Quantitative Imaging van Lineage-specifieke Toll-like receptor-gemedieerde signalisatie in monocyten en dendritische cellen van de kleine monsters van menselijk bloed

1. Isolatie en stimuleren van immuuncellen

1. Zorg voor 10-50 ml heparine bloed van gezonde vrijwilligers na schriftelijke toestemming volgens de richtlijnen van de lokale Institutional Review Board. Voor studies van het ouder worden of ziekte pathogenese, uitsluiting en insluiting criteria voor elke vrijwilliger of patiënt moet expliciet worden bepaald.
2. Isoleer de humane perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC's) met behulp van CPT-buisjes of Ficoll-Paque Plus volgens de instructies van de fabrikant (GE Healthcare, NJ) en gedrag experimenten op de dag van de isolatie ⁷ (reagentia, tabel 1).
3. Incubeer PBMCs (3 x 10 ⁶ / buis) in 1,5 ml buizen 0,6 ml medium of gestimuleerd met TLR liganden of activerende middelen, zoals de TLR7 / 8 ligand R848 (0,6 ml medium plus 0,6 ul 10 mM TLR7 / 8 ligand R848, eindconcentratie 10 uM) bij 37 ° C gedurende 10-60 min (InvivoGen, CA) ^9.

2. LaboratoriumEling van cellen

1. Label cellijn en andere oppervlakte-markers op levende cellen schorsingen met fluorescent-geconjugeerde antilichamen. Label 3 x 10 ⁶ PBMC gedurende 20 min bij 4 ° C in 100 ul PBS / 2% FBS in 1,5 ml Eppendorf buis met een cocktail van oppervlakte antilichamen specifiek voor monocyten of DC lijnen (Tabel 2). Optimale antilichaam verdunningen kan worden bepaald voorafgaande experimenten en voorbeelden worden verwerkt in batches te veel te veel variatie te minimaliseren. Voor leverancier antilichaam stock van 0,1 mg / ml gebruik 5 ul antilichaam (1:20 verdunning). Gebruik een aparte buis van cellen gelabeld met slechts een enkele kleur conjugaat het opzetten van de tl-kanalen op het instrument.
2. Na oppervlak etikettering vast cellen in 4% PFA / PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voor opslag tot het moment van analyse centrifuge cellen 500 xg en hersuspenderen cellen bevroren buffer (90% FBS met 10% DMSO) bij -80 ° C tot de dag van assay.
3. Voor de beoordeling, proces batches of onbehandeld en gestimuleerde cellen uit een groep van donoren samen om variabiliteit te minimaliseren. Op de dag van analyse, dooi cellen snel in 37 ° C waterbad, centrifugeer bij 500x g tot bevriezing buffer te verwijderen.
4. Cellen permeabilize voor detectie van intracellulaire cytokines of andere markeringen, hersuspenderen celsuspensies in 100 ul BD Perm / wasbuffer (BD Biosciences, NJ). Label voor intracellulaire signaleringscomponenten met bijvoorbeeld 1:20 verdunning van konijn anti-NF-kB (p65) antilichaam (uiteindelijke concentratie 10 pg / ml, Santacruz Biotechnology, CA) gedurende 20 minuten bij RT, centrifuge 500 xg aspiraat supernatant en hersuspenderen cellen in 100 ul BD Perm / wassen met buffer 1:250 verdunning van geit anti-konijn IgG-Alexa647 (Invitrogen, CA) en geïncubeerd gedurende 20 min bij KT.
5. Vlak voor beeldvorming tegenkleuring kernen met DAPI (0,2 ug / ml, Invitrogen, CA) of propidium jodide (PI, 20 ng / ml, Invitrogen, CA).

3. ImageStream Analyse

1. Voer beeldvorming door ImageStream op batched monsters van de variabiliteit tussen menselijke monsters te beperken. Instrument instellingen vermogen van de laser als volgt: 200 mW 488 nm, 10 mW 658 nm en 250 mW 405 nm.
2. (: Hoogte verhouding breedte) op enkele cellen (R1) van puin (lage PI intensiteit) of multi-cellulaire gebeurtenissen te onderscheiden (van databestanden (afb. 1), eerste, poort op evenementen met een normale PI intensiteit en hoge PI aspect ratio te analyseren hoge PI intensiteit en lage aspect ratio). Monocyten binnen een poort voor CD14 positieve cellen. mDCs zijn binnen een poort voor cellen die hoog zijn voor CD11c en laag voor CD4 (R2) en ook laag voor Lin-1 markers (R3).
3. Gebruik IDEAS software (Amnis, WA) een effectieve kwantitatieve meting van de mate van activatie van elke cel. Bepaal gelijkenis (of co-lokalisatie) van de cytoplasmatische transcriptiefactor NF-kB met nucleaire kleurstof PI translocatie geven in de kern (R4). Een hoge correlatie van NF-κB/PI localisatie komt tot uitdrukking in een hoge gelijkenis score en geeft de mate van activering ^10.
4. Vergelijk de overeenkomst verhoudingen tussen behandelingsgroepen of patiëntengroepen relatieve functionele efficiëntie van de cellen te geven. Kwantificeren van gegevens tussen de monsters door middel van statistische vergelijking van de absolute waarden of voudige verschillen. Gebruik IDEEËN software om beelden van de cellen van de belangrijkste segmenten van de bevolking histogrammen (figuur 2) weer te geven.

