Chromatine immunoprecipitatie (ChIP) met behulp van Drosophila Weefsel

(De hele chip procedure duurt ongeveer twee dagen. Voorbereiding van ChIP bibliotheken voor high-throughput sequencing duurt nog eens 2-3 dagen.)

1. Ontleden en Bereid weefsel voor ChIP Experiment (~ 1 miljoen cellen)

1. Ontleden weefsel van belang (bijvoorbeeld 200 paar van Drosophila testes) in koude PBS + 1x proteaseremmer (los 1 pellet van protease inhibitor cocktail in 1,5 ml 1x PBS om 7x voorraad oplossing te verkrijgen) + PMSF (uiteindelijke concentratie 100 ug / ml). Spoel tweemaal weefsel en hersuspenderen weefsel in 200 pi van dezelfde PBS oplossing met remmers.
2. Om het monster vast te stellen, toe te voegen 5,5 ul 37% formaldehyde (warm formaldehyde in 37 ° C waterbad gedurende 1 min voor het gebruik). Incuberen bij 37 ° C gedurende 15 minuten, elke 5 minuten vortex daartussen.
3. Plaats het monster op het ijs voor het weefsel om zich te vestigen voor 2 minuten. Spoel 2x met 450 ul PBS (met proteaseremmers en PMSF). Sample kan nu winkeld bij -20 ° C. Herhaal dissectie een paar keer om genoeg materiaal voor ChIP te verkrijgen.

2. Bereid Supernatant met eiwit-DNA Vervoeging voor Chip Assay

1. Meng voldoende monster van stap 1.3 1,75 mL Eppendorf buis.
2. Verwijder de PBS uit weefselmonster. Voeg 200 ul lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM CaCl2, 0,2% Triton X-100 of NP-40, 5 mM butyraat en 1x proteinase inhibitor cocktail). Voeg verse PMSF stockoplossing lysis buffer (PMSF eindconcentratie van 0,5 mM). Meng met blauwe homogenisator (Fisher Cat # 749521 tot +1.590) tot weefsels volledig distantiëren zonder aggregatie, incuberen bij RT (kamertemperatuur) gedurende 10 minuten.
3. Sonicatie: gebruik microtip ultrasoonapparaat (Misonix HS-XL200) aan de macht 20. Sonificeer 10 sec en rust op het ijs voor 50 sec. Herhaal 4-5 keer (optimale sonicatie tijd moet empirisch worden bepaald, zoals langere sonicatie zal opleveren kleinere fragmenten. Voor chip met behulp van antilichamen tegen histone wijzigingen, normaal gesproken hebben we ultrasone trillingen chromatine tot ongeveer 200-300 bp; voor transcriptie factor of chromatine toezichthouder (bijvoorbeeld de Polycomb-eiwitten), hebben we normaal gesproken ultrasone trillingen chromatine tot 200-1000 bp. Echter, de optimale fragmentgrootte empirisch worden getest. Let op: ALTIJD DE BUIS KEEP ON ICE, zelfs tijdens sonicatie OM monster te voorkomen opwarming van!
4. Verdun monster door toevoeging 1,8 ml RIPA buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,1% Na-deoxycholaat, 1% Triton X-100 met proteaseremmers en PMSF bij dezelfde concentratie als beschreven eerder). Sla 40 pl als input controle door 2 pi 5M NaCl en incuberen bij 65 ° C geroerd (O / N) crosslink keren.
5. Om antilichaam geconjugeerd aan korrels, voeg 40 ul Proteïne A puimsteen 1,5 ml eppendorfbuisje en voeg 600 pi PBS en gesteente bij 4 ° C gedurende 2 minuten toepassing korrels magneet en verwijderen supernatant. Voeg 100 ul van PBS en het antilichaam van belang (hoeveelheid antilichaam moet worden bepaald empirmatisch). Incubeer bij kamertemperatuur 1 uur of 4 ° C gedurende 4 uur.
6. Verwijder supernatant van de kralen door de magneet en voeg 1 ml chromatine uittreksel uit stap 2.4 tot de kralen. Draai bij 4 ° CO / N.
7. Breng ChIP monster tot magneet en te verwijderen supernatant. Was de kralen met de volgende buffer bij 4 ° C gedurende 10 minuten:
   2x met 1 ml RIPA buffer [1,89 mL 'RIPA buffer' + 315 pl 7x proteaseremmers + 20 pL PMSF];
   2x met 1 ml RIPA buffer + 0,3 M NaCl [1,89 mL RIPA buffer + 220 uL 3 M NaCl];
   2x met 1 ml LiCl buffer (0,25 M LiCl, 0,5% NP40, 0,5% NaDOC);
   1x met 1 ml 1 x TE + 0,2% Triton X-100;
   1x met 1 ml 1x TE.
   
