Endotheelcel Co-cultuur Bemiddelt Rijping van menselijke embryonale stamcellen te Pancreatic insuline producerende cellen in een Geregisseerd Differentiatie aanpak

1. Celonderhoud

1. H1 hESC (WiCell) werden aangehouden op hESC gekwalificeerde Matrigel beklede putjes met mTeSR1 media, met de media veranderen elke dag. Wells werden bekleed met verdunde Matrigel oplossing, bereid door toevoeging van 300 ul hESC Matrigel in 25 ml DMEM: F12. 1 ml van deze Matrigel oplossing werd toegevoegd aan elk putje van een zes wei-plaat, en 400 pi aan elk putje toegevoegd van een 12 wei-plaat en men liet laag gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Cellen werden mechanisch gepasseerd bij een splitsingsverhouding van 1:4 door schrapen kolonies eenmaal bereikt tussen 1 en 1,5 mm diameter.
2. RHMVEC (VEC technologie) werd gehandhaafd in MCDB-131 media met media te veranderen om de andere dag. Cellen werden gesplitst door trypsinebehandeling als 80% confluentie werd bereikt bij een splitsingsverhouding van 1:3. Endotheelcellen tussen doorvoeropeningen 3 en 7 werden gebruikt voor deze studie.

2. Bereiding van de stam Solutions

1. Activine A werd opgelost bij 50 ug / ml in steriel PBS die 0,1% runderserumalbumine. De oplossing werd in hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C.
2. EGF werd opgelost in 500 ug / ml in steriel 10 mM azijnzuur. De oplossing werd in hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C.
3. Insuline is opgelost bij 10 mg / ml door toevoeging aangezuurd _H2O (pH ≤ 2) bereid door toevoeging van 0,1 ml ijsazijn 10 ml water.
4. DApt werd opgelost in DMSO bij 18 mg / ml. Voorts werd verdund tot 300 pM concentratie in DMEM: F12, in hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C.
5. KAAD-Cyclopamine werd opgelost in DMSO bij 5mg/ml. Er werd verder verdund tot 2 uM concentratie in DMEM: F12, in hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -20 ° C.
6. All-trans-retinoïnezuur werd gereconstitueerd met 2,7 mg / ml in 95% ethanol. Er werd verder verdund om 2mM concentratie in DMEM: F12, in hoeveelheden verdeeld en opgeslagen bij -80 ° C.

3. Definitieve Endoderm (DE) en pancreas Progenitor (PP) Inductie

1. Zodra hESC kolonies bereikt tussen 1 en 1,5 mm diameter, DE inductie uitgevoerd door het toevoegen DMEM: F12 aangevuld met B27, 0,2% BSA, 100 ng / ml Activin A en 1 uM wortmannine 4 dagen (dag 0-Dag 4) met media veranderen elke dag.
2. Na DE inductie was voltooid, werd de pancreas voorlopercellen inductie opgewekt door het veranderen van de media om DMEM: F12 aangevuld met B27, 0,2% BSA en KAAD-Cyclopamine bij 0,2 uM concentratie voor 24 uur (Dag 4-Dag 5).
3. Na 24 uur media werd veranderd in DMEM: F12 aangevuld met B27, 0,2% BSA, KAAD-Cyclopamine bij 0,2 uM concentratie en all-trans-retinoïnezuur op 2 uM concentratie voor 3 dagen met de media veranderen elke dag (Dag 5-Dag 8) .

4. Alvleesklier Rijping

1. Na PP inductie werden alle groepen gewijzigd rijping uit samengesteld DMEM: F12 aangevuld met B27, 0,2% BSA, 10 mM nicotinamide, 25 ug / ml insuline, 30 nM Na ₂ SeO ₃ en 50 ug / ml transferrine 2 degen met media veranderen elke dag (Dag 8-Day 10).
2. Na 2 dagen in rijping media, wordt de definitieve rijping stap parallel uitgevoerd met behulp van verschillende voorwaarden voor een vergelijking. Differentiatie werd geïnduceerd onder de volgende voorwaarden: (i) met uitsparing inhibitor dApt (ii) door middel van co-cultuurmedia zonder enige endotheelcellen als controle en (iii) met contact co-kweek met RHMVEC cellen. De cellen werden gehandhaafd in dApt of co-voedingsbodems voor een week (Dag 10-daagse 17) met de media te veranderen elke dag.
   1. DApt media werd voorbereid door aanvulling van de rijping media met 30 uM dApt. Cellen in deze groepen eerst blootgesteld aan MCDB131 voltooien 24 uur en vervolgens blootgesteld aan dApt media gedurende 6 dagen (Dag 11 Dag-17).
   2. Co-cultuurmedia werd bereid door toevoeging MCDB 131 media B27, 0,2% BSA, 10 mM nicotinamide, 10 ng / ml EGF, 1 pg / ml hydrocortison, 10 mg EndoGro, 90 ug / ml heparine. Voor de controle op de toestand van de differentiërende cellen werden blootgesteldaan MCDB 131 compleet medium gedurende 24 uur (Dag 10 Dag-11), waarna het medium werd co-cultuurmedia veranderd 6 dagen (Dag 11 Dag 17) (geen endotheelcellen).
   3. Voor contact co-cultuur staat, is een miljoen RHMVEC toegevoegd aan de differentiërende cellen in volledige MCDB-131 media (VEC technologieën) voor 24 uur (Dag 10-daagse 11) naar bijlage toe te staan. Na 24 uur media werd veranderd in co-cultuur media voor 6 dagen (Dag 11-Day 17) met de media te veranderen elke dag.

