放射性的原位杂交检测组织不同的基因表达模式

Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue. J. Vis. Exp. (62), e3764, doi:10.3791/3764 (2012).

认识的时间，水平，细胞定位，一个基因表达的细胞类型，有助于我们了解基因的功能。这些功能都可以在原位杂交基因在细胞内完成。在这里，我们提出修改克莱顿等人 ^（1988）已成功地在实验室多年，特别是成年脊椎动物的大脑^2-5 原位杂交方法的放射性。长互补的RNA（cRNA的）探针的靶序列，可以检测低丰度转录^6,7。纳入到cRNA探针的放射性核苷酸允许进一步的检测灵敏度低丰度转录和定量分析，无论是由光敏感的X光片或乳液涂在组织。这些检测方法提供了一个长期的记录靶基因的表达。与非放射性探针冰毒消耗臭氧层物质，如地高辛标记的放射性探针杂交方法不需要使用的HRP-抗体和/或TSA试剂盒检测低丰度转录的多个扩增步骤。因此，这种方法提供了一个定量分析的信号强度和有针对性的表达量之间的线性关系。它可以同时处理100-200幻灯片。它的工作原理以及不同发育阶段的胚胎。最发育的基因表达研究使用整个胚胎和非放射性的方法，在^8,9部分，是因为胚胎组织比成人组织更脆弱，减少细胞间的凝聚力，使组织切片的细胞群之间的界限很难看到。相比之下，我们的放射性的方法，由于更大范围的灵敏度，是组织地区之间的基因表达的决议能够得到更高的对比度，使其更容易看到种群之间的界限。使用这种方法，研究人员可以揭示一种新发现的基因可能的意义，并进一步预测感兴趣的基因的功能。

1。组织准备

1. 收获的新鲜组织。对于禽流感的胚胎，小心地打开鸡蛋和一碟与1xPBS，两次清理胚胎。对于成人的大脑，迅速取出大脑，轻轻地用1×PBS。
2. 嵌入到一个嵌入式模具华侨城组织TEK的胚胎或成人的大脑，定向组织切片需要，并迅速冻结成乙醇和干冰的混合物，小心不要让块内的混合物块。
3. 切片冷冻样品在低温恒温器到10-12微米厚的部分。大脑和胚胎组织，最佳的切割温带至-20°C -18°C的范围内是
4. 超级加玻片上挂载的冰冻切片。
5. 在幻灯片中的部分储存在-80°C

2。放射性Riboprobes代（使用您的机构辐射安全程序）

1. 生成一个纯净的线性的DN你感兴趣的cDNA通过限制消化酶的RNA聚合酶从质粒DNA或RNA聚合酶启动子的结合位点插入PCR子网站包围的片段模板。它也有可能产生PCR片段与RNA聚合酶启动子3'和5'PCR引物的一部分。凝胶净化与GENECLEAN凝胶纯化试剂盒的限制或PCR产生的碎片。
2. 到0.5毫升的Eppendorf管中，加入0.5-1微克纯化的线性DNA模板，转录缓冲，数码地面电视，RNasin，AGC核苷酸混合溶液，核糖核酸酶自由水带来的音量所需的金额。然后加第³⁵ UTP和适当的RNA聚合酶，使无论是反义或感riboprobes。
3. 为1小时37℃水浴中孵育的混合物。添加另取RNA聚合酶和孵育另1个小时。
4. 添加3M醋酸钠溶液（总体积的0.1倍）和100％乙醇（2.5 FOLD总量）到Eppendorf管沉淀合成核糖核酸riboprobe。
5. 孵育在干冰或-80°C下15分钟或3个多小时，以协助降水。
6. 颗粒的RNA离心在4°C和30分钟在一个表上的Eppendorf离心机15000转。
7. 去除上清，用70％乙醇沉淀，挖掘用手指混合颗粒。
8. 颗粒的RNA再次离心4°C和30分钟15000转。
9. 由pipeting完全去除上清，然后加入40μL杂交液。拌匀由pipeting和。
10. 投入1微升的溶液3毫升的安全解决解决方案，在闪烁瓶中，拌匀，并测量在闪烁计数器计数。
11. 放置在-20°C的一个星期内使用的riboprobe Eppendorf公司。