8. Om crosslink keren de korrels te resuspenderen in 100 ul TE buffer + 3 pi 10% SDS + 5 pi proteinase K (20 mg / ml). Incubeer bij 65 ° CO / N.
9. Breng kralen om magneet en over te dragen supernatant in een nieuwe buis. DE BOVENSTAANDE bevat uw DNA-monster. Was kralen met 100 pi TE + 0,5 MNaCl en combineren van de twee supernatant.
10. Fenol-chloroform halen het DNA-monster. Voeg 200 ul Fenol: Chlorofrom: IAA (25:24:1) mix en vortex. Spin op 14k gedurende 5 minuten bij RT. Als alternatief kan DNA worden gehaald met behulp van PCR Qiagen zuivering kit.
11. Breng de bovenstaande / waterlaag in een nieuwe buis en voeg lineaire acrylamide tot een eindconcentratie van 20 ng / ml (U 1 pi van glycogeen bij 20 mg / ml per 1 ml van de bovenstaande kunnen ook worden gebruikt. Glycogeen wordt gebruikt daaropvolgende qPCR of PCR analyse terwijl lineaire acrylamide gebruikt voor sequentie assays.) Voeg 20 ul van 3M NaOAc en 500 ul 100% EtOH. Meng goed en incubeer bij 80 ° C gedurende 10 minuten. Spin bij maximale snelheid gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
12. Verwijder supernatant en was met 300 pl 70% EtOH. Drogen aan de lucht en resuspendeer monster in 50 ul TE-buffer. Voorbeeld nu worden opgeslagen bij -20 ° C. Monster kan worden gebruikt voor de kwantitatieve PCR (qPCR) assay (figuur 1).

3a. Analyseer ChIP-ed DNA met behulp van qPCR

1. Verdun genomisch DNA in de volgende concentratie met een standaard curve maken: onverdunde, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000.
2. Voor elke primerpaar, opgericht qPCR in twee exemplaren in een 96-wells plaat met genomisch DNA uit stap 3a.1, inputcontrole en Chip-ed DNA:
   10 pi 2x SYBR PCR-mix (Fermentas, K0222);
   1 pi 10 pM voorwaartse primer;
   1 pi 10 pM reverse primer;
   x ul ChIP-ED-DNA (controle op, of genomisch DNA);
   y ul nuclease vrij _H2O de reactie volume op 20 pL.
   
3. Spin down van de 96-wells plaat met Mini plaat Spinner (LABNET).
4. Voer qPCR met de ABI 7300 real-time PCR-systeem (of andere real-time PCR-systemen) met behulp van de volgende voorwaarde:
   Stap 1: 50 ° C gedurende 2 minuten, 1 cyclus;
   Fase 2: 95 ° C gedurende 10 min, 1 cyclus;
   Fase 3: 95 ° C gedurende 15 s 60 ° C gedurende 1 min., 40 cycles;
   Fase 4 (dissociatie fase): 95 ° C gedurende 15 s 60 ° C gedurende 1 minuut, 95 ° C gedurende 15 s.
   
