Endotelcelle Co-kulturen formidler Modning av Human embryonale stamceller til Bukspyttkjertelen insulinproduserende celler i en Regissert Differensiering Approach

1. Cell Vedlikehold

1. H1 hESC (WiCell) ble opprettholdt på hESC kvalifiserte matrigel belagt brønner med mTeSR1 media, med media endres hver dag. Brønnene ble belagt med fortynnet matrigel løsning, utarbeidet ved å legge til 300 mL av hESC matrigel i 25 ml DMEM: F12. 1 ml av denne matrigel løsningen ble lagt til hver brønn av en seks brønn plate, eller 400 mL lagt til hver brønn av en 12 brønn plate og lov til pels i 1 time ved romtemperatur. Celler ble mekanisk passaged ved en splitt forholdet 1:04 ved å skrape kolonier når de nådde mellom 1 og 1,5 i diameter.
2. RHMVEC (VEC teknologier) ble opprettholdt i MCDB-131 media med media endres annenhver dag. Celler ble splittet av trypsinization gang 80% samløpet ble nådd ved en splitt forholdet 1:3. Endotelceller mellom passasjer 3 og 7 ble brukt for denne studien.

2. Utarbeidelse av Stock Solutions

1. Activin A ble rekonstruert ved 50 mikrogram / ml i steril PBS inneholder 0,1% bovint serum albumin. Løsningen ble alikvoteres og oppbevart ved -20 ° C.
2. EGF ble rekonstruert ved 500 mikrogram / ml i steril 10 mM eddiksyre. Løsningen ble alikvoteres og oppbevart ved -20 ° C.
3. Insulin ble rekonstruert ved 10 mg / ml ved å tilsette syrnet H ₂ O (pH ≤ 2), utarbeidet av tillegg på 0,1 ml iseddik til 10 ml vann.
4. DAPT ble rekonstituert i DMSO på 18 mg / ml. Det ble videre fortynnet til 300 mM konsentrasjon i DMEM: F12, alikvoteres og lagret ved -20 ° C.
5. KAAD-Cyclopamine ble rekonstituert i DMSO på 5mg/ml. Det ble videre fortynnet til 2 mM konsentrasjon i DMEM: F12, alikvoteres og lagret ved -20 ° C.
6. All-trans retinsyre ble rekonstruert på 2,7 mg / ml i 95% etanol. Det ble videre fortynnet til 2mm konsentrasjon i DMEM: F12, alikvoteres og oppbevart ved -80 ° C.

3. Definitive endoderm (DE) og bukspyttkjertelen progenitor (PP) Induksjon

1. Når hMGP kolonier nådde mellom 1 og 1,5 mm i diameter, ble DE induksjon utført ved å legge DMEM: F12 supplert med B27, 0,2% BSA, 100 ng / ml activin A og 1 mM Wortmannin for 4 dager (dag 0-dag 4) med media endres hver dag.
2. Etter DE induksjon var fullført, ble bukspyttkjertelen stamfar induksjon indusert ved å endre media til DMEM: F12 supplert med B27, 0,2% BSA og KAAD-Cyclopamine på 0,2 mM konsentrasjon i 24 timer (Dag 4-Day 5).
3. Etter 24 timer media ble endret til DMEM: F12 supplert med B27, 0,2% BSA, KAAD-Cyclopamine på 0,2 mM konsentrasjon og all-trans retinsyre på 2 mM konsentrasjon i 3 dager med media endres hver dag (Dag 5-Day 8) .

4. Bukspyttkjertelen Modning

1. Etter PP induksjon, ble alle gruppene endret til modning media består av DMEM: F12 supplert med B27, 0,2% BSA, 10 mM nikotinamid, 25 mikrogram / ​​ml insulin, 30 nM Na ₂ SEO ₃ og 50 mikrogram / ​​ml transferrin for 2 days med media endres hver dag (Dag 8-Day 10).
2. Etter 2 dager i modning media, er det siste modningen trinnet utføres parallelt med flere ulike forhold for sammenligning. Differensiering ble indusert under følgende forutsetninger: (i) med hakket hemmer DAPT (ii) med co-dyrkingsmedier bare, uten endotelceller som kontroll og (iii) bruke kontakt co-kulturen med RHMVEC celler. Celler ble opprettholdt i DAPT eller co-kulturen media for en uke (Dag 10 Dag 17) med media endres hver dag.
   1. DAPT media ble utarbeidet ved å supplere modningen media med 30 mM DAPT. Celler i denne grupper ble først utsatt for å fullføre MCDB131 i 24 timer og deretter utsatt for DAPT media i 6 dager (dag 11-Day 17).
   2. Co-kultur media ble utarbeidet ved å supplere MCDB-131 media med B27, 0,2% BSA, 10 mM nikotinamid, 10 ng / ml EGF, 1 mikrogram / ml hydrokortison, 10 mg EndoGro, 90 mikrogram / ml heparin. For media kontroll tilstand de unike cellene ble utsatttil MCDB-131 komplett medium i 24 timer (Dag 10 Dag 11) etter som media ble endret til co-kultur media i 6 dager (dag 11-Day 17) (ingen endotelceller).
   3. For kontakt co-kulturen tilstand, ble millioner RHMVEC lagt til de unike cellene i komplette MCDB-131 media (VEC teknologier) for 24 timer (Dag 10 Dag 11) for å tillate vedlegg. Etter 24 timer media ble endret til co-kultur media i 6 dager (dag 11-Day 17) med media endres hver dag.

