Studeren Mitotische Checkpoint door te laten zien Dynamic kinetochoor Protein Gedrag en Chromosoom Motion in Living

Maureen Sinclair, Jun-Yong Huang

Institute for Cell and Molecular Biosciences, University of Newcastle, United Kingdom

Sinclair, M., Huang, J. Y. Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos. J. Vis. Exp. (64), e3763, doi:10.3791/3763 (2012).

De assemblage van de spoel checkpoint (SAC)-mechanisme is een actief signaal, dat de interactie tussen chromosoom kinetochoren en spindel microtubuli bewaakt om anafase begin te voorkomen totdat de chromosomen goed zijn aangesloten. Cellen gebruiken dit mechanisme om aneuploidie of instabiliteit van het genoom, en dus kanker en andere ziekten bij de mens, zoals aangeboren afwijkingen en de ziekte van Alzheimer ^te voorkomen ^1. Een aantal van de SAC componenten zoals Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10 hebben Rod en Aurora B kinase geïdentificeerd en ze zijn allemaal kinetochoor dynamische eiwitten ^2. Er zijn aanwijzingen dat de kinetochoor is waar de SAC-signaal wordt gestart. De SAC belangrijkste doel is de regelgeving Cdc20. Cdc20 is een van de essentiële APC / C (A naphase B EVORDERING C omplex of C yclosome) activatoren ³ en is ook een kinetochoor dynamische eiwit ^4-6. Geactiveerd de SAC remt de activiteit van de APC / C om de vernietiging van twee belangrijke substraten, cycline B en securin te voorkomen, waardoor ze de metafase om de overgang ^7,8 anafase. Precies hoe de SAC signaal wordt geïnitieerd en gemonteerd op de kinetochoren en doorgegeven naar de APC / C voor de remming van de functie nog steeds ongrijpbaar blijft.

Drosophila een uiterst handelbaar experimentele systeem, een veel eenvoudiger en beter begrepen organisme ten opzichte van de menselijke maar die deelt fundamentele processen gemeen. Het is misschien een van de beste organismen om voor bio-imaging studies gebruikt in levende cellen, in het bijzonder voor de visualisatie van de mitotische gebeurtenissen in ruimte en tijd, zoals het vroege embryo gaat tot en met 13 snelle kerndeling cycli synchroon (8-10 minuten voor elke cyclus op 25 ° C) en geleidelijk verzorgt de kernen in een monolaag net onder de cortex ^9.

Hier presenteer ik een bio-imaging methode met behulp van transgene Drosophila Expressing GFP (Groen fluorescent eiwit) of de variant gerichte eiwitten van interesse en een Leica TCS SP2 confocale laserscanning microscoop systeem de SAC functie vliegen te bepalen, door tonen beelden van GFP-eiwitten van enkele SAC componenten Cdc20 en Mad2 , als voorbeeld.

1. Transgene Vliegen en onderhoud

1. De transgene vliegen die in deze demonstratie UBQ-GFP-Cdc20 (II), UBQ-RFP-His2B (X *) UBQ-GFP-Cdc20 (II *) UBQ-GFP-Cdc20 (II *) mad2 ^EY ( III *) en UBQ-GFP-Cdc20 transgene vliegen werden eerder gegenereerd in het laboratorium via een standaard-element P gemedieerde transgene benadering ^10,11 en UBQ-RFP-His2B een vriendelijke schenking van Yohanns Belaïche op UMR 144 CNRS / Institute Curie, Parijs, Frankrijk. Ze werden in een Mad2 mutant achtergrond via een standaard Drosophila genetica. De mad2 ^EY originele mutant lijn werd gekocht van de Bloomington voorraad centrum. We zullen niet ingaan op de procedure die wordt gebruikt voor het verhogen van de transformanten in dit protocol.
   Opmerking: * vertegenwoordigt chromosomenaantal.
2. Onderhoud: Transgene vliegen werden bij 25 ° C in kunststof flesjes containing vliegen eten en met extra droge gist poeder op de top. Het flesje werd routinematig vervangen 3-4 weken afhankelijk teeltomstandigheden (figuur 1).