5. qRT-PCR analyse

1. Aan het einde van elk stadium van differentiatie (endoderm, pancreas progenitor, volwassen eiland) werden gelyseerd en RNA werd geëxtraheerd met NucleoSpin RNA II extractie kit volgens de fabrikant.
2. RNA kwaliteit werd geanalyseerd door controle RNA absorptie bij 260 nm en 280 nm, gevolgd door RNA met een kwantificering SmartSpec Plus spectrofotometer.
3. Omgekeerde transcriptie werd uitgevoerd met ImProm II reverse transcriptie kHet volgens de instructies van de fabrikant. Alle reacties werden uitgevoerd met 100 ng RNA.
4. qRT-PCR werd uitgevoerd met behulp van de Mx3005P QPCR systeem (Agilent) en Brilliant II SYBR Green QPCR master mix volgens de instructies van de fabrikant. De gebruikte primers staan ​​in tabel 1. De initialisatie stap werd uitgevoerd bij 50 ° C gedurende 2 minuten, gevolgd door 95 ° C gedurende 10 minuten. 50 amplificatie cycli uitgevoerd als volgt: 95 ° C gedurende 30 seconden 54 ° C gedurende 30 seconden 72 ° C gedurende 1 minuut.
5. Voudige verandering van target mRNA expressie dan ongedifferentieerde cellen werd berekend op basis van CT-waarden met behulp van de volgende formules:
   ΔCT (Marker _i) = CT (Marker _i) - CT (GAPDH)
   Δ ΔCT (Marker _i) = ΔCT (Marker _i) (Sample) - ΔCT (Marker _i) (ongedifferentieerde cellen)
   Relatieve expressie (Marker _i) = ^2-ΔΔCT(Marker _i)

6. Immunocytochemie

1. Aan het einde van elk stadium van differentiatie (endoderm, pancreas progenitor, rijpe eilandjes) cellen werden gefixeerd in 4% formaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
2. Gefixeerde cellen werden gepermeabiliseerd met 0,25% Triton X-100 (TX) gedurende 15 minuten.
3. Niet-specifieke kleuring werd geblokkeerd door incubatie in 10% ezel serum van 0,05% TX gedurende 30 minuten.
4. Primaire antilichamen incubatie werd overnacht uitgevoerd bij 4 ° C in blockbuffer bij de aanbevolen verdunning antilichaam (zie tabel 1).
5. Cellen werden gewassen met 0.05% TX driemaal gedurende 5 minuten.
6. Secundair antilichaam incubatie werd uitgevoerd gedurende een uur bij kamertemperatuur in het donker met geschikte antilichamen verdund in blokkeringsbuffer.
7. Cellen werden gewassen met 0.05% TX driemaal gedurende 5 minuten.
8. Nucleaire kleuring werd uitgevoerd door incubatie met Hoescht vlek op 1:1000 verdunning in PBS5 minuten gevolgd door 3 wasbeurten met PBS.
9. Vaste en gekleurde cellen werden afgebeeld met behulp van Olympus IX81 omgekeerde microscoop en Metamorph imaging software.

7. Representatieve resultaten

Toevoeging van Activin A wortmannine te ongedifferentieerde hESC 4 dagen induceert definitieve endoderm zoals bevestigd door qRT-PCR analyse voor DE markers Sox17, CXCR4 en Foxa2 en immunokleuring voor Sox17 zoals geïllustreerd in figuur 2. Differentiatie de alvleesklier progenitorcellen na toevoeging van cyclopamine en retinoïnezuur werd bevestigd door PCR-qRT van pancreatische progenitor merkers en Immunokleuring voor Pdx1 zoals in figuur 3.

In de laatste fase van differentiatie, contact opnemen met co-cultuur met RHMVEC cellen sterk geïnduceerde opregulatie van insuline tot uitdrukking in de hESC afgeleid pancreas progenitorcellen. De efficiëntie van co-kweek gemedieerde differentiatie geanalyseerd door comparing met controle toestand en met behulp dApt. DApt werd gebruikt als een positieve controle omdat het momenteel de meest gebruikte methoden pancreas rijping te bereiken. Aangezien de co-kweek werd uitgevoerd in een gemodificeerde media aangevuld door factoren ondersteunen endotheelcellen werd extra controle die de media in afwezigheid van endotheelcellen het effect van media differentiatie verifiëren. Details van deze analyse worden in figuur 4.

Figuur 1. Meertraps protocol voor differentiatie van hESC in insuline expresserende cellen.

