Endothelial Cell Co-Kultur Vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen zu Pankreas-Insulin-produzierenden Zellen in einer gerichteten Differenzierung Ansatz

1. Zell-Wartung

1. H1 hESC (WiCell) wurden an menschlichen embryonalen Stammzellen qualifizierte Matrigel beschichteten Wells mit mTeSR1 Medien gepflegt, mit Medien täglich ändern. F12: Die Vertiefungen wurden mit verdünnter Matrigel Lösung, durch Zugabe von 300 ul hESC Matrigel in 25 ml DMEM beschichtet. 1 ml dieser Lösung wurde Matrigel in jede Vertiefung einer Platte mit sechs Vertiefungen gegeben, oder 400 ul in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte und man ließ die Beschichtung 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Zellen wurden mechanisch mit einer Split-Verhältnis von 1:4 durch Abkratzen Kolonien, wenn sie zwischen 1 und 1,5 mm im Durchmesser erreicht passagiert.
2. RHMVEC (VEC-Technologien) wurde im MCDB-131 Medien mit Medien verändern jeden zweiten Tag gepflegt. Die Zellen wurden durch Trypsinisierung aufgeteilt einmal 80% Konfluenz in einem Teilungsverhältnis von 1:3 erreicht wurde. Endothelzellen zwischen den Kanälen 3 und 7 wurden für diese Studie verwendet.

2. Herstellung von Stammlösungen

1. Activin A wurde bei 50 pg / ml in sterilem P rekonstituiertBS, enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin. Die Lösung wurde aliquotiert und bei -20 ° C gelagert
2. EGF wurde bei 500 pg / ml in sterilem 10 mM Essigsäure rekonstituiert. Die Lösung wurde aliquotiert und bei -20 ° C gelagert
3. Insulin wurde mit 10 mg / ml mit indem angesäuert H ₂ O (pH-Wert ≤ 2), durch Zugabe von 0,1 ml Eisessig zu 10 ml Wasser hergestellt rekonstituiert.
4. DAPT wurde in DMSO bei 18 mg / ml rekonstituiert. Es wurde weiter auf 300 pM Konzentration in DMEM verdünnt: F12, aliquotiert und bei -20 ° C
5. KAAD-Cyclopamin wurde in DMSO bei 5mg/ml rekonstituiert. Es wurde weiter auf 2 pM Konzentration in DMEM verdünnt: F12, aliquotiert und bei -20 ° C
6. All-trans-Retinsäure wurde mit 2,7 mg / ml in 95% Ethanol rekonstituiert. Ferner wurde auf 2 mM Konzentration in DMEM verdünnt: F12, aliquotiert und bei -80 ° C

3. Definitive Endoderm (DE) und Pankreas-Vorläuferzellen (PP) Induction

1. Einmal hESC Kolonien erreicht zwischen 1 und 1,5 mm im Durchmesser, wurde DE Induktion mit indem DMEM durchgeführt: F12 mit B27, 0,2% BSA, 100 ng / ml Activin A und 1 nM Wortmannin für 4 Tage (Tag 0-Tag 4) mit Medien ergänzt täglich ändern.
2. Nach DE Induktion beendet war, wurde Pankreas-Vorläuferzellen Induktion durch Veränderung der Medien zu DMEM induziert: F12 mit B27, 0,2% BSA und KAAD-Cyclopamin bei 0,2 pM Konzentration für 24 Stunden (Tag 4-Tage-5) ergänzt.
3. Nach 24 Stunden wurde auf Medien DMEM geändert: F12 ergänzt mit B27, 0,2% BSA, KAAD-Cyclopamin bei 0,2 pM Konzentration und all-trans-Retinsäure auf 2 pM Konzentration für 3 Tage mit den Medien jeden Tag ändern (Tag 5-Tages-8) .