2. Fly Voedselbereiding (Lab schaal)

1. De juiste hoeveelheid van de vlieg voedsel mengsel werd verwarmd met constant voeren om de bestanddelen op te lossen.
2. Ongeveer 8-10 ml van dit medium werd verspreid als mest in elke plastic flacon (2,5 cm diameter x 8 cm lengte) met behulp van een Jencons Scientific Ltd peristaltische pomp.
3. Wanneer het voedsel slurry werd en afgekoeld tot kamertemperatuur wordt de flacon vervolgens aangesloten met een katoenen schuim plug. Deze voedingsmiddelen flesjes worden geplaatst in een bak die vervolgens wordt afgesloten in een plastic zak en bewaard bij 4 ° C voor later gebruik.

3. Kleinschalige Egg Collection

1. Ongeveer 50 paren van 2-3 dagen oude volwassen vliegen werden overgebracht naar een nieuwe vlieg voedsel flacon voorzien extra droge gist poeder op het oppervlak bij 25 ° C layIng embryo's.
2. De vliegen worden dan overgebracht naar een nieuwe flacon per uur en laten de embryo's flacon 30 minuten om een ​​aantal van de verzamelde embryo's van rond kerndeling cyclus 8-10 wanneer de kern geleidelijk migreren naar de schors en ingericht als een monolaag. Het eerste uur collectie is normaal gesproken weggegooid omdat het vaak bevat oude embryo's die werden vastgehouden in het vrouwelijke lichaam als de omstandigheden waren niet geschikt voor het leggen.

4. Voorbereiden Dekglaasjes en Dia's

1. Neem een ​​50 x 22 mm dekglaasje en licht de vier hoeken aan de ene kant nat te maken met een zeer kleine hoeveelheid water met een vochtige fijne pen penseel en zet het op een microscoopglaasje, zodat het dekglaasje niet beweegt als gevolg van de capillaire oppervlaktespanning door de dunne vloeistof film.
2. Breng een dunne strook van heptaan lijm over het midden van het dekglaasje, moet de heptaan verdampen in enkele seconden om de lijm te laten staan ​​dekglaasje aan.
3. Snijd een andere dekglaasje met een diamant pen in kleine vierkantjes (~ 1,5 mm ^2), pick-up een en plaats het op het ene uiteinde van de lijm strip (dit wordt gebruikt om de naald te openen wanneer micro-injectie is vereist) en bewaar de andere voor de toekomst gebruikt.
4. Neem een ​​ander objectglaasje en plak een stukje dubbelzijdig plakband ongeveer 2 cm lang om het vast en trek het deksel van papier. (Zie figuur 2A en B).

5. Dechorionate Embryo's

1. Breng de vliegen een verse voeding sluier en gebruik bevochtigde fijne pen borstel 50 eieren te brengen op de dubbelzijdige plakband op de slede met een geschikte hoeveelheid vloeistof om de eieren worden gespreid. Als de vloeistof verdampt is de eieren zal houden aan de tape.
2. Onder een stereomicroscoop druk de eieren een paar keer langs hun lange as met behulp van de buitenkant van een helft van een pincet voorzichtig totdat het chorion is gebroken en open, maar laat de embryo in de Chorion-shell om snelle uitdroging te voorkomen. Verder dit proces tot 10-20 van de eieren is behandeld (afhankelijk van het aantal van de eieren nodig voor een experiment).
3. De embryo kan dan worden opgevangen en uit het chorion schaal en zacht op de lijmstrook een voor een. De eieren kunnen worden geplaatst en hetzij afgestemd op de lange zijde van het embryo parallelle of anti-parallel aan de lange zijde van de lijmstrook afhankelijk als zij worden geinjecteerde.
4. De embryo's kunnen direct bedekt met een geschikte hoeveelheid Voltalef 10S olie (5:1 mengsel van Holocarbon 700 olie en 27 olie, Sigma) verder uitdroging voorkomen dat onmiddellijk imaging of in een kamer voor uitdroogtolerantie 3-8 minuten op uitdrogen ze verder afhankelijk van de vochtigheid in de ruimte en het doel van het experiment. De gedroogde embryo's moeten worden gedekt met de 10S olie waar nodig tot over-uitdroging te voorkomen als micro-injectie nodig is. (Zie afbeelding. 2C, D& E).

