Kromatin Immunoutfällning (chip) med användning av Drosophila Vävnad

(Hela ChIP Proceduren tar cirka två dagar. Beredning av chip bibliotek för high-throughput sekvensering tar ytterligare 2-3 dagar.)

1. Dissekera och förbereda Mjukpapper för ChIP Experiment (ca 1 miljon celler)

1. Dissekera vävnad av intresse (t.ex. 200 par av Drosophila testiklar) i kall PBS + 1x proteashämmare (lös upp 1 pellet av proteashämmare cocktail i 1,5 ml 1 x PBS för att erhålla 7x stamlösning) + PMSF (slutlig koncentration 100 pg / ml). Skölj vävnad två gånger och återsuspendera vävnad i 200 | il av samma PBS-lösning med hämmare.
2. För att fixa provet, tillsätt 5,5 pl 37% formaldehyd (varmt formaldehyd i 37 ° C vattenbad i 1 minut innan du använder). Inkubera vid 37 ° C under 15 minuter, vortex var 5 minuter emellan.
3. Placera provet på is under vävnaden sedimentera under 2 minuter. Skölj 2x med 450 pl PBS (med proteashämmare och PMSF). Provet kan nu lagrad vid -20 ° C. Upprepa dissekering flera gånger för att erhålla tillräckligt med material för CHIP.

2. Förbered supernatanten med protein-DNA Konjugering för ChIP analys

1. Kombinera tillräckligt prov från steg 1,3 i en 1,75 ml Eppendorf-rör.
2. Ta bort PBS från vävnadsprov. Tillsätt 200 pl lyseringsbuffert (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM CaCl2, 0,2% Triton X-100 eller NP-40, 5 mM butyrat och 1x proteinas-inhibitor cocktail). Tillsätt färsk PMSF stamlösning till lys-buffert (PMSF slutlig koncentration av 0,5 mM). Homogenisera med blå homogenisator (Fisher Cat # 749.521 till 1590) tills vävnaderna dissociera helt utan aggregering, inkubera vid RT (rumstemperatur) under 10 minuter.
3. Ultraljudsbehandling: Använd microtip sonikator (Misonix HS-XL200) vid start 20. Sonikera under 10 sekunder och vila på is under 50 sek. Upprepa 4-5 gånger (optimalt sonikeringstid bör bestämmas empiriskt, eftersom längre sonikering kommer att ge mindre fragment. För CHIP användning av antikroppar mot Histone ändringar vi normalt sonikera kromatin till cirka 200-300 bp, för transkription faktor eller kromatin regulator (t.ex. Polycomb proteiner), sonikera vi normalt kromatin till 200-1000 bp. Emellertid bör den optimala fragmentstorlek testas empiriskt. Obs: Håll alltid röret på ICE Även under sonikering för att förhindra smitta värms upp!
4. Spädda provet genom tillsats av 1,8 ml RIPA-buffert (10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, 0,1% Na-deoxicholat, 1% Triton X-100, med proteasinhibitorer och PMSF vid samma koncentration som beskrivits tidigare). Spara 40 pl som inmatning kontroll genom att tillsätta 2 ^ il 5 M NaCl och inkubera vid 65 ° C över natten (O / N) för att vända tvärbinda.
5. Att konjugera antikroppen till pärlorna, tillsätt 40 | il protein A-pärlor till ett 1,5 ml eppendorf-rör och tillsätt sedan 600 | il PBS och sten vid 4 ° C under 2 minuter, applicera pärlor till magneten och avlägsna supernatanten. Tillsätt 100 pl av PBS och antikroppen av intresse (mängden antikropp bör bestämmas Empirtiskt). Inkubera vid rumstemperatur under 1 timme eller 4 ° C under 4 timmar.
6. Avlägsna supernatanten från pärlorna genom magneten och tillsätt 1 ml kromatin extraktet från steg 2,4 till pärlorna. Rotera vid 4 ° CO / N.
7. Tillämpas chipsampeldata med magneten och avlägsna supernatanten. Tvätta pärlorna med följande buffert vid 4 ° C under 10 minuter vardera:
   2x med 1 ml RIPA-buffert [1,89 ml 'RIPA-buffert "+ 315 ^ il 7x proteasinhibitorer + 20 ^ il PMSF];
   2x med 1 ml RIPA-buffert + 0,3 M NaCl [1,89 ml RIPA-buffert + 220 | il 3 M NaCl];
   2x med 1 ml av LiCl-buffert (0,25 M LiCl, 0,5% NP40, 0,5% NaDOC);
   1x med 1 ml 1 x TE + 0,2% Triton X-100;
   1x med 1 ml 1 x TE.
   