Figuur 2. Definitieve endoderm inductie van menselijke embryonale stamcellen. A) qRT-PCR analyse van representatieve DE markers in hESC cellen blootgesteld aan Activin A wortmannine gedurende 4 dagen. Resultaten ar e genormaliseerd met betrekking tot de ongedifferentieerde hESC. B) Sox17 kleuring (groen) en DAPI (blauw) geven de nucleaire expressie van Sox17. Schaal bar: 50 urn.

Figuur 3. Pancreas voorlopercellen inductie van de embryonale stamcellen afgeleid endoderm cellen. A) qRT-PCR analyse van de eerste pancreas markers in hESC verkregen endoderm cellen blootgesteld aan cyclopamine en retinoïnezuur 4 dagen na DE inductie. Resultaten genormaliseerd met betrekking tot de ongedifferentieerde hESC. B) Pdx1 kleuring (violet) en DAPI (blauw) geven de nucleaire expressie van Pdx1. Schaal bar: 50 urn.

Figuur 4. Pancreatic rijping stadium A) qRT-PCR analyse van de pancreas hormonen in hESC na pancreas rijping met dApt, neem dan contact co-cultuur of co-cultuur media (controle). Resultaten genormaliseerd met betrekking tot de ongedifferentieerde hESC. P-waarden verkregen door student t-test. B) Co-cultuur met Dil-Ac-LDL gelabeld RHMVEC (Red) te tonen regio's waar de EC hechten aan de plaat als er lege ruimtes (boven), kunnen andere RHMVEC te vinden in direct contact met de onderscheidende ESC (onder). C) C-peptide (Groen) kleuring voor cellen gemaakt met behulp van co-cultuur-methode. Schaal bar: 12,5 micrometer (Top) en 50 micrometer (Onder) D) immunokleuring van RHMVEC toont geen insuline uitdrukking in de RHMVEC.

Tabel 1. Primers voor qPCR reacties.

Tijdens de pancreas ontwikkeling, waarbij een onderscheid pancreatische cellen zijn in de nabijheid met de endotheelcellen van de aorta, bovendien, pancreas-eilandjes zijn dicht gevasculariseerd voor een snelle uitwisseling van bloed glucose en eilandje hormonen te bevorderen. Gezien deze feiten, is het niet verwonderlijk dat de endotheliale cellen een belangrijke rol in het proces van de alvleesklier organogenese te spelen. Het belang van endotheelcellen in pancreas ontwikkeling steeds gewaardeerd, wordt de rol in vitro differentiatie van embryonale cellen minder onderzocht. In ons vorige verslag hebben we de positieve rol van endotheelcellen op de alvleesklier rijping van muis embryonale stamcellen ^13. In de huidige studie onderzoeken we het effect van endotheelcellen signalering op het onderscheiden van menselijke embryonale stamcellen.

Meerdere endotheelcellen werden in dit protocol, die resulteerde in gelijkaardige totale effect although met variaties van de efficiëntie van differentiatie. In het huidige rapport presenteren we het effect van co-kweken van hESC afgeleide pancreas voorlopercellen met rattenhart microvasculaire endotheelcellen (RHMVEC). Endotheelcellen kan geschikt worden gevisualiseerd door AC-LDL kleuring, die specifiek slechts endotheelcellen. Co-cultuur van de differentiërende SER met vooraf gekleurde endotheelcellen is gebleken dat het merendeel van de endotheelcellen waren levensvatbaar in kweek gedurende langere tijd geleidelijk RHMEV verdwijnt na 4 dagen niet meer worden waargenomen na 6 dagen rijping. Afwezigheid van de RHMVEC vereenvoudigt de analyse door het elimineren van de noodzaak voor het sorteren, dus werd gekozen voor optimalisatie van de co-cultuur protocol.

Terwijl de huidige studie geeft duidelijk aan het positieve effect van de endotheelcellen in het induceren van de alvleesklier rijping, het exacte mechanisme van deze inductie is nog onbekend en wordt momenteel onderzocht in ons laboratorium. Een few plausibele mechanismen zou kunnen zijn (i) het effect van cel-afgescheiden moleculen (ii) endotheelcellen gemedieerde remming van de inkeping signalering (iii) de rol van extracellulaire matrix uitgescheiden door de endotheelcellen. Terwijl de eerste categorie niet nodig cel-cel contact dergelijk contact is verplicht voor de tweede en derde categorie. Vandaar dat we enkele voorlopige analyses uitgevoerd met behulp van verschillende co-cultuur configuraties: (i) contact co-cultuur (ii) transwell co-cultuur en (iii) geconditioneerde media cultuur. Er werd waargenomen dat co-kweek contact geleid maximale differentiatie, beoordeeld door insuline expressie, gevolgd door transwell co-cultuur, terwijl geconditioneerde media cultuur resulteerde in een minimaal effect op insuline uitdrukking (gegevens niet getoond). Deze analyses geven aan dat terwijl de cel-cel contact is belangrijk, er misschien een paar korte duur uitgescheiden moleculen die van belang zijn ook.