4. Pankreas-Reifung

1. Nach PP Induktion wurden alle Gruppen zur Reifung Medien aus DMEM geändert: F12 mit B27, 0,2% BSA, 10 mM Nicotinamid, 25 ug / ml Insulin, 30 nM Na ₂ SeO ₃ und 50 pg / ml Transferrin für 2 d ergänztays mit Medien jeden Tag ändern (Tag 8-Tag 10).
2. Nach 2 Tagen in Medien Reifung wird die endgültige Reifung Schritt aus parallel unter Verwendung von verschiedenen Bedingungen zum Vergleich durchgeführt. (I) der Kerbe Inhibitor DAPT (ii) unter Verwendung von Co-Kulturmedium nur ohne endothelialen Zellen als Kontrolle und (iii) mit Kontakt Co-Kultur mit RHMVEC Zellen: Die Differenzierung wurde unter den folgenden Bedingungen induziert. Die Zellen wurden in DAPT oder Co-Kultur-Medien für eine Woche aufrecht erhalten (Tag 10-Tage-17) mit den Medien täglich ändern.
   1. DAPT Medien wurde durch eine Ergänzung der Reifung Medien mit 30 uM DAPT vorbereitet. Die Zellen in dieser Gruppe wurden zunächst ausgesetzt MCDB131 für 24 Stunden abzuschließen und dann zu DAPT Medien ausgesetzt für 6 Tage (Tag 11-Tage-17).
   2. Co-Kulturmedium wurde durch Hinzufügung MCDB-131 hergestellt Medien mit B27, 0,2% BSA, 10 mM Nicotinamid, 10 ng / ml EGF, 1 pg / ml Hydrocortison, 10 mg EndoGro, 90 ug / ml Heparin. Für die media control Zustand differenzierenden Zellen ausgesetzt waren,um MCDB-131 vollständig Weg für 24 Stunden (Tag 10-Tage-11), nach der die Medien, um die Zusammenarbeit Kulturmedien für 6 Tage (Tag 11-Tag 17) (keine Endothelzellen) geändert wurde.
   3. Für den Kontakt Co-Kultur Bedingungen wurde eine Million RHMVEC den differenzierenden Zellen in völliger MCDB-131 Medien (VEC Technologien) für 24 Stunden (Tag 10-Tage-11) zugegeben, um die Befestigung zu ermöglichen. Nach 24 Stunden wurde auf Medien Co-Kultur-Medien für 6 Tage (Tag 11-Tage-17) mit den Medien verändert sich täglich ändern.

5. qRT-PCR-Analyse

1. Am Ende jeder Phase der Differenzierung (Endoderm, Pankreas-Vorläuferzellen, reife Insel) wurden lysiert und RNA wurde unter Verwendung NucleoSpin RNA II-Extraktions-Kits nach den Anweisungen des Herstellers.
2. RNA-Qualität wurde durch Prüfen RNA Absorption bei 260 nm und 280 nm, gefolgt von RNA-Quantifizierung unter Verwendung eines SmartSpec Zzgl. Spektrophotometer analysiert.
3. Die reverse Transkription wurde unter Verwendung ImProm II reverse Transkription kes nach den Anweisungen des Herstellers. Alle Reaktionen wurden mit 100 ng RNA durchgeführt.
4. qRT-PCR erfolgte unter Verwendung des Mx3005P QPCR System (Agilent) und Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix nach Anweisungen des Herstellers. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die Initialisierung Schritt wurde bei 50 ° C für 2 Minuten bei 95 ° C für 10 Minuten. 50 Amplifikationszyklen wurden wie folgt durchgeführt: 95 ° C für 30 Sekunden, 54 ° C für 30 Sekunden und 72 ° C für 1 Minute.
5. Fache Änderung der Ziel-mRNA-Expression in undifferenzierten Zellen wurde aus CT-Werte nach folgenden Formeln berechnet:
   ΔCT (Markierung _i) = CT (Markierung _I) - CT (GAPDH)
   Δ ΔCT (Markierung _i) = ΔCT (Markierung _i) (Sample) - ΔCT (Markierung _i) (undifferenzierte Zellen)
   Relativen Expression (Markierung _i) = ^2-ΔΔCT_(Marker-i)

