Kromatin Immunoprecipitation (chip) ved hjelp Drosophila Vev

(Hele ChIP prosedyren tar ca to dager. Utarbeidelse av chip biblioteker for high-throughput sequencing tar ytterligere 2-3 dager.)

1. Dissekere og Forbered Tissue for ChIP Experiment (~ 1 million celler)

1. Dissekere vev av interesse (f.eks 200 par av Drosophila testikler) i kald PBS + 1x proteasehemmer (oppløse en pellet av proteasehemmer cocktail i 1,5 ml 1x PBS å få 7x stamløsning) + PMSF (endelig konsentrasjon 100 mg / ml). Skyll vev to ganger og resuspender vev i 200 mL av samme PBS løsning med hemmere.
2. For å løse prøven, legger 5,5 mL 37% formaldehyd (varm formaldehyd i 37 ° C vannbad i 1 min før bruk). Inkuber ved 37 ° C i 15 minutter, vortex hvert 5. minutt i mellom.
3. Plasser prøven på is for vev for å betale for 2 minutter. Skyll 2x med 450 mL PBS (med proteasehemmere og PMSF). Eksempel kan nå være butikkd ved -20 ° C. Gjenta disseksjon flere ganger for å skaffe nok materiale for chip.

2. Forbered supernatanten med Protein-DNA Bøyning for ChIP Assay

1. Kombiner nok prøve fra trinn 1,3 i en 1,75 ml Eppendorf rør.
2. Fjern PBS fra vevsprøve. Tilsett 200 mL av lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 7,6 pH, 1 mM CaCl2, 0,2% Triton X-100 eller NP-40, 5 mm butyrate, og 1x proteinase inhibitor cocktail). Legg frisk PMSF stamoppløsning til lysis buffer (PMSF endelig konsentrasjon på 0,5 mm). Homogenisere med blå homogenizer (Fisher Cat # 749521-1590) til vev dissosiere helt uten aggregering, inkuber ved RT (romtemperatur) i 10 minutter.
3. Sonikator: bruk microtip sonicator (Misonix HS-XL200) på strøm 20. Sonicate i 10 sek og hvile på is for 50 sek. Gjenta 4-5 ganger (optimal sonikator tid bør bestemmes empirisk, som lenger sonikator vil gi mindre fragmenter. For ChIP bruker antistoffer mot Histone modifikasjoner, vi normalt sonicate kromatin til ca 200-300 bp, for transkripsjonsfaktor eller kromatin regulator (f.eks Polycomb proteiner), vi normalt sonicate kromatin til 200-1000 bp. Imidlertid bør den optimale fragment størrelse testes empirisk. Merk: HOLD ALLTID røret på ICE Selv under SONICATING Å UNNGÅ prøve fra OPPVARMING UP!
4. Fortynn prøven ved å legge 1,8 mL Ripa buffer (10 mM Tris-HCl, 7,6 pH, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,1% Na-deoxycholate, 1% Triton X-100, med proteasehemmere og PMSF på samme konsentrasjon som beskrevet tidligere). Spar 40 mL som input kontroll ved å legge to mL 5M NaCl og Inkuber ved 65 ° C over natten (O / N) for å reversere kryssbindingsfordelingen.
5. Slik konjugat antistoff mot perler, tilsett 40 mL Protein A perler til et 1,5 ml Eppendorf rør, legg deretter til 600 mL PBS og stein ved 4 ° C i 2 minutter, gjelder perler til magnet og fjern supernatanten. Tilsett 100 mL PBS og antistoff av interesse (mengden av antistoff bør bestemmes empirmatisk). Inkuber ved RT i 1 time eller 4 ° C i 4 timer.
6. Fjern supernatanten fra perler av magnet og legg 1 ml kromatin ekstrakt fra trinn 2,4 til perlene. Roter ved 4 ° CO / N.
7. Påfør ChIP prøve å magnet og fjern supernatanten. Vask perlene med følgende buffer ved 4 ° C i 10 minutter hver:
   2x med 1 mL Ripa buffer [1,89 ml 'Ripa buffer' + 315 mL 7x proteasehemmere + 20 mL PMSF];
   2x med 1 mL Ripa buffer + 0.3 M NaCl [1.89 mL Ripa buffer + 220 mL 3 M NaCl];
   2x med 1 mL LiCl buffer (0.25 M LiCl, 0,5% NP40, 0,5% NaDOC);
   1x med 1 ml 1x TE + 0,2% Triton X-100;
   1x med 1 ml 1x TE.
   