8. Att vända tvärbinda, återsuspendera pärlorna i 100 pl TE-buffert + 3 | il 10% SDS + 5 pl proteinas K (20 mg / ml). Inkubera vid 65 ° CO / N.
9. Tillämpas pärlor till magneten och överföra supernatanten till ett nytt rör. Supernatanten Innehåller dina DNA-prov. Tvätta pärlorna med 100 | il TE + 0,5 MNaCl och kombinera de två supernatanten.
10. Fenol-kloroform extraheras DNA-prov. Tillsätt 200 pl Fenol: kloroform: IAA (25:24:1) blanda och skaka. Snurra med 14k under 5 minuter vid RT. Alternativt kan DNA extraherades med användning av Qiagen PCR-reningskit.
11. Överför supernatanten / vattenhaltiga skiktet till ett nytt rör och tillsätt linjär akrylamid till en slutlig koncentration av 20 pg / ml (alternativt 1 il glykogen vid 20 mg / ml för varje 1 ml av supernatanten kan också användas. Glykogen används för efterföljande qPCR eller PCR-analyser medan linjär akrylamid användes för sekvensering analyser.) Tillsätt 20 | il 3 M NaOAc och 500 | il 100% EtOH. Blanda väl och inkubera vid 80 ° C under 10 minuter. Rotera med maximal hastighet under 20 minuter vid 4 ° C.
12. Avlägsna supernatanten och tvätta med 300 | il 70% EtOH. Lufttorka och återsuspendera provet i 50 pl TE-buffert. Provet kan nu lagras vid -20 ° C. Provet kan användas för kvantitativ PCR (qPCR)-analys (figur 1).

3a. Analysera Chip-ED DNA med qPCR

1. Späd genomiskt DNA vid följande koncentration för att göra en standardkurva: outspätt, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/5000.
2. För varje primerpar, som inrättades qPCR i två exemplar på en 96-brunnars platta med genomisk DNA från steg 3A.1, ingång kontroll och chip-ed DNA:
   10 ^ 2x SYBR PCR mix (Fermentas, K0222);
   1 il 10 | iM framåtriktad primer;
   1 il 10 nM omvänd primer;
   x il Chip-ed DNA (kontroll, eller genom-DNA);
   y iL nukleas-fritt _H2O till justera reaktionsvolymen till 20 | il.
   
3. Snurra ner 96-brunnar med Mini plattan spinner (Labnet).
4. Utför qPCR med ABI 7300 realtid PCR-system (eller andra realtids-PCR-system) med hjälp av följande villkor:
   Steg 1: 50 ° C under 2 minuter, 1 cykel;
   Steg 2: 95 ° C under 10 minuter, 1 cykel;
   Steg 3: 95 ° C under 15 s, 60 ° C under 1 min, 40 Cycles;
   Steg 4 (dissociations steget): 95 ° C under 15 s, 60 ° C under 1 min, 95 ° C under 15 s.
   
5. Kontrollera dissociationskurvan: En topp vid termisk dissociation kurva visar en enda amplikon från PCR-reaktionen. Mer än en topp indikerar icke-specifik produkt med primerparet bör qPCR data ej användas.
6. Bestämma den linjära fasen av exponentiell amplifiering av PCR-reaktionen för varje primeruppsättning, genom beräkning av formeln som löser DNA mängd enligt Ct (cykel tröskel) värde, vilket är baserat på standardkurvan med användning av serier av utspädda genomiskt DNA i 3a. 1.
7. Om Ct värdet av chip-ED DNA och kontroll av registrering är inom det linjära intervallet Ct-värdet, beräkna anrikning av chip-ED DNA-teknik ingång, i enlighet med späda faktorn Chip-ED DNA och input kontroll i 2,4.

3b. Amplify Chip-ed DNA för hög genomströmning sekvensering.

1. Slutet av reparation av Chip-ed DNA mix (AnvändEpicentrum DNA END-Repair kit), som inrättats på is:
   1-34 ^ il genomiskt DNA från steg 2,12 (0,1 till 5 | ig)
   5 ^ 10x End reparation buffert
   5 | il 2,5 mM dNTP-blandning
   5 | il 10 mM ATP
   X | _il H2O för att justera reaktionsvolymen till 49 | il
   1 il Slut-reparation enzymblandning (T4-DNA-polymeras + T4-polynukleotidkinas)
   Inkubera under 45 minuter vid RT. Rena reaktion med användning av Qiagen MinElute Reaktion
   Cleanup kit. Eluera i 30 | il elueringsbuffert (EB).
   