6. Immunzytochemie

1. Am Ende jeder Phase der Differenzierung (Endoderm, Pankreas-Vorläuferzellen, reife Insel-Zellen) wurden in 4% Formaldehyd für 15 Minuten bei Raumtemperatur fixiert.
2. Die fixierten Zellen wurden permeabilisiert mit 0,25% Triton X-100 (TX) für 15 Minuten.
3. Nicht-spezifische Färbung wurde durch Inkubation in 10% Eselserum in 0,05% für 30 Minuten blockiert TX.
4. Der primäre Antikörper Inkubation wurde über Nacht bei 4 ° C in Blocking-Puffer in der empfohlenen Antikörper-Verdünnung (siehe Tabelle 1).
5. Die Zellen wurden mit 0,05% TX dreimal für 5 Minuten gewaschen.
6. Sekundäre Antikörper-Inkubation wurde für eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln mit geeigneten Antikörpern in Blocking-Puffer verdünnt durchgeführt.
7. Die Zellen wurden mit 0,05% TX dreimal für 5 Minuten gewaschen.
8. Kernfärbung wurde durch Inkubation mit Hoechst durchgeführt Tinte in einer Verdünnung von 1:1000 in PBSfür 5 Minuten mit 3 Waschschritten mit PBS.
9. Fixierten und gefärbten Zellen wurden aufgenommen mit Olympus IX81 inversen Mikroskop und Metamorph Imaging-Software.

7. Repräsentative Ergebnisse

Die Zugabe von Activin A und Wortmannin undifferenzierte HES für 4 Tage induziert endgültigen Endoderm durch qRT-PCR-Analyse für DE Marker Sox17, CXCR4, und Foxa2 bestätigt und Immunfärbung auf Sox17 wie in 2 dargestellt. Abgrenzung zu Pankreas-Vorläuferzellen nach Zugabe von Cyclopamin und Retinsäure wurde durch qRT-PCR von Pankreas-Vorläuferzellen Marker und Immunfärbung für Pdx1 wie in 3 dargestellt bestätigt.

In der letzten Stufe der Differenzierung, wenden Sie sich Co-Kultur mit RHMVEC Zellen stark induziert Hochregulierung der Insulin-Expression in den humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen. Die Effizienz der Co-Kultur vermittelten Differenzierung wurde durch die gleichzeitige Analysemparing mit Kontrollbedingung mit DAPT. DAPT wurde als positive Kontrolle verwendet, da es derzeit eine der am häufigsten verwendeten Verfahren zur Reifung Pankreas zu erreichen. Da die Co-Kultur in einem modifizierten Medienstroms durch Faktoren unterstützt Endothelzellen ergänzt durchgeführt wurde, wurde zusätzliches Steuerelement mit den Medien in Abwesenheit von Endothelzellen, um die Wirkung von Medien auf die Differenzierung zu verifizieren. Details zu dieser Analyse sind in Abbildung 4 dargestellt.

Abbildung 1. Mehrstufige Protokoll für die Differenzierung von hES in Insulin exprimierenden Zellen.

2. Definitive Endoderm Induktion von humanen embryonalen Stammzellen. A) qRT-PCR-Analyse der repräsentativen DE Marker in HES Zellen, die A und Wortmannin für 4 Tage Activin. Ergebnisse ar e, bezogen auf undifferenzierte HES normalisiert. B) Sox17 Färbung (grün) und DAPI (blau) zeigen nukleare Expression von Sox17. Maßstab: 50 um.

Abbildung 3. Pankreas-Vorläuferzellen Induktion des embryonalen Stammzellen abgeleitet Entodermzellen. A) qRT-PCR-Analyse der frühen Pankreas-Marker im HES abgeleitet Entodermzellen ausgesetzt Cyclopamin und Retinsäure für 4 Tage nach der DE Induktion. Die in Bezug auf undifferenzierte HES normalisiert. B) Pdx1 Färbung (violett) und DAPI (blau) zeigen nukleare Expression von Pdx1. Maßstab: 50 um.