5. Controleer de dissociatie curve: een piek bij de thermische dissociatie plot suggereert een amplicon van de PCR-reactie. Meer dan een piek geeft niet-specifieke product met primerpaar dient de qPCR zij niet worden gebruikt.
6. Bepaal de lineaire fase van exponentieel van PCR-reactie voor elke primer set door berekening van de formule DNA hoeveelheid opgelost volgens Ct (cyclus drempelwaarde) waarde, gebaseerd op de standaard curve met de reeks verdunde genomisch DNA in 3a. 1.
7. Als de Ct-waarde van CHIP-ED-DNA en input controle zijn binnen het lineaire gebied van de Ct-waarde, de berekening van de verrijking van CHIP-ed-DNA versus input, volgens de verdunningsfactor van CHIP-ED-DNA en input controle in 2.4.

3b. Amplify ChIP-ed DNA voor high throughput sequencing.

1. End-reparatie van ChIP-ed DNA-mix (GebruikEpicentre DNA END-Repair kit), opgericht op het ijs:
   1-34 ul genomisch DNA van stap 2,12 (0,1 tot 5 ug)
   5 pi 10x End reparatie buffer
   5 pi 2,5 mM dNTP mix
   5 pi 10 mM ATP
   x il H ₂ O om de reactie volume aan te passen tot 49 pl
   1 pi einde Repair enzymmengsel (T4 DNA polymerase + T4 polynucleotidekinase)
   Incubeer 45 minuten bij kamertemperatuur. Zuiver reactie met gebruikmaking van Qiagen MinElute Reactie
   Cleanup kit. Elueren in 30 pi elutiebuffer (EB).
   
2. Voeg een-overhangende aan het 3 'uiteinde:
   30 pl geëlueerde DNA van stap 3B.1
   5 pi 10x NEB buffer # 2
   10 pi 1 mM dATP
   2 pi dH ₂ O
   3 pi 5 U / pl Klenow fragment (3 '→ 5' exo-)
   Gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Zuiver reactie met gebruikmaking van MinElute ReactionCleanup kit. Elueren in 10 pi EB.
   
3. Solexa linker ligatie:
   10 ul van geëlueerde DNA van stap 3B.2
   10 pl DDH ₂ O
   2.5 μ l 10x T4 DNA-ligase buffer
   1 pi Adapter oligo mix van Illumina (1/10-diluted uit voorraad)
   2,5 pi T4 DNA ligase (400 eenheden / pl)
   Incubeer gedurende 1 uur bij RT. Zuiver reactie met gebruikmaking van MinElute ReactionCleanup kit. Elueren in 20 pi EB. Voorbeeld nu worden opgeslagen bij -20 ° C.
4. Voer de geëlueerde DNA-monster uit stap 3B.3 het gebruik van de E-gel apparaat. Isoleren 300-500 bp band in de gel en zuiveren met de Qiagen gelextractiekit (deze stap maakt het ~ 125 bp zelf geligeerde linkers van de adapter oligo ligatie). Elueren in 12 pi EB.
   
5. Amplify bibliotheek met behulp van gepaarde-end (PE) primers van Illumina:
   10,5 pi geëlueerde DNA van stap 3B.4
   12,5 pl van master mix (2X Phusion HF, Finnzymes)
   1 pi PE1 PCR primer 1
   1 pi PE2 PCR primer 2
   PCR staat:
   98 ° C gedurende 30 sec
   (98 ° C 10 sec, 65 ° C 30 sec, 72 ° C 30 sec), 20 cycli herhaald
   72 ° C gedurende 5 minuten.
   
6. Monsters van stap 3B.5 kan worden gebruikt voor ChIP-seq na het selecteren van de juiste maat DNA (300-500 bp) met de standaard 2% agarose gel. Voorbeeld nu worden opgeslagen bij -20 ° C. Het beste is om elke chip monster isoleren op een enkele gel om besmetting te voorkomen. Monsters kunnen worden ingediend voor high-throughput sequencing.