6. Imaging Embryo's

1. Time-lapse of enkele afbeeldingen van levende embryo's worden verzameld met behulp van een Leica TCS SP2 omgekeerde confocale microscopie-systeem met een HCX PL APO CS 40X 1.25 olie immersie objectief (60 of 100X doelstellingen kunnen worden gebruikt ook afhankelijk van het doel van het experiment, hoe hoger de vergroting gebruikte meer foto bleken optreedt).
2. Wanneer imaging meerdere fluoroforen, die overlappende spectra en samen in dezelfde embryo werd elke fluorescent eiwit Golflengte elkaar verzameld. De excitatie en emissie golflengtes beschikbaar op de Leica TCS SP2 systeem zijn: GFP, λ _Ex: 488 nm en λ _Em: 500-600 nm. RFP, λ _Ex: 543 nm en λ _Em: 555-700 nm.
3. Een enkel beeld is vaak verkregen als een gemiddelde van 2 scanlines met een gemiddelde van 2 frame-scans. Dit duurt minimaal 6,3 seconden te scannen een 512x512 pIxel beeld een gelijktijdige scanmodus en 15,44 seconden voor een sequentiële scanmodus en produceert een goede signaal-ruisverhouding. Deze tijden moeten worden gehouden bij het opzetten van de termijnen voor time-lapse beeld verzamelen.
4. De pinhole is normaal ingesteld tot 1-2 AU (luchtige eenheid), en het laservermogen is aangepast aan de laagst mogelijke niveau tot een aanzienlijke fotobleken te voorkomen.

7. Uitlokken van de SAC door Microinjecting de Embryowet met de juiste reagentia

1. Bereid de naald voor het experiment. Wij geven de voorkeur om de naald te trekken van gesiliconiseerde glazen capillairen (GC-100-10, Harvard) met behulp van de vlammende / bruin micropipet trekker (Sutter Instrument, Model: P-97) met parameters: warmte = 600, trek = 90, vel = 70 , del = 150.
2. Plantgat de naald met 1-2 ml van een geschikte concentratie van het reagens in injectie buffer met een fijne laad-tip (20 pl Eppendorf veel: W215818J).
3. Monteer de naald in de naald holder de microscoop met de persleiding verbonden met de Eppendorf injectie systeem.
4. Zoek een embryo onder de 40x objectief en vind de naald schaduw zonder dat het brandvlak door het bewegen van de naald in het midden van het gezichtsveld en geleidelijk verlagen van het naar de juiste brandvlak worden geplaatst.
5. Beweeg het embryo zachtjes de kleine kwadraat van de gebroken dekglaasje voorgemonteerd aan een uiteinde van de lijmstrook vinden. Heel voorzichtig beweeg de naald totdat hij raakt de rand van het kleine vierkante dekglaasje voorzichtig breekt open het.
6. Beweeg de embryo's in beeld en selecteer het embryo van de juiste leeftijd voor injectie. Ik Gewoonlijk injecteert het embryo op kerndeling cyclus bij 5-7, omdat dit voor de kernen naar buiten te migreren naar de cortex. De kerndeling fasen kan worden bepaald door een snel aftasten van de fluorescerende signalen van het GFP-Cdc20 of nucleaire signaal van de RFP-histon 2B voorafgaand aan injectie ^9.
7. Verplaats voorzichtig de Embryo in de buurt van de naald en stel het brandvlak voor zowel het embryo en de naald. Verplaats de embryo in de naald en spuit een druppel van het reagens in de gewenste positie en af ​​te stappen van de embryo (of volg de instructies voor het micro-injectie-systeem). De embryo wordt geïnjecteerd de achterste of de zijkant afhankelijk van het doel van het experiment.
8. Na injectie wordt het embryo klaar om te worden afgebeeld op het juiste moment. (Zie afbeelding 2F & G)

8. Representatieve resultaten

Figuur 1. Benodigde materialen: een. fijne pen borstel, b. pleintje gebroken glazen container, c. 22 x 50 mm dekglaasje, d. microscoopglaasje, e. dubbelzijdige plakband, f. droge gist poeder in reageerbuis met gaten op de deksel, g. gistgranule voor vlieg onderhoud h. vliegen voedsel flacon, i. helft van een pincet voor dechorionate embryo's j. een paar pincet, k. heptaan lijm vloeistof container (maatkolf).