8. For å reversere kryssbindingsfordelingen, resuspender perlene i 100 mL TE buffer + 3 mL 10% SDS + 5 mL av proteinase K (20 mg / ml). Inkuber ved 65 ° CO / N.
9. Bruk perler til magnet og overføre supernatant inn et nytt rør. Supernatanten inneholder DNA-prøve. Vask perler med 100 mL TE + 0,5 MNaCl og kombinere de to supernatanten.
10. Fenol-kloroform utvinne DNA-prøven. Tilsett 200 mL Fenol: Chlorofrom: IAA (25:24:1) mix og virvle. Snurr på 14k i 5 minutter ved RT. Alternativt kan DNA tas opp ved hjelp Qiagen PCR rensing kit.
11. Overfør supernatanten / vandige lag inn i et nytt rør, og legg lineær acrylamide til en endelig konsentrasjon på 20 mg / ml (alternativt 1 mL av glykogen ved 20 mg / ml for hver 1 mL supernatant kan også brukes. Glykogen brukes til påfølgende qPCR eller PCR-analyser mens lineær akrylamid brukes for sekvensering analysene.) Tilsett 20 mL av 3M NaOAc og 500 mL 100% EtOH. Bland godt og inkuber ved 80 ° C i 10 minutter. Snurr på maksimal hastighet i 20 minutter ved 4 ° C.
12. Fjern supernatanten og vask med 300 mL 70% EtOH. Lufttørke og resuspender prøve i 50 mL TE buffer. Eksempel kan nå lagres ved -20 ° C. Eksempel kan brukes til kvantitativ PCR (qPCR) assay (Figur 1).

3a. Analyser Chip-ed DNA ved hjelp av qPCR

1. Fortynn genomisk DNA på følgende konsentrasjon for å lage en standard kurve: ufortynnet, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000.
2. For hver primer par, satt opp qPCR i to eksemplarer i en 96-brønns plate med genomisk DNA fra trinn 3a.1 og innspill kontroll og chip-ed DNA:
   10 mL 2x SYBR PCR mix (Fermentas, K0222);
   1 mL 10 mm forward primer;
   1 mL 10 mM reverse primer;
   x mL Chip-ed DNA (inngang kontroll, eller genomisk DNA);
   y mL nukleasefritt H ₂ O for å justere reaksjonen volumet til 20 mL.
   
3. Spinn ned 96-brønnen plate med Mini plate spinner (Labnet).
4. Utfør qPCR med ABI 7300 Real Time PCR system (eller andre Real Time PCR-systemer) ved hjelp av følgende betingelse:
   Trinn 1: 50 ° C i 2 min, 1 syklus;
   Trinn 2: 95 ° C i 10 min, 1 syklus;
   Trinn 3: 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 min, 40 cycles;
   Stage 4 (dissosiasjon scenen): 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 1 min, 95 ° C i 15 s.
   
5. Sjekk dissosiasjon kurve: En peak på termisk dissosiasjon tomten foreslår et enkelt fragment frå PCR reaksjonen. Mer enn en peak indikerer uspesifikke produkt med primer paret, bør qPCR dataene ikke brukes.
6. Bestem lineær fase av eksponensiell forsterkning av PCR reaksjonen for hver primer sett, ved å beregne formelen som løser DNA beløp i henhold til Ct (syklusterskel) verdi, som er basert på standard kurve med serien av fortynnet genomisk DNA i 3a. 1.
7. Dersom Ct verdien av chip-ed DNA og innspill kontroll er innenfor det lineære området av Ct verdi, beregne berikelse av chip-ed DNA versus input, i henhold til fortynning faktor av chip-ed DNA og innspill kontroll i 2.4.

3b. Forsterke Chip-ed DNA for høy gjennomstrømming sekvensering.

1. Slutt-reparasjon av chip-ed DNA mix (BrukEpicentre DNA END-Repair kit), satt opp på isen:
   1-34 mL genomisk DNA fra trinn 2,12 (0,1 til 5 mikrogram)
   5 mL 10x End reparasjon buffer
   5 mL 2,5 mm dNTP mix
   5 mL 10 mM ATP
   x mL H ₂ O for å justere reaksjonen volumet til 49 mL
   1 mL End-Repair Enzyme mix (T4 DNA Polymerase + T4 Polynucleotide Kinase)
   Inkuber i 45 minutter ved RT. Rense reaksjonen bruker Qiagen MinElute Reaction
   Opprydding kit. Eluer i 30 mL eluering Buffer (EB).
   