3。组织处理

1. 在引擎盖，准备新鲜的PBS缓冲4％paraformaldehy约3-5°C以上室温的解决方案。地方幻灯片从-80°C储存在干冰上的金属架，引擎盖下的工作空间进行，然后将其放置到机架的4％多聚甲醛溶液，在室温下5分钟的孵育。
2. 在1×PBS洗3次（每浸1秒左右）约15骤降。
3. 在引擎盖上，使乙酰缓冲区和大力摇晃10秒内。立即倒入一个包含幻灯片机架托盘，孵育10分钟，以减少背景的riboprobe的结合。
4. 在2×SSPE的15骤降冲洗3次。
5. 70％，95％和100％乙醇2分钟，在每一步串行脱水（没有在引擎盖）。
6. 引擎盖下干燥至少10-15分钟的幻灯片。

4。杂交

1. 计算的riboprobe量（0.5-1×10 ⁶每幻灯片CPM）和杂交液（100μL每张幻灯片）所需的所有幻灯片。 prewaRM的riboprobe杂交组合，以65°C 5分钟变性的riboprobe的。
2. 吸取100μL杂交riboprobe解决方案在整个幻灯片线，使用盖玻片遍布均匀的组织和盖玻片。地方滑出水平，面对直立的金属架和地方机架到至少4小时65℃的油浴和最多16个小时，慢慢直立。油创建周围的盖玻片密封不透气。
3. 从油浴金属架和机架用纸巾擦拭周围多余的油。
4. 从覆盖的幻灯片和金属机架中含有氯仿，两次的玻璃或金属盘洗掉油。可以作为未来实验的第一^第二氯仿洗。
5. 转移到一个托盘机架覆盖幻灯片在0.1％β-巯基乙醇+ 2×SSPE的解决方案和移动数骤降和放松盖玻片和删除多余的杂交溶液溶解TION。
6. 转让机架新鲜的0.1％β-巯基乙醇+ 2 x SSPE的解决方案中涉及的幻灯片，然后取出盖玻片与解决方案，以防止刮伤组织切片中的核糖核酸酶自由钳。在一个托盘水平滑动机架持有人转移到新鲜机架裸露的幻灯片，在0.1％，2×SSPE的β-巯基乙醇溶液。
7. 只孵育新鲜的0.1％β-巯基乙醇的幻灯片机架+ 2 x SSPE的溶液在室温1小时，以去除多余的绑定RNA探针。弃掉此以前的水清洗解决方案，以及盖玻片，作为放射性废物。
8. 1预热2X SSPE的解决方案，在65°C间转移的机架用幻灯片，添加β-巯基乙醇的0.1％浓度的最后，并在65°C孵育1小时。放射性废物丢弃。
9. 转移和孵化机架预热0.1 x SPPE幻灯片两次在65°C间，每次30分钟。放射性物质的量中删除这一步是非常小的，这一步后不再被认为是过度的放射性废物。
10. 脱水70％的机架和幻灯片，95％和100％乙醇各2分钟。
11. 在引擎盖晾干至少30分钟的幻灯片。