Figuur 2. De diagrammen tonen de voorbereiding van de dekglaasjes en dia's in stap 4, embryo dechorionation in stap 5 en naald voorbereidingen voor micro-injectie in stap 7. A. De bovenste foto toont een dekglaasje met een strook heptaan lijm in het midden en een vierkant met gebroken dekglaasje vast aan een uiteinde. De onderste foto toont een microscoopglaasje met een dun laagje water op de vier hoeken een dekglaasje te houden. De reden voor het gebruik van een dia aan het dekglaasje te houden is om ongeveer dezelfde brandpuntsafstand als die gevonden te houden als je dubbelzijdig plakband op de dia's en dus het vermijden heroriëntatie van de microscoop terwijl je are ontleden en het overdragen van de embryo's tussen de band en dekglaasje aan. B. Een dia met een korte lengte van dubbelzijdig plakband aangebracht voordat de afpellen van de cover papier dat voor dechorionating het embryo. C. De foto links toont embryo's met intacte chorion schelpen met gemarkeerde voorste en achterste uiteinden, de foto rechts ziet u de embryo's in de gebroken schelpen chorion voordat ze werden overgebracht naar het dekglaasje met de lijm strip D & E Schema's tonen twee.. manieren voor het overbrengen, het plaatsen en uitlijnen van de dechorionated embryo's op lijmrillen. De embryo's werden gedekt door 10S olie na een passende uitdroging periode. F & G. Diagrams laten zien hoe je de punt van de naald en plaats hem zodanig te injecteren te openen.

Enkele of timelapse beelden verkregen bij de hierboven beschreven experimenten direct geanalyseerd met Leica software of opgeslagen in. TIF bestanden open format beschikbaar voor verdere kwantificering of bewerken van analyses met behulp van andere veel voorkomende beeldanalyse-programma's zoals Image J, Photoshop en Metamorph enz. Twee voorbeelden om dit te illustreren worden hieronder besproken:

Voorbeeld 1: Een time-lapse film (figuur 3) geeft de dynamische kinetochoor werving van GFP-Cdc20 en chromosoom beweging in het leven Drosophila syncytieel embryo's. De regio van de belangstelling van originele time-lapse sequence beelden was vastgesteld / gewijzigd en geautomatiseerde-batch omgezet met behulp van Photoshop-software. De film werd samengesteld met behulp van QuickTime-software.

Figuur 3. Een time-lapse filmpje toont de dynamische kinetochoor werving van GFP-Cdc20 en chromosoom beweging in het leven Drosophila syncytieel embryo's. (A) Time-lapse foto's werden genomen van een transgene syncytieel embryo co-expressie GFP-Cdc20 (in groen)en RFP-histon 2B (in rood) fusie-eiwitten en werden opgenomen met een Leica TCS SP2 confocale systeem bij 18 ° C tijdens de kerndeling cycli 7-8. Frames werden genomen om de 10 seconden. Het frame met de cellen al in profase wordt behandeld als de nul tijdstip ^10. Klik hier om de film te bekijken voor Figuur 3A . (B) GFP-Cdc20 gemakkelijk kan worden waargenomen op profase en prometafase kinetochoren (B3 & 4, witte pijlen) en blijft op de metafase en anafase kinetochoren (B5 & 6, witte pijlen). GFP-Cdc20 is uitgesloten van de interfase kern (White pijlpunt), het invoeren van de kern door vroege profase. Chromatine morfologie werden bepaald met behulp van co-expressie His2BmRFP als markers (B8-14). Bars = 5mm.