4. Representatieve resultaten

We hebben gekwantificeerd signaalwegen in reactie op een model virale ligand door het stimuleren PBMCs met de TLR7 / 8 ligand, R848 (Fig. 1). We hebben allebei cellulaire lokalisatie beelden en de bevolking die verzameld worden op onze steekproef groepen (afb. 2). ImageStream laat ons toe om gate cel subsets direct van PBMC's en beeld-cel responsen van een gesloten, maar ongesorteerde celpopulaties. Hier hebben we gekwantificeerd het effect van TLR'signaling over nucleaire lokalisatie van NF-kB (p65) in Lin1-, CD4 dim, CD11c + myeloïde DCs (mDCs). Bij aanvang zagen we een hoog percentage niet-gestimuleerde cellen met de transcriptiefactor NF-kB (p65) in het cytoplasma. Na stimulatie, behandelde cellen hebben een significant hogere gelijkenis score van NF-B (p65) met nucleaire vlek PI, wat aangeeft dat NF-kB (p65) translocatie in de kern na stimulatie (mediaan gelijkenis scores zijn 1.52 en 3.01, respectievelijk Fig. 2). Soortgelijke resultaten worden vermeld in TLR5-gestimuleerde monocyten ^9.

Figuur 1. Kleuring en Poortsignalen strategie om de effecten van stimulatie te kwantificeren op de menselijke mDCs. De NF-kB transcriptiefactor reguleert expressie van een groot immuunsysteem genen. Dit onderzoek meet de nucleaire lokalisatie van NF-kB (p65) in mDCs afkomstig van een representatief onderwerp na TLR7 / 8 liga ND stimulatie. In-richten enkele cellen werden geïdentificeerd door gating op PI positieve gebeurtenissen met een hoge nucleaire aspect ratio's (R1). mDCs (Lin1-, CD4dim, CD11c +) werden in een gesloten R3. Nucleaire lokalisatie van NF-kB (p65) wordt uitgezet in R4. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2. . Translocatie van NF-kB in mDCs na stimulatie De translocatie van NF-kB (p65) in de kern na stimulatie (R4) is afgebeeld in populaties van onbehandelde en gestimuleerd mDCs, de mediaan gelijkenis score is 1,52 in de onbehandelde monster en 3,01 in de gestimuleerde monster (A). Digitale beelden tegelijkertijd verzameld van de onbehandelde of R848-gestimuleerde celpopulaties tonen vertegenwoordiger cellen en de intensiteit van de NF-B translocatie naar de celkern (B)._upload/3741/3741fig2large.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor een grotere afbeelding weer te geven.

De kritische stappen in het gebruik van ImageStream voor translationeel onderzoek is de selectie van relevante vergelijking groepen en optimalisatie en validatie van antilichaamspecificiteit. Verschillen tussen subject groepen in het gemerkte doel zal snel duidelijk zijn via histogrammen en mobiele beelden. In combinatie met een grondige analyse van wijzigingen in relevante receptoren en signaalwegen, zullen deze gegevens een waardevol inzicht verschaffen in mechanismen die immuun ontregeling ten grondslag liggen in gespecialiseerde cohorten. De techniek wordt beperkt door de beschikbaarheid van specifieke antilichamen voldoende affiniteit voor relevante doelen. Bovendien is het instrument meest geschikt voor meerdere gebruikers inrichting en de analyse software vereist enige zorg te beheersen.

Deze technologie is een krachtige techniek voor translationeel onderzoek van menselijke ziekten. Vooruitgang in genoom-en array-technologie hebben toegestaan ​​identificatie van de varianten betrokken bij malle ziekten, maar zelden te identificeren het werkingsmechanisme van de genomineerde gen. Onze studies geven een blauwdruk voor translationeel onderzoek in individuele onderwerpen, zoals de nucleaire om cytoplasmatische verhouding van NF-kB na stimulatie. Uit een kleine steekproef van bloed, kunnen we differentieel verwerkt of signalering in een geslacht specifieke manier in de eigen onderwerp cellen. Met deze methode hebben we gekwantificeerd cellulaire reacties in monocyten van een grote groep jonge en oudere proefpersonen en aangetoond veranderingen in cell signaling in veroudering ^9. ImageStream kan breder worden toegepast op de belangrijkste mechanismen in de cellen in vele onderzoeken zoals therapie responders en non-responders, of voor een individuele onderwerp voor en na de behandeling, of tijdens de flare en remissie te markeren. Met een overvloed aan wijzigingen mogelijk voor de keuze van het onderwerp groepen onder studie, celtypen, en cellulaire mechanismen te onderzoeken, de toekomstige toepassingen van ImageStream zijn talrijk en schouderzou leiden tot aanzienlijke vooruitgang in veel translationeel gebieden.