5。放射性信号的可视化

1. 将干片成片盒，并在黑暗的房间里，放置在幻灯片的X射线胶片（柯达百玛士议员电影），并关闭磁带。确保幻灯片所面临的X射线胶片的药膜。 〜1-7天预计大量的成绩单上取决于暴露的幻灯片。
2. 制定标准显影液和定影液的X光片。杂交信号显示为黑色电影（暴露在银颗粒乳剂）（ 图1）。
3. 1. （可选）要确定细胞的决议和组织上的信号，幻灯片，需要蘸感光乳剂和counterstained。如果你想最终甲酚紫染液，然后delipidize由二甲苯在室温孵育5分钟，两次，1分钟，在100％，100％，95％，95％，70％，50％的乙醇水化的部分然后在去离子水。如果你不打算染色用染料，不需要delipidization，然后delipidization的是没有必要的。至少2-3个小时的引擎盖下的干片。
   2. 在黑暗的房间使用一个安全的光，舀出足够的柯达非关税壁垒乳液，以支付一半的幻灯片纵向（即组织）在玻璃容器中浸泡，然后融化在42°C的水浴20-30分钟。然后用蒸馏水以1:1的比例稀释。乳液的水平，现在应该包括它蘸的幻灯片时，幻灯片上的所有部分。如果你有很多幻灯片，你可能需要准备额外的乳液。
4. 到摊薄乳液浸在42℃水浴中，在一个封闭的光密封的容器中干浸幻灯片overnig幻灯片在漆黑的房间里，或在2-3小时的烤箱，在37°C，关灯，HT。
5. 转移到机架插槽幻灯片中含有干燥器的黑盒子，幻灯片小心，不能互相接触，从而创造文物。用黑色电工胶带密封的箱子的边缘，慢慢来防止静电引起的光火花，然后包裹在铝箔盒。存储的框，在4°C间从数天到数周（1天X射线胶片上的信号是类似乳液下5天）。
6. 温暖的幻灯片框1小时至室温。
7. 在暗室中，机架（或在一个金属架的地方幻灯片与幻灯片中删除，如果使用滑槽框）从箱子他们在柯达的D-19的开发和发展在16°C为3.5分钟。
8. 1分钟，洗净，在室温下的自来水发达的幻灯片。
9. 孵育在19°C两次，每次6分钟的幻灯片在定影液。灯可以开启期间第二定影液孵化。 运行在室温下至少30分钟的水冲洗的幻灯片，并从幻灯片的背面刮的乳液，而“湿”用刀片，以防止刮伤玻璃。
10. 5分钟与自来水中的0.3％的甲酚紫染色组织。
11. 在新鲜的自来水洗〜15逢低额外甲酚紫的解决方案。
12. 脱水：50％〜15逢低酒精溶液中每个幻灯片，70％，95％，95％，100％和100％的乙醇。
13. 在室温下5分钟孵育两次在二甲苯中的幻灯片。
14. 盖玻片用幻灯片和干燥过夜（> 16小时）在引擎盖覆盖幻灯片;将需要数天前的胶水是不够坚固，进一步清理幻灯片Permount中等。

6。产生暗场彩色图像

1. 如果必要，进一步清理多余乳液的润湿水，并用刀片刮，无组织（非coversliped的侧）后面的幻灯片。
<李> 80％的乙醇溶液冲洗幻灯片，轻轻擦拭1-2次，去除碎片和尘埃。
2. 采取暗场或明照明下的照片。 6.2和6.3的步骤可能要重复2-3次，以获得一个很好的无尘粒，很容易在解剖显微镜下看到在暗场图像。

7。代表结果

“第³⁵放射性探针杂交的组织切片原位杂交结果上观看的两个主要途径：1）X光片被放置在幻灯片或2）乳液涂幻灯片。第三种方法是使用phosphorimager屏幕放置在幻灯片，但我们尚未与本办法的决议感到满意。 X光片提供了一个快速的结果和分析的杂交整体状况。 X-射线胶片数据还揭示了广泛的解剖分辨率和可用于定量分析产品是^10。禽流胚胎后期头杂交的FOXP1和CoupTF2基因表达的反义探针X射线胶片图像的例子是在图1A和B，这两种基因是在特定的大脑细分高度丰富。一个质量好的X光片的结果应该是夏普（不模糊）和高信号背景比。一个朦胧的形象，可能是由于X-射线胶片与杂交组织玻片之间的不平衡接触。