Voorbeeld 2: SAC functies kunnen worden bestudeerd door het manipuleren van de embryo's door microinjecting antilichamen, fluorescent gelabelde eiwitten of Chemical verbindingen van belang dat mogelijk in de SAC te activeren. Bijvoorbeeld injecteren colchicine de microtubules depolymeriseren zodat teweeg te SAC zoals in figuur 4 ^10.

Figuur 4. Mad2 is essentieel voor colchicine-ingeroepen SAC functie ^10. GFP-cdc20; mad2 ^{+ / +,} GFP-cdc20; mad2 ^EY (mad2 ^{- / -} null mutant) en GFP-mad2; mad2 ^EY embryo's werden behandeld met colchicine door micro-injectie. Time-lapse confocale beelden werden genomen voor (01, 07 & 13) of na injectie (02-06, bovenste panelen, 08-12, midden-panelen, 14-18, onderste panelen). GFP-Cdc20 (bovenste en middelste panelen) of GFP-Mad2 (onder) kinetochoor signalen werden gebruikt als celcyclus markers. Top paneel, de pijlen geven de gearresteerde kinetochoren in 02-06. Het gebied met een pijl in 01 blijkt dat voor colchicine behandeling GFP-CDC20 is uitgesloten van het einde van de interfase kern. Midden-paneel, in de afwezigheid van endogene Mad2, GFP-Cdc20 signalen nog steeds in en uit oscilleren van de kern, en op en naast de kinetochoren, hoewel cytokinese lijkt defect is, zoals verwacht in embryo's ontbreekt microtubuli, in aanwezigheid van colchicine (aangegeven met pijlen in 07-12) duidt op een mislukte SAC functie bij de arrestatie van cellen in reactie op colchicine behandeling. Scheiding van dochter kern niet in beeld 10. Onderste paneel, pijlpunten in 14-18 geven gearresteerd kinetochoren met de geaccumuleerde GFP-Mad2 fusie-eiwitten van de functionele GFP-Mad2 suggereren in redding van de SAC defect fenotype in Mad2 mutant embryo. Arrowhead in 13 geeft aan GFP-Mad2 accumulatie in een laat interfase kern. Bar = 5mm. De embryo's werden gemicroinjecteerd met ~ 1% ei volume van een 100mg/ml colchicine voorraadoplossing in 1 x PBS.

Het protocol hier beschreven is een generieke methode voor de beeldvorming vliegen Syncytieel embryo's met behulp van een Leica TCS SP2 confocale laser scanning microscoop en kan worden aangepast om andere microscoop systemen aan te passen en kan ook worden aangepast aan andere gen-functies met behulp van Drosophila syncytieel embryo's te bestuderen. Wij hebben dit protocol om veel aspecten van de assemblage van de spoel checkpoint, eiwit dynamiek en eiwit proteolyse het gebruik van transgene vliegen of polyklonale antistoffen tegen het eiwit lokalisatie in woon-of vaste monsters ^4,6,12-14 visualiseren te bestuderen.

Het is het eenvoudigst om de vliegen te houden in verse vlieg voedsel flacons bij het verzamelen van kleine aantallen (~ 10 - 100) van de eieren. Dit vermindert de moeite van het maken van en het voorbereiden van extra appelsap agarplaten en ei verzameling kamers, zoals beschreven in andere publicaties ^15,16. De toevoeging van een vierkant van gebroken glas dekglaasje aan een uiteinde van de lijmstrook op het dekglaasje maakt het veel gemakkelijkerom de naald te openen en vast te stellen de injectie volume door het aanpassen van de micro-injectie systeem instellingen, terwijl de naald wordt onder te dompelen in de 10S olie. De mate van uitdrogen van de embryo is belangrijk voor het succes van de injectie het voorkomen lekkage en handhaven van de embryo levensvatbaarheid bijzonder voor deze experimenten dat een lange tijdsperiode bij het omhoog of transformanten na injectie. Er is echter geen gouden regel hoe lang uitdroging vereist. Dit varieert van experiment om te experimenteren en is afhankelijk van de hoeveelheid ingespoten de oplossing en de vochtigheid van de werkomgeving.