5. QRT-PCR-analyse

1. På slutten av hvert stadium av differensiering (endoderm, bukspyttkjertelen stamfar; moden holme) ble lysert og RNA ble ekstrahert ved hjelp NucleoSpin RNA II utvinning kit i henhold til produsentens anvisninger.
2. RNA kvalitet ble analysert ved å sjekke RNA absorbansen ved 260 nm og 280 nm, etterfulgt av RNA kvantifisering bruke en SmartSpec Plus spektrofotometer.
3. Revers transkripsjon ble utført ved hjelp ImProm II revers transkripsjon kdet i henhold til produsentens anvisninger. Alle reaksjonene ble utført med 100 ng av RNA.
4. QRT-PCR ble utført ved hjelp av Mx3005P QPCR system (Agilent) og Brilliant II SYBR Grønn QPCR mester blanding henhold til produsentens anvisninger. De primere som brukes er notert på bordet en. Initialisering trinnet ble utført ved 50 ° C i 2 minutter etterfulgt av 95 ° C i 10 minutter. 50 forsterkning sykluser ble utført som følger: 95 ° C i 30 sekunder, 54 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 1 minutt.
5. Fold endring av målet mRNA uttrykk enn udifferensierte celler ble beregnet ut fra CT verdier ved hjelp av følgende formler:
   ΔCT (Marker _i) = CT (Marker _i) - CT (GAPDH)
   Δ ΔCT (Marker _i) = ΔCT (Marker _i) (Sample) - ΔCT (Marker _i) (Udifferensiert celler)
   Relativ uttrykk (Marker _i) = ^2-ΔΔCT(Markør _i)

6. Immunocytochemistry

1. På slutten av hvert stadium av differensiering (endoderm, bukspyttkjertelen stamfar; moden holme) celler, fiksert i 4% formaldehyd i 15 minutter ved romtemperatur.
2. Faste celler ble permeabilized bruker 0,25% Triton X-100 (TX) i 15 minutter.
3. Ikke-spesifikk farging ble blokkert ved inkubasjon i 10% esel serum i 0,05% TX i 30 minutter.
4. Primær antistoff inkubering ble utført over natten ved 4 ° C i blokkering buffer ved anbefalt antistoff fortynning (se tabell 1).
5. Cellene ble vasket med 0,05% TX tre ganger i 5 minutter.
6. Sekundær antistoff inkubasjon ble utført en time ved romtemperatur i mørket med aktuelle antistoffer utvannet i blokkering buffer.
7. Cellene ble vasket med 0,05% TX tre ganger i 5 minutter.
8. Nuclear farging ble utført ved inkubasjon med Hoescht flekk 1:1000 fortynning i PBSi 5 minutter, etterfulgt av 3 vasker med PBS.
9. Faste og beiset celler ble fotografert med Olympus IX81 invertert mikroskop og Metamorph bildebehandlingsprogrammer.

7. Representative Resultater

Tilsetting av activin A og Wortmannin til udifferensiert hESC for 4 dager induserer definitive endoderm som bekreftes av Qrt-PCR-analyse for DE markører Sox17 og CXCR4, og Foxa2 og farging for Sox17 som illustrert i figur 2. Differensiering til bukspyttkjertelen stamceller etter tilsetting av cyclopamine og retinsyre ble bekreftet av Qrt-PCR av pankreas progenitor markører og farging for Pdx1 som illustrert i figur 3.

På den siste etappen av differensiering, kontakt co-kulturen med RHMVEC celler sterkt indusert oppregulering av insulin uttrykk i de hESC avledet bukspyttkjertelen stamceller. Effektiviteten av co-kulturen mediert differensiering ble analysert ved comparing med kontroll tilstand ved hjelp DAPT. DAPT ble brukt som en positiv kontroll fordi det er for øyeblikket en av de mest brukte metodene for å oppnå bukspyttkjertelen modning. Siden co-kulturen ble utført i en modifisert media supplert med faktorer støttende av endotelceller, ble ytterligere kontroll utført med media i fravær av endotelceller å verifisere effekten av media på differensiering. Detaljer om denne analysen presenteres i figur 4.

