप्टर की मध्यस्थता संकेतन का मात्रात्मक इमेजिंग

इस काम में भाग एनआईएच (N01 HHSN272201100019C, U19 089,992 ऐ, और / NCRR GCRC कार्यक्रम एम 01-RR00125) के द्वारा समर्थित किया गया. लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा और, येल सेल सॉर्टर कोर के सुविधा के निदेशक डॉ. मार्क Shlomchik धन्यवाद.

References: Monocytes और लघु मानव रक्त के नमूने से वृक्ष के समान कोशिकाओं में वंश - विशिष्ट टोल की तरह रिसेप्टर की मध्यस्थता संकेतन का मात्रात्मक इमेजिंग

  1. Linton, P.J. & Dorshkind, K. Age-related changes in lymphocyte development and function. Nat. Immunol. 5, 133-139 (2004).
  2. Shaw, A.C., et al. Dysregulation of Human Toll-like Receptor Function in Aging. Ageing Research Reviews. 10, 346-353 (2011).
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  4. van Duin, D., et al. Age-associated Defect in Human TLR1 Function and Expression. J. Immunol. 178, 970-975 (2007).
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  9. Qian, F., et al. Age-associated elevation in TLR5 leads to increased inflammatory responses in the elderly. Aging Cell. 11, 104-110 (2011).
  10. George, T.C., et al. Quantitative measurement of nuclear translocation events using similarity analysis of multispectral cellular images obtained in flow. Journal of immunological methods. 311, 117-129 (2006).

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