3c. Solexa pijplijn analyse

1. De 25 bp sequentie leest werden verkregen uit de Illumina Genome Analyzer (GA) pijpleiding.
2. Alle maal gelezen werden afgestemd op de Drosophila genoom (dm3) met behulp van de eland (Efficient Local Alignment van Nucleotide Data)-software, waarmee maximaal twee mismatches met de referentie sequentie.
3. Uniek in kaart gebracht maal gelezen werden weerhouden voor downstream-analyse. Bij meerdere identieke gelezen, werden tot drie kopieën gehandhaafd om de mogelijkheid vertekening van PCR-amplificatie verminderen.
4. De output van de GA Pipeline werd omgezet naar de browser uitbreidbaar gegevens (BED) bestanden.
5. Voor het genereren vande pruik bestanden voor het uploaden naar de UCSC browser voor visualisatie, gebruikten we een python scrip die is in een eerdere publicatie ³ beschreven met 4 basispunten als grootte van het venster en 160 bp als het DNA-fragment grootte.
6. Om Drosophila genen in te delen in stil en expressie genen, hebben we gebruik gemaakt van een digitaal getal genoemd RPKM (leest / per kilobase samengevoegd exon regio / per miljoen in kaart gebrachte leest). Genen RPKM = 0 werden als stil groep genen RPKM ≥ 1 werden ingedeeld in de uitdrukking groepen die in drie groepen worden ingedeeld als genen lage, middelmatige en hoge expressie, en elke groep over hetzelfde aantal genen.
7. Om de histon-eiwitten niveau en de genexpressie vergelijken, gebruikten we een python script die is beschreven in een eerdere publicatie ^3.

4. Representatieve resultaten

Voorbeelden van ChIP-qPCR resultaten met behulp van bam (zak knikkers) mutant testes worden getoond in Figuur 1 ^4. In bam testes, is er een storing in de overgang van proliferatieve spermatogonia te differentiëren spermatocyten ^{5, 6.} We maken gebruik van bam testes als bron voor ongedifferentieerde kiemcellen, die zijn verrijkt met dit weefsel type. Differentiatie genen die nodig zijn voor sperma differentiatie, zoals man-specifieke transcriptie factor 87 (mst87F), Don Juan (dj) en fuzzy ui (FZO) worden niet uitgedrukt in bam testes. Deze genen zijn sterk verrijkt met de repressieve H3K27me3 histon-eiwitten ⁷ (Figuur 1A), maar zijn verstoken van de actieve H3K4me3 histon-eiwitten ⁸ (figuur 1B), een chromatine handtekening noemden we 'monovalent' ^7. Verrijking van een van beide H3K27me3 of H3K4me3 wordt bepaald door normalisatie tot een constitutief tot expressie Cycline A (CycA) gen ^4.

Bovendien is de ChIP profielen van H3K27me3 en H3K4me3 de buurt van de TSSs van vier klassen van genen differentieel tot expressie komen overeen met de functie van elke histon-eiwitten. Zoals getoond in figuur 3A is verrijkt H3K27me3 stroomafwaarts van de TSSs omgekeerd evenredig met niveau van genexpressie. De stille genen hebben de hoogste H3K27me3 terwijl dehoog tot expressie genen hebben geen H3K27me3 bindend. Deze gegevens in overeenstemming met de repressieve van H3K27me3 op genexpressie. Daarentegen verrijking van H3K4me3 rond de TSSs heeft de tegenovergestelde verband met gen expressie (figuur 3B), consistent met de actieve rol H3K4me3 op genexpressie.