Figur 1. Multi-stage protokoll for differensiering av hESC inn insulin uttrykke celler.

Figur 2. Definitive endoderm induksjon av humane embryonale stamceller. A) QRT-PCR analyse av representative DE markører i hESC celler eksponert for activin A og Wortmannin i 4 dager. Resultater ar e normalisert med hensyn til udifferensiert hESC. B) Sox17 farging (Green) og DAPI (blå) viser kjernefysisk uttrykk for Sox17. Scale bar: 50 mikrometer.

Figur 3. Bukspyttkjertelen stamfar induksjon av embryonale stamceller hentet endoderm celler. A) QRT-PCR analyse av tidlige pankreas markører i hESC avledet endoderm celler eksponert for cyclopamine og retinsyre i 4 dager etter DE induksjon. Resultater normalisert med hensyn til udifferensiert hESC. B) Pdx1 farging (fiolett) og DAPI (blå) viser kjernefysisk uttrykk for Pdx1. Scale bar: 50 mikrometer.

Figur 4. Bukspyttkjertelen modning scenen A) Qrt-PCR analyse av pankreas hormoner i hESC etter pankreas modning hjelp DAPT, kontakt co-kultur eller co-culture media (kontroll). Resultater normalisert med hensyn til udifferensiert hESC. p Verdiene er oppnådd ved student t-test. B) Co-kulturen med Dil-Ac-LDL merket RHMVEC (Red) viser områder hvor egenkapitalbevis festes til platen hvis det er tomrommene (øverst), kan andre RHMVEC finnes i direkte kontakt med differensierende ESC (nederst). C) C-peptid (Green) farging av celler differensiert bruk av co-kulturen metode. Scale bar: 12,5 mikrometer (øverst) og 50 mikrometer (nederst) D) farging av RHMVEC demonstrerer ikke insulin uttrykk i RHMVEC.

Tabell 1. Primere brukt for qPCR reaksjoner.

Under bukspyttkjertelen utvikling, differensierende bukspyttkjertelen celler er i umiddelbar nærhet med endotelceller fra aorta, og videre, bukspyttkjertel holmer er tett vascularized å fremme rask utveksling av blodsukker og holmen hormoner. Gitt disse fakta, er det ikke overraskende at endotelceller spiller en viktig rolle i prosessen med bukspyttkjertelen organogenesen. Mens betydningen av endotelceller under bukspyttkjertelen utvikling blir i økende grad verdsatt, er dens rolle i in vitro differensiering av embryonale celler mindre undersøkt. I vår tidligere rapport etablerte vi den positive rollen endotelceller på bukspyttkjertelen modning av mus embryonale stamceller ^13. I denne studien undersøker vi effekten av endotelceller signalering på differensierende humane embryonale stamceller.

Flere endotelceller ble brukt i denne protokollen, resulterte alle i lignende samlede effekten althouGH med variasjoner i effektivitet av differensiering. I dagens rapport presenterer vi effekten av co-dyrking hESC avledet bukspyttkjertelen stamceller med rotte hjerte mikrovaskulære endotelceller (RHMVEC). Endotelceller kan enkelt visualiseres ved AC-LDL flekker, som er spesifikk for bare endotelceller. Co-kulturen av de differensierende ESCs med pre-fargede endotelceller viste at mens de fleste av endotelceller var levedyktig i kultur for lengre tid, RHMEV gradvis forsvinne etter 4 dager og kunne ikke lenger påvises etter 6 dagers modning. Fravær av RHMVEC forenkler analysen ved å eliminere behovet for sortering, dermed ble valgt for optimalisering av co-kulturen protokollen.

Mens denne studien indikerer klart den positive effekten av endotelceller i induserende bukspyttkjertelen modning, er den eksakte mekanismen for slik induksjon fortsatt ukjent og blir nå undersøkt i laboratoriet vårt. En few plausible mekanismer kan være (i) effekten av celle-utskilt molekyler (ii) endotelcelle mediert hemming av hakk signalering (iii) rolle ekstracellulær matrix skilles ut av endotelceller. Mens den første kategorien ikke krever celle-celle kontakt, er slik kontakt obligatorisk for den andre og tredje kategori. Derfor har vi utført noen foreløpige analyser ved hjelp av ulike co-kultur konfigurasjoner: (i) kontakt co-kultur (ii) transwell co-kultur og (iii) betinget mediekultur. Det ble observert at kontakten co-kultur resulterte i maksimal differensiering, som bedømt av insulin uttrykk, etterfulgt av transwell co-kulturen, mens betinget mediekultur resulterte i minimal effekt på insulin uttrykk (data ikke vist). Disse analysene indikerer at mens celle-celle kontakt er viktig, kan det være noen kortlivede skilles molekyler som er viktig i tillegg.