2. Tillsätt A-överhäng till 3 'änden:
   30 pl av eluerade DNA-produkt från steg 3b.1
   5 | il 10 x NEB-buffert # 2
   10 | il 1 mM dATP
   2 | il dHaO ₂ O
   3 | il 5 U / pl Klenow-fragment (3 '→ 5' exo-)
   Inkubera under 30 minuter vid 37 ° C. Rena reaktion med användning MinElute ReactionCleanup kit. Eluera i 10 | il EB.
   
3. Solexa linkerligering:
   10 pl av eluerade DNA från steg 3B.2
   10 | il ddHaO ₂ O
   2,5 &mu, l 10 x T4 DNA-ligasbuffert
   1 pl Adapter oligo mix från Illumina (1/10-diluted från lager)
   2,5 | il T4 DNA-ligas (400 enheter / | il)
   Inkubera under 1 timme vid rumstemperatur. Rena reaktion med användning MinElute ReactionCleanup kit. Eluera i 20 | il EB. Provet kan nu lagras vid -20 ° C.
4. Köra det eluerade DNA-provet från steg 3B.3 användning av E-gelapparat. Isolera 300-500 bp-bandet i gelén och renas med användning av Qiagen-gelextraheringskit (detta steg eliminerar de ~ 125 bp själv-ligerade linkers från adaptern oligo-ligering). Eluera i 12 | il EB.
   
5. Amplify biblioteket med parade slut (PE) primers från Illumina:
   10,5 | il av eluerade DNA från steg 3B.4
   12,5 pl Master Mix (2X Phusion HF, Finnzymes)
   1 il PE1 PCR-primer 1
   1 pl PE2 PCR primer 2
   PCR villkor:
   98 ° C under 30 sek
   (98 ° C 10 sek, 65 ° C 30 sek, 72 ° C 30 sek), upprepa 20 cykler
   72 ° C under 5 minuter.
   
6. Prover från steg 3B.5 kan användas för Chip-punkter efter val av lämplig storlek DNA (300-500 bp) med användning av standarden 2% agarosgel. Provet kan nu lagras vid -20 ° C. Det är bäst att isolera varje chip prov på en enda gel för att förhindra kontaminering. Prover kan lämnas för hög genomströmning sekvensering.

3c. Solexa rörledning analys

1. Den 25-bp-sekvensering läser erhölls från Genome Illumina Analyzer (GA) rörledning.
2. Alla läsningar har anpassats till Drosophila genomet (dm3) med Eland (effektiv lokal Enhetliga Nukleotid Data) programvara, vilket gör att upp till två bristande överensstämmelse med referenssekvensen.
3. Unikt kartlagt läsningar behölls för nedströms analys. För flera identiska läsningar, var upp till tre kopior kvar för att minska risken för fördomar från PCR-amplifiering.
4. Utsignalen från den GA rörledning omvandlades till data webbläsaren töjbara (BED)-filer.
5. För att skapade peruk filerna för att ladda upp till UCSC webbläsaren för visualisering, använde vi ett python ränsel, som har beskrivits i en tidigare publikation ³ med 4 bp som fönsterstorleken och 160 bp som DNA-fragment storlek.
6. Att klassificera Drosophila gener i tysta och uttrycks generna, använde vi ett digitalt tal kallas RPKM (läser / per kb samman exonic region / per miljon mappade läsningar). Gener med RPKM = 0 klassificerades som tyst-grupp och gener med RPKM ≥ 1 indelades i de uttryckta grupper, vilka kan klassificeras i tre undergrupper som gener med lågt, måttligt och högt expressionsnivåer, och varje grupp har ungefär samma antal gener.
7. För att jämföra histon modifieringen nivån och genuttryck, använde vi ett Python-skript som har beskrivits i en tidigare offentliggörande ^3.

4. Representativa resultat

Exempel på Chip-qPCR resultat med Bam (påse med kulor) mutant testiklarna visas i figur 1 ^4. I Bam testiklar, det finns ett fel i övergången från proliferativ spermatogonier att skilja spermatocyter ^{5, 6.} Vi använder bam testiklar som en källa för odifferentierade könscellerna, som är anrikade på denna vävnadstyp. Differentiering gener som krävs för spermier differentiering, såsom manligt-specifik transkriptionsfaktor 87 (mst87F), Don Juan (dj) och fuzzy lök (fzo) inte uttrycks i Bam testiklarna. Dessa gener är starkt berikad med den undertryckande H3K27me3 histon modifiering ⁷ (figur 1 A), men saknar den aktiva H3K4me3 histon modifiering ⁸ (figur 1B), en kromatin signatur vi kallade "envärd ^'7. Anrikning av antingen H3K27me3 eller H3K4me3 bestäms genom normalisering till en konstitutivt uttryckt cyklin A (CycA)-genen ^4.