Figuur 1. QPCR analyse van ChIP-ED-DNA met behulp van antilichamen tegen zowel de repressieve H3K27me3 histon-eiwitten (A) of actieve H3K4me3 histon-eiwitten (B) in niet-gedifferentieerde cel-verrijkte bam mutant testes. (A) in BAM testes, differentiatie genen (Mst87F, dj, FZO) zijn verrijkt met de H3K27me3 repressieve histon-eiwitten. (B) Differentiatie genen zijn uitgeput met H3K4me3 actieve markering. Het niveau van ChIP DNA (ChIP DNA / ingang) op de target-gen (Mst87F, dj of FZO) werd voor het eerst genormaliseerd naar de lev el van CHIP DNA bij de controle CycA gen. Fout balken geven de standaardafwijking van drie onafhankelijke biologische repliceert.

Figuur 2. UCSC genoom browser snapshots van H3K27me3 en H3K4me3 verrijking over de hele genomische regio's van (A) Mst87F (B) dj en (C) FZO, (D) CycA genen. De omcirkelde H3K27me3 verrijkte regio in (D) geeft de chromatine status van een overlappende gen CG7264, die laag uitgedrukt in bam testes (RPKM = 1), maar zeer uitgedrukt in wild-type testes (RPKM = 130) ⁸ (chip-seq gegevens ^7). Probes in kwantitatieve PCR analyse van ChIP resultaten in Figuur 1 zijn voorzien onderaan elk veld. klik hier grotere figuur zien .

tp_upload/3745/3745fig3.jpg "/>
Figuur 3. ChIP-seq profielen met behulp van H3K27me3 en H3K4me3 in bam testes ^7. De vier groepen genen (7509 genen) werden ingedeeld op basis van hun genexpressie niveaus op basis van RNA-seq resultaten ^8. De vertegenwoordiger klassen van genen worden uitgezet voor de verrijking van een bepaalde histon-eiwitten, met behulp van sequenties van 3kb stroomopwaarts tot 3kb stroomafwaarts van de transcriptie start sites (TSSs). Dit genereert een profiel van verrijking van (A) H3K27me3 (K27) en (B) H3K4me3 (K4) chip-seq analyses in elke groep. Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

De veelzijdigheid van ChIP analyses die in dit protocol kan worden gebruikt op verschillende weefsels, die een kans om de chromatine staat te studeren in een biologisch relevante systeem biedt. ChIP experimenten met gekweekte cellen systemen geschikt uitvoeren omdat grote hoeveelheden cellen kunnen gemakkelijk worden verkregen. Echter, gekweekte cellen niet noodzakelijk cellen in een meercellige omgeving. Door het ontwikkelen van deze techniek met behulp van ontleed weefsel van levende dieren, kunnen we in op vele vragen die gekweekte cellen niet kan.

Ondanks het nut van dit protocol, zijn er verschillende valkuilen. Bijvoorbeeld, de ontleed weefsel nog heterogeen verschillende celtypen. Terwijl relatief homogene cellen worden verkregen in Drosophila weefsels zoals denkbeeldige schijven andere weefsels zoals darmen, testes en eierstokken welke allen beperkt stamcellen heterogeen zijn. Deze complicatie kan gedeeltelijk wordenaangepakt met behulp van krachtige Drosophila genetica. Bijvoorbeeld, hoewel volwassen stamcellen bestaan ​​in een kleine populatie in weefsels hierboven besproken en zijn uiterst moeilijk te worden geïsoleerd in een voldoende aantal voor Chip-analyse, kunnen stamcellen bevolking verrijkt worden met behulp van genetisch gemuteerde achtergrond. De bam gen noodzakelijk is voor stamcellen differentiatie in Drosophila kiembaan lijn ^5,6. Daarom bam mutant geslachtsklieren zijn een goede bron voor verrijkte ongedifferentieerde kiemcellen. Door het uitvoeren van chip met behulp van bam mutant, kunnen we het verkrijgen van een epigenomisch landschap in ongedifferentieerde kiemcellen.