2. Legg A-overheng til 3 'enden:
   30 mL av eluted DNA produktet fra trinn 3b.1
   5 mL 10x NEB Buffer # 2
   10 mL 1 mm dATP
   2 mL dH ₂ O
   3 mL 5 U / mL Klenow Fragment (3 '→ 5' exo-)
   Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C. Rense reaksjonen bruker MinElute ReactionCleanup kit. Eluer i 10 mL EB.
   
3. Solexa linker ligation:
   10 mL av eluted DNA fra trinn 3b.2
   10 mL DDH ₂ O
   2,5 ogmu; l 10x T4 DNA ligase buffer
   1 mL Adapter oligo blanding fra Illumina (1/10-diluted fra lager)
   2,5 mL T4 DNA ligase (400 enheter / mL)
   Inkuber i 1 time ved RT. Rense reaksjonen bruker MinElute ReactionCleanup kit. Eluer i 20 mL EB. Eksempel kan nå lagres ved -20 ° C.
4. Kjør eluted DNA-prøven fra trinn 3b.3 ved hjelp av E-gel apparater. Isoler 300-500 bp bandet i gel og rense med Qiagen Gel Extraction kit (dette trinnet eliminerer ~~~HEAD=NNS 125 bp selv ligated Linkers fra adapteren oligo ligation). Eluer i 12 mL EB.
   
5. Forsterke biblioteket ved hjelp parvise slutt (PE) primere fra Illumina:
   10,5 mL av eluted DNA fra trinn 3b.4
   12,5 mL av Master Mix (2X Phusion HF, Finnzymes)
   1 mL av PE1 PCR primer 1
   1 mL av PE2 PCR primer 2
   PCR betingelse:
   98 ° C i 30 sek
   (98 ° C 10 sek, 65 ° C 30 sek, 72 ° C 30 sek), gjenta 20 sykluser
   72 ° C i 5 minutter.
   
6. Prøver fra trinn 3b.5 kan brukes for Chip-seq etter å ha valgt riktig størrelse på DNA (300-500 bp) med standard 2% agarose gel. Eksempel kan nå lagres ved -20 ° C. Det beste er å isolere hver brikke prøve på et enkelt gel for å hindre forurensning. Prøver kan sendes for high-throughput sekvensering.

3c. Solexa rørledning analyse

1. Den 25-BP sekvensering leser ble hentet fra Illumina Genome Analyzer (GA) rørledning.
2. Alle lesninger ble justert til Drosophila genomet (dm3) med Eland (Effektiv Lokal Oppretting av nukleotid Data) programvaren, slik at inntil to mismatches med referansen sekvensen.
3. Unikt kartlagt lesninger ble beholdt for nedstrøms analyse. For flere identiske lesninger, var opp til tre eksemplarer beholdes for å redusere muligheten for skjevheter fra PCR amplifikasjon.
4. Utgangen av GA Pipeline ble konvertert til nettleserens utvidbare data (BED) filer.
5. For å generereparykk filene for opplasting til UCSC nettleseren for visualisering, brukte vi en pytonslange skreppe som har blitt beskrevet i en tidligere publikasjon ³ med 4 bp som størrelsen på vinduet og 160 BP som DNA fragment størrelse.
6. For å klassifisere Drosophila gener i stille og uttrykte gener, brukte vi en digital nummer kalt RPKM (leser / per kilobase fusjonert exonic region / per million tilordnet leser). Gener med RPKM = 0 ble klassifisert som taus gruppe og gener med RPKM ≥ 1 ble klassifisert i uttrykt grupper, som kan deles inn i tre undergrupper som gener med lav, moderat og høy uttrykk nivåer, og hver gruppe har omtrent samme antall gener.
7. Å sammenligne histone modifikasjon nivå og genuttrykk, brukte vi en Python-skript som har blitt beskrevet i en tidligere publikasjon ^tre.

4. Representative Resultater

Eksempler av chip-qPCR resultatene med bam (pose med klinkekuler) mutant Testiklene er vist i figur 1 ^4. I Bam testiklene, er det en svikt i overgangen fra proliferativ spermatogonier til å differensiere spermatocytter ^{5, 6.} Vi bruker Bam testikler som en kilde for udifferensierte kjønnsceller, som er beriket i denne vevstype. Differensiering gener som kreves for sperm differensiering, for eksempel mannlig-spesifikk transkripsjonsfaktor 87 (mst87F), Don Juan (dj) og fuzzy løk (fzo) er ikke uttrykt i Bam testiklene. Disse genene er svært beriket med det undertrykkende H3K27me3 histone modifisering ⁷ (figur 1A), men er blottet for den aktive H3K4me3 histone modifisering ⁸ (figur 1B), en kromatin signatur vi kalt "monovalent ^'7. Anrikning av enten H3K27me3 eller H3K4me3 bestemmes av normalisering til en konstitutivt uttrykt cyclin A (CycA) genet ^4.