Vidare chip profilerna för H3K27me3 och H3K4me3 nära TSSs av fyra klasser av differentiellt uttryckta gener är förenlig med funktionen hos varje histon modifiering. Såsom visas i figur 3A, är anrikning av H3K27me3 nedströms TSSs omvänt korrelerad med genexpression nivå. De tysta gener har den högsta H3K27me3 medanhöguttryckta gener inte har någon H3K27me3 bindning. Dessa data överensstämmer med den repressiva roll H3K27me3 på genuttryck. I motsats härtill visade anrikning av H3K4me3 runt TSSs den motsatta korrelationen med genexpression nivå (figur 3B), vilket överensstämmer med den aktiva roll H3K4me3 på genuttryck.

Figur 1. QPCR analys av Chip-ED DNA med antikropp mot antingen repressiva H3K27me3 histon modifiering (A) eller aktiv H3K4me3 histon modifiering (B) i odifferentierade cell-berikade bam mutant testiklar. (A) i Bam testiklar, differentieringsfaktorer gener (Mst87F, dj, fzo) anrikas med H3K27me3 repressiva histon modifiering. (B) Differentiering gener utarmas med H3K4me3 aktivt märke. Nivån av Chip DNA (ChIP DNA / ingång) på målgenen (Mst87F, DJ eller fzo) först normaliserades till Lev el av Chip DNA vid kontroll CycA genen. Felstaplar anger standardavvikelse från tre oberoende biologiska replikat.

Figur 2. UCSC genomet webbläsaren ögonblicksbilder av H3K27me3 och H3K4me3 anrikning över hela de genomiska regioner av (A) Mst87F (B) dj och (C) fzo, (D) CycA gener. Den inringade H3K27me3-anrikade regionen i (D) återspeglar kromatin status en överlappande gen CG7264, som är ringa uttrycks i Bam testiklar (RPKM = 1) men höggradigt uttrycks i vildtyp testiklar (RPKM = 130) ⁸ (chip-ff data från ^7). Prober som används i kvantitativ PCR-analys av chip resulterar i figur 1 är märkta i botten på varje tomt. Klicka här för att visa en större bild .

tp_upload/3745/3745fig3.jpg "/>
Figur 3. Chip-punkter profiler med H3K27me3 och H3K4me3 i Bam testiklar ^7. De fyra genen grupper (7,509 gener) klassificerades enligt deras genuttryck baserad på RNA-seq resultat ^8. De representativa klasser av gener ritas upp för anrikning av en viss histon modifikation, med sekvenser från 3kb uppströms till 3kb nedströms sina webbplatser transkription start (TSSs). Detta genererar en profil för anrikning av (A) H3K27me3 (K27) och (B) H3K4me3 (K4) Chip-punkter analyser i varje grupp. Klicka här för att visa en större bild .

Mångsidigheten av chip analyser som diskuteras i detta protokoll kan användas på olika vävnader, vilket ger en möjlighet att studera kromatinet staten i ett biologiskt relevant system. CHIP experiment med användning av celler från odlade system är bekvämt att utföra eftersom stora mängder av celler kan lätt erhållas. Däremot odlade celler inte nödvändigtvis celler i en multi-cellulär miljö. Genom att utveckla denna teknik använder dissekeras vävnad från levande djur, kan vi ta itu med många frågor som odlade celler inte kan.

Trots nyttan av detta protokoll, finns det flera varningar. Till exempel är det dissekerad vävnad fortfarande heterogen med flera olika celltyper. Medan relativt homogena celler kan erhållas i Drosophila vävnader såsom imaginal skivor, andra vävnader som tarmar, testiklar och äggstockar som alla innehåller begränsade adulta stamceller är heterogena. Denna komplikation kan vara partielltadresseras med kraftfulla Drosophila genetik. Till exempel, även om adulta stamceller förekommer i en liten population i vävnader som diskuterats ovan och är extremt svåra att isoleras i ett tillräckligt antal för ChIP analys kan stamcellspopulation vara anrikad med användning av genetiskt muterade bakgrund. Den bam genen är nödvändig för stamceller differentiering Drosophila könsceller härstamning ^5,6. Därför bam muterade gonader är en bra källa för berikade odifferentierade könsceller. Genom att utföra ChIP använda bam mutant, kan vi få en epigenomiska landskap i odifferentierade könsceller.