De functies van een specifiek eiwit van belang kan worden gemanipuleerd door microinjecting specifieke eiwit-remmers, mono-of poly-klonale antilichamen tegen een specifiek eiwit, messenger RNA of fluorescent gelabelde peptiden in wild-type of een genetische mutatie achtergronden. Veel van deze mutant lijnen of GFP-gelabelde transgene lijnen zijn openbaar avbaar van Drosophila voorraad centra en de meeste van hen zijn genoteerd op Flybase ( http://flybase.org/~~V ) en kan worden gezocht voor online.

Wij hebben niets te onthullen.

Dit protocol is ontwikkeld onder een Wellcome Trust subsidie. Wij danken mevrouw Maureen Sinclair voor het behoud van de vlieg voorraden en de voorbereiding van de vlieg voedsel door de jaren heen. We willen ook graag aan de heer Michael Aitchison bedanken voor zijn hulp en technische ondersteuning bij de ontwikkeling van dit protocol.

1. Holland, A.J. & Cleveland, D.W. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 478-87 (2009).
2. Zekanowski, C. & Wojda, U. Aneuploidy, chromosomal missegregation, and cell cycle reentry in Alzheimer's disease. Acta Neurobiol. Exp. (Wars). 69, 232-53 (2009).
3. Buffin, E., Emre, D., & Karess, R.E. Flies without a spindle checkpoint. Nat. Cell Biol. 9, 565-72 (2007).
4. Tang, Z., Shu, H., Oncel, D., Chen, S., & Yu, H. Phosphorylation of Cdc20 by Bub1 provides a catalytic mechanism for APC/C inhibition by the spindle checkpoint. Mol. Cell. 16, 387-97 (2004).
5. Huang, J. & Raff, J.W. The disappearance of cyclin B at the end of mitosis is regulated spatially in Drosophila cells. EMBO Journal. 18, 2184-95 (1999).
6. Xia, G., et al. Conformation-specific binding of p31(comet) antagonizes the function of Mad2 in the spindle checkpoint. Embo. J. 23, 3133-43 (2004).
7. Lorca, T., et al. Fizzy is required for activation of the APC/cyclosome in Xenopus egg extracts. Embo. J. 17, 3565-75 (1998).
8. Howell, B.J., et al. Cytoplasmic dynein/dynactin drives kinetochore protein transport to the spindle poles and has a role in mitotic spindle checkpoint inactivation. J. Cell Biol. 155, 1159-72 (2001).
9. Foe, V.E. & Alberts, B.M. Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis. Journal of cell science. 61, 31-70 (1983).
10. Li, D., Morley, G., Whitaker, M. & Huang, J.Y. Recruitment of Cdc20 to the kinetochore requires BubR1 but not Mad2 in Drosophila melanogaster. Mol. Cell Biol. 30, 3384-95 (2010).
11. Karess, R.E. P element mediated germ line transformation of Drosophila. In: DNA cloning: A practical approach., Glover, D., ed., 2, IRL Press, Oxford, 121-141 (1985).
12. Wakefield, J.G., Huang, J.Y., & Raff, J.W. Centrosomes have a role in regulating the destruction of cyclin B in early Drosophila embryos. Current Biology. 10, 1367-70 (2000).
13. Huang, J.Y. & Raff, J.W. The dynamic localisation of the Drosophila APC/C: evidence for the existence of multiple complexes that perform distinct functions and are differentially localised. Journal of Cell Science. 115, 2847-56 (2002).
14. Raff, J.W., Jeffers, K. & Huang, J.Y. The roles of Fzy/Cdc20 and Fzr/Cdh1 in regulating the destruction of cyclin B in space and time. Journal of Cell Biology. 157, 1139-49 (2002).
15. Brust-Mascher, I. & Scholey, J.M. Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo. J. Vis. Exp. (31), e1382, DOI: 10.3791/1382 (2009).
16. Figard, L. & Sokac, A.M. Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (49), e2503, DOI: 10.3791/2503 (2011).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.