Isolering av bröstepitelialceller celler från tre-dimensionell Mixed-cell sfäroid Co-kultur

1. Upprätta Tredimensionella Samkulturer

1. Dagen före fastställande av samodlingar, avlägsna Matrigel från frysen och upptining på is i en 4 ° C kylskåp över natten.
2. På dagen för experimentet, framställa ett medium för samodling, som motsvarar mediet för de epiteliala cellerna som skall användas (HMEC medium i detta exempel: DME/F12-medium med 10% bovint kalvserum, 5 | ig / ml insulin , 1 ^ g / ml hydrokortison och 1 ng / ml EGF). Hålla mediet på is under minst 1 timme före blandning med Matrigel.
3. Att späda den tinade Matrigel, bestämma den totala önskade mängden av Matrigel: medel (300 | il per brunn för 24-brunnsplattor) och tillsätt halv att volymen av iskall HMEC-medium till ett sterilt rör på is. Tillsätt sedan samma halv-total volym av upptinad Matrigel till röret för att åstadkomma en 1:1 utspädning. Hålla röret på is.
4. Ställe 50 | il av Matrigel: mediumblandningen mitten väl i utsedda brunnar i en 24-brunnsplatta ochinkubera under 10 min i en 37 ° C inkubator med fuktad luft och _5% CO2.
5. Tillsätt en ytterligare 450 | il av Matrigel: medel blandningen till brunnarna och inkubera under ytterligare 60 minuter.
6. Under inkubationen framställa en 1:1 suspension av fibroblaster (här h-TERT-immortaliserade Reduction Mammary Fibroblaster som uttrycker GFP) och epitelceller (här h-TERT-immortaliserad human bröstepitelialceller cellinje som uttrycker RFP) vid en koncentration av 0,5 x 10 ⁵ celler vardera i 0,5 ml av HMEC-medium.
7. Efter 60 minuters inkubering steg försiktigt släppa cellsuspensionen på toppen av den stelnade gelén, och återgå kulturen till inkubatorn.
8. Stör inte kulturerna under 2 dagar. Därefter kan mediet bytas var 2-3 dagar genom att mycket försiktigt suga medium från sidan av brunnen och försiktigt ersätta med nytt HMEC medium.
9. Övervaka sfäroid formation dagligen under mikroskop. Kulturer är i allmänhet mogna efter 10-14 dagar. Bilden somlämpligt att använda ljus eller fluorescerande mikroskopi. Sfäroid storlek och utsprånget längd kan mätas under ljusmikroskop.

2. Isolering av celler från sfäroid Samkulturer

1. Mycket försiktigt pipettera kulturen upp och ner 10x med en steril 2-ml glaspipett. Alternativt skära av toppen av en 1000 mikroliter plastpipett tips med sax steriliseras genom autoklavering eller nedsänkning i 70% etanol för att pipettera odlingen. Överföra kulturen med antingen glaspipett eller den skurna plast pipettspetsen till en steril 15 ml centrifugrör och centrifugera under 5 min vid 2000 rpm vid rumstemperatur. De cellulära sfäroider sedimenterar vid botten.
2. Använd en steril Pasteur pipettspets att försiktigt ta bort störde Matrigel från toppen av den centrifugerade röret.
3. Tillsätt 1 ml HMEC-medium till de pelleterade sfäroider, pipettera upp och ner 2-3 gånger med en steril 2 ml glaspipett, och överföra den kultur till en brunn i en 24-brunnarsvävnadsodlingsplatta.
4. Låt sfäroiderna att fästa skålen på minst 48 timmar före ändra mediet. Med tiden cellerna kommer att lämna de sfäriska strukturer och växa som monoskikt.
5. Passage av cellkulturer när cellerna når 50% konfluens. Första expandera kulturen till en 35 mm skål (ungefär 2-4 dagar), och sedan till en 100 mm skål (ungefär 3-5 dagar). Omedelbart före varje passage steg använda ett sterilt pasteurpipett att manuellt ta bort så många återstående "Ghost sfäroiderna" som möjligt.
6. Analysera celler genom flödescytometri för populationen renhet med användning av lämpliga markörer på cellytan och ytterligare separera olika cellpopulationer genom fluorescens cellsortering om nödvändigt. De isolerade cellerna är nu redo för ytterligare analys om så önskas.

3. Representativa resultat

I tredimensionell sfäroid samkulturer, fibroblaster med konstruerade Tiam1 tystande inducera ökad invasion in matrix genom bröstepitelialceller (figur 1, jämför D, E, F till A, B, C). Fibroblaster med konstruerade överuttryck av Tiam1 framkalla minskade matrix invasion av bröstcancer cellinje SUM159 (figur 1, jämför J, K, L till G, H, I).

Gång samodlade sfäroider har fastställts, kan cellpopulationer isoleras från sfäroider genom att åter plätering i ett tvådimensionellt samband, som visas i figur 2. Beroende på de relativa tillväxten av de testade cellerna, kan rena populationer ut genom seriepassage (såsom visas i figur 3) eller kan sorteras med användning av lämpliga cellmarkörer. Efter isolering från 3D co-kultur, epitelceller behåller de egenskaper som följer av samodling med fibroblaster under längre perioder, vilket stora möjligheter för analys. I detta exempel inducerade exponering för Tiam1-brist fibroblaster ökad migration i samarbete odlade HMECs som kvarstod i veckorfter isolering från 3D co-kultur (Figur 4).