Abbildung 4. Pancreatic Reifung Stufe A) qRT-PCR-Analyse von Pankreas-Hormone im menschlichen embryonalen Stammzellen nach Pankreas-Reifung mit DAPT, wenden Sie sich Co-Kultur-oder Co-Kultur-Medien (Kontrolle). Die in Bezug auf undifferenzierte HES normalisiert. p erhaltenen Werte von Student t-Tests. B) Co-Kultur mit Dil-Ac-LDL beschriftet RHMVEC (Rot) zeigen Regionen, in denen ECs auf den Teller legen, wenn es leere Räume (oben) sind, können andere RHMVEC in direkten Kontakt mit der differenzierenden ESC (unten) zu finden. C) C-Peptid (grün) Färbung für Zellen differenziert mit Co-Kultur-Methode. Maßstab: 12,5 um (oben) und 50 um (unten) D) Immunfärbung von RHMVEC zeigt kein Insulin Ausdruck in der RHMVEC.

Tabelle 1. Primer für die qPCR-Reaktionen verwendet.

Während Bauchspeicheldrüsenentwicklung sind Differenzieren Pankreaszellen in unmittelbarer Nähe mit Endothelzellen aus der Aorta, ferner sind Pankreasinseln dicht vaskularisiert raschen Austausch von Blutglukose und Inselhormone zu präsentieren. Angesichts dieser Tatsachen ist es nicht verwunderlich, dass Endothelzellen eine wichtige Rolle im Prozess der Organogenese Pankreas spielen. Während die Bedeutung von Endothelzellen während der Pankreas-Entwicklung wird zunehmend geschätzt wird seine Rolle bei der in vitro Differenzierung von embryonalen Zellen weniger untersucht. In unserem früheren Bericht gründeten wir die positive Rolle der endothelialen Zellen der Bauchspeicheldrüse auf die Reifung von embryonalen Stammzellen der Maus ^13. In der aktuellen Studie untersuchen wir die Wirkung von Endothelzellen Signalisierung auf die Differenzierung humaner embryonaler Stammzellen.

Mehrere Endothelzellen in diesem Protokoll verwendet wurden, führte die alle in ähnlicher Gesamteffekt although mit Variationen in der Effizienz der Differenzierung. Im aktuellen Bericht stellen wir die Wirkung von Co-Kultivierung embryonaler Stammzellen abgeleiteten Pankreas-Vorläuferzellen mit Rattenherz mikrovaskulären Endothelzellen (RHMVEC). Endothelzellen können bequem visualisiert AC-LDL-Färbung, die spezifisch für nur Endothelzellen. Co-Kultur der Differenzierung Regler mit vorgefärbten endothelialen Zellen zeigte, dass die meisten der Endothelzellen in Kultur lebensfähigen für längere Zeit, die RHMEV allmählich nach 4 Tagen nach der Impfung und nicht mehr nach 6 Tagen der Reifung nachgewiesen werden. Die Abwesenheit des RHMVEC vereinfacht die Analyse, indem die Notwendigkeit für die Sortierung, daher wurde für die Optimierung der Co-Kultur-Protokoll gewählt.

Obwohl die vorliegende Studie zeigt deutlich die positive Wirkung von Endothelzellen in induzierende Pankreas Reifung, ist die genaue Mechanismus dieser Induktion noch unbekannt und wird derzeit in unserem Labor untersucht. Ein Few plausible Mechanismen könnten (i) die Wirkung von Zell-Moleküle sezerniert (ii) Endothel-Zell-vermittelte Inhibition der Notch-Signalweg (iii) die Rolle der extrazellulären Matrix von den Endothelzellen sezerniert. Während die erste Kategorie nicht erforderlich ist Zell-Zell-Kontakt, ist ein solcher Kontakt notwendig für die zweiten und dritten Kategorie. Daher führten wir einige vorläufige Analyse mit verschiedenen Co-Kultur-Konfigurationen: (i) Kontakt Co-Kultur (ii) Transwell Co-Kultur und (iii) konditionierten Medien Kultur. Es wurde beobachtet, dass der Kontakt Co-Kultur in der maximalen Differenzierung in Folge, wie durch Insulinexpression beurteilt, gefolgt von Transwell Co-Kultur, während konditionierten Medien Kultur zu einer minimalen Wirkung auf Insulin Ausdruck (Daten nicht gezeigt). Diese Analysen zeigen, dass während der Zell-Zell-Kontakt ist wichtig, könnte es einige kurzlebige Moleküle, die abgesondert ebenso wichtig sind.