Videre CHIP profiler av H3K27me3 og H3K4me3 nær TSSs av fire klasser av ulikt uttrykt gener er konsistent med funksjonen til hver histone modifisering. Som vist i figur 3A, er anrikning av H3K27me3 nedstrøms TSSs omvendt korrelert med genuttrykk nivå. De tause gener har den høyeste H3K27me3 menshøyt uttrykt gener har ingen H3K27me3 bindende. Disse dataene er konsistent med den undertrykkende rolle H3K27me3 på genuttrykk. I kontrast, viste anrikning av H3K4me3 rundt TSSs motsatt korrelasjon med genuttrykk nivå (figur 3B), i samsvar med den aktive rollen H3K4me3 på genuttrykk.

Figur 1. QPCR analyse av chip-ed DNA ved hjelp av antistoff mot enten undertrykkende H3K27me3 histone modifikasjon (A) eller aktiv H3K4me3 histone modifikasjon (B) i udifferensierte celle-beriket Bam mutante testiklene. (A) i Bam testikler, derivasjon gener (Mst87F, dj, fzo) er beriket med H3K27me3 undertrykkende histone modifisering. (B) Differensiering gener er oppbrukt med H3K4me3 aktiv mark. Nivået av chip DNA (chip DNA / inngang) på målet genet (Mst87F, dj eller fzo) ble først normalisert til lev el av chip DNA på kontroll CycA genet. Feilfelt indikerer standardavvik fra tre uavhengige biologisk replikater.

Figur 2. UCSC genom nettleser øyeblikksbilder av H3K27me3 og H3K4me3 berikelse i hele genomisk regionene (A) Mst87F (B) dj og (C) fzo, (D) CycA gener. Den sirklet H3K27me3-beriket regionen i (D) reflekterer kromatin status en overlappende genet CG7264, som er ydmyk uttrykt i Bam testiklene (RPKM = 1), men høyt uttrykt i villtype testiklene (RPKM = 130) ⁸ (Chip-seq data fra ^7). Prober brukes i kvantitativ PCR-analyse av chip resultatene i figur 1 er merket nederst på hver tomt. Klikk her for å se større figur .

tp_upload/3745/3745fig3.jpg "/>
Figur 3. Chip-seq profiler ved hjelp H3K27me3 og H3K4me3 i Bam testiklene ^7. De fire genet gruppene (7,509 gener) ble klassifisert i henhold til deres genuttrykk nivåer basert på RNA-seq resultater ^8. De representative klasser av gener er plottet for anrikning av en bestemt histone modifikasjon, bruke sekvenser fra 3kb oppstrøms til 3kb nedstrøms deres transkripsjon start steder (TSSs). Dette genererer en profil av anrikning av (A) H3K27me3 (K27) og (B) H3K4me3 (K4) Chip-seq analyser i hver gruppe. Klikk her for å se større figur .

Allsidigheten av chip analyser som omtales i denne protokollen kan brukes på forskjellige vev, noe som gir en mulighet til å studere kromatin staten i en biologisk relevant system. CHIP eksperimenter med celler fra dyrkede systemer er praktisk å utføre fordi store mengder celler kan lett skaffes. Men ikke dyrkede celler ikke nødvendigvis reflektere celler i en multi-mobilnettet miljø. Ved å utvikle denne teknikken bruker dissekert vev fra levende dyr, kan vi ta mange spørsmål som dyrkede celler ikke kan.

Til tross for nytten av denne protokollen, er det flere begrensninger. For eksempel er dissekert vev fortsatt heterogen med flere forskjellige celletyper. Mens relativt homogene celler kan fås i Drosophila vev som imaginal plater, andre vev som guts, testikler og eggstokker som alle inneholder er begrensede adulte stamceller heterogen. Denne komplikasjonen kan være delvishåndteres ved hjelp av kraftige Drosophila genetikk. For eksempel, selv om voksne stamceller eksisterer i en liten befolkning i vev nevnt ovenfor, og er ekstremt vanskelig å bli isolert i et tilstrekkelig antall for ChIP analyse, kan stamcelleforskningen befolkningen bli beriket med genetisk mutert bakgrunn. Den Bam genet er nødvendig for stamcelleforskningen differensiering i Drosophila germline avstamning ^5,6. Derfor Bam mutante gonadene er en god kilde for berikede udifferensierte kjønnsceller. Ved å utføre ChIP bruke Bam mutant, kan vi få en epigenomic landskap i udifferensierte kjønnsceller.