Figur 1. Avbildning av etablerade sfäroid samkulturer enligt ljus och fluorescensmikroskopi. Sfäroid kulturer är etablerade med bröstepitelialceller och fibroblast-cellinjer och fick växa i odling under 10-14 dagar. AF: epiteliala = HMEC-mCherry celler. GL: epitelceller = SUM159-mCherry celler. AC, GI: fibroblast = kontroll RMF-GFP-celler. DF: fibroblast = RMF-GFP med Tiam1 ljuddämpning. JL: fibroblast = RMF-GFP med Tiam1 över-uttryck. Pilar indikerar epiteliala prognoser invaderande i matris.

Figur 2. Serial avbildning av kulturer under ljus och fluorescensmikroskopi efter isolering från Matrigel kultur. Dag 0 representerar avbildning omedelbart efter isolering, dag 1, 2 och5 indikerar dagar efter isolering. Koronan av celler som lämnar de sfäroida ökar med tiden. Så småningom en "ghost" sfäroid med mycket få celler är (pil). Mycket få sfäroider kvar efter spöket bort och första passagen.

Figur 3. Flödescytometrianalys av celler efter isolering från Matrigel samodling. Efter sfäroid samkulturer har mognat, celler isolerade från 3D co-kultur med pipettering och seriepassage. Provalikvoter analyserades med flödescytometri (i detta exempel med användning av grön fluorescens och röd fluorescens för att identifiera GFP-uttryckande fibroblaster och mCherry-epitelceller respektive) för att bestämma relativa populationerna av epiteliala och fibroblastceller.

Figur 4. Transwell migration av HMECs kvarstår efter isolatividare från Matrigel co-kultur. När rena populationer har erhållits genom kultur eller fluorescens cellsortering, kan celler analyseras som önskas. Här migrering av HMECs samodlades med antingen kontroll (C) eller Tiam1 deficienta (SHT) fibroblaster runt perforerad transwell bedömdes vid 2, 4 respektive 8 veckor efter isolering från samodling.

Den metod som presenteras här representerar en enkel metod för att analysera effekterna av stromala fibroblaster på epitelceller, inklusive tumörcellerna. Den möjliggör direkt cell-cell-interaktion inom en tredimensionell sammanhang stöds av extracellulär basalmembranet matris, samtidigt som lätt utvinning av celler från matrisen för ytterligare analys. Detta kan appliceras på studien av tumörassocierad stroma, såsom fibroblastlinjer kan manipuleras för att påverka signalvägar för val och epiteliala linjer kan variera i invasiv potential, såsom visas i figur 1. 3D samodlingsmodell tillåter visuell kontroll av att förändringar i cellernas invasiv har inducerats. Isolering protokoll möjliggör extraktion av celler från de 3D kulturerna med ett minimum av hantering och undviker användningen av trypsin eller matris upplösande medel som kan påverka cellegenskaper. Effekterna av exponering för fibroblast i 3D samodling kvar i epitelceller akterER isolerat från 3D co-kultur, underlätta efterföljande analys (Figur 4). Medan exemplet visar effekter på cellmigrering kan alla test som gäller för celler som växer i 2D kan användas på de isolerade cellerna. Vi har använt denna metod för att analysera effekterna av olika fibroblast Tiam1 uttryck på beteendet hos tillhörande bröst epitelceller. Tiam1 brist i fibroblaster främjar bröst tumörceller invasion och metastasering i 3D kultur och djurmodeller tumör ^23. Denna metod har gjort det möjligt för oss att analysera potentiella inblandade vägar med molekylära, biokemiska och funktionella analyser (Liu och Buchsbaum, in press).

Det är viktigt att endast använda cellinjer i god hälsa och att vidhäfta till rigorös steril teknik i syfte att förhindra kontaminering av kulturer under processen. De bästa resultaten erhålles med användning av celler från början snarare än sena passager (exakt passagen antal kommer att variera beroende på den särskilic cellinje) och från celler skördas vid densiteter mellan 50-80% konfluens. Exakt hantering av Matrigel enligt protokollet är nyckeln för att underlätta både fullständig kondensering före upprättandet av co-kulturer och säkerställa fullständig stelning av matrisen före tillsats av cellerna. Otillräcklig mängd eller stelning av matrisen kommer att resultera i celler som växer som ett monoskikt i stället för sfäroiderna i kulturerna. När den först om upprättandet av sfäroiden samkulturer tillåter placering av en initial 50 ^ plugin i brunnen för fast förankring och mer enhetlig stelning av den slutliga matrisen, som är nyckeln till jämnt fördelad sfäroid formation. Avlägsnande av alla spök sfäroider vid efter isolering passage steg är kritiskt om automatiskt cellsortering skall användas för att separera blandade populationer. De exempel som visas här använda fenolrött fritt Matrigel med proteinkompositionen av ca 10 mg / ml. Fenol-röda utan förberedelser medger färgavkänning i ASSAys, såsom fluorescens.

Denna teknik kan appliceras på en mängd celltyper för att studera effekterna av stromala fibroblaster på tillhörande epitelcellsystem tumörer eller omvänt effekterna av tumörceller på förbundna fibroblaster. Denna teknik medger snabb utvärdering av in vitro-cell-modeller under flera villkor, och de motsvarande resultaten kan sedan jämföras med in vivo-djurmodeller vävnad såväl som humana vävnadsprover.