对于乳液浸幻灯片，乳液含有光敏感的银组织作为apposed X射线胶片的塑料涂层的盐。在发展中国家，第³⁵曝光的银盐转换为金属银颗粒，很像在X光片，。然而，银矿床是直接在细胞的基因表达，可以在显微镜下观察和测量定性可见。金属银颗粒阻止直接光线通过明观下的黑点出现。甲酚紫染液出现紫色（ 图3A，3C，图4）。在暗场，银颗粒反射光线从侧面出现白点（ 图1C，1D，3B，3D）。在这种情况下，甲酚紫染色出现红色。在明，杂交信号更容易查看下在蜂窝分辨率高倍率，而在暗场，此外，杂交信号，可以在整个组织中的低倍率观看。的暗场的看法是，我们通常用它来显示整体的基因表达模式的方法。然而，相对快速的结果，从X光片获得，乳液浸幻灯片的需要更长的时间（几个星期），并获得背景更为敏感。

强大的背景有四种常见的来源：1）所有的X光片的背景通常做与开发商或定影液，或部分的曝光胶卷的问题; 2）玻片上的背景通常是由于洗涤或玻片的准备，如从商业来源或自制幻灯片不当silination问题; 3）乳液部分由于缺乏仔细杂交后的洗涤步骤，杂交温度过低，质量较差的杂交液，洗碗的多聚甲醛污染造成探针永久交联的背景曝光和发展的背景下，以及4）的组织，riboprobe退化，导致小分子非特异性标记组织，无效的DTT或β-巯基乙醇在交叉连接二硫化债券的S ^35-RNA探针组织，并等待对乙酰太长。醋酸酐和三乙醇胺混合秒内乙酰化解决方案的幻灯片，这是至关重要的。如果几分钟传递withouţ的解决方案添加到幻灯片，然后乙酰基不会被有效去除，然后绑定到非特异性的RNA。其他因素包括杂交超过20小时，这可能会产生太强烈的信号，并在幻灯片上，它封存在幻灯片上的杂交液，在清洗剂，导致组织的放射性点多余的油滴和幻灯片给黑暗的背景信号。如果有很多幻灯片（超过100片），加3 ^路氯仿洗或更改氯仿洗涤，其余的幻灯片上，以防止多余的油颗粒。组织处理不慎，即不冻结速度不够快（解剖后5-10分钟内）或解冻和重新冻结，也增加背景由于mRNA降解。小心，不要误解为背景的过度曝光。

有关乳液浸幻灯片的背景是可能的，因为它是高光敏感，并且需要在黑暗中长时间曝光。 COM周一背景的问题包括显影液和定影液温度太高。当温度超过19°C间，接近或高于室温温暖，得到更多的银粮背景。泄漏到一个暗室的光线照射到水平低会导致乳液背景。不洗定影液足够长的时间（至少30分钟，自来水），将离开定影液，然后用甲酚紫反应产生整个乳液褐色的沉淀。然而，如果幻灯片甲酚紫染色前固定后超过90分钟洗涤水不再，这可能会导致乳液变得松散，染色不佳的部分。如果没有足够的时间在30-90分钟窗口染色后固定和洗涤后的30分钟洗净，幻灯片，干隔夜的幻灯片，并进行甲酚紫染色第二天。一般来说，大多数的基因有特定的基因表达模式，而背景信号更均匀。

为探针特异性更好的诠释，应适用于控制感探头在几个相邻的部分。最有意义的探头不显示信号，但有些，当他们这样做，我们发现，它比反义信号往往是不同的。我们认为，这可能与反义合成或其他基因的基因组上的反义链。我们提出了一个例子，PAX6，反义探针（ 图2A和B）。反义链沿脑室区的前脑，小脑，如预期般的眼睛（ 图2A）标签，但意义上揭示LA贝林在视网膜色素层（ 图2B）。

探头尺寸，我们使用cDNA探针在300-5000个基点范围内的任何地方。探测不到300个基点的工作，但信号通常较弱。我们还没有尝试过探头超过5000个基点大。最好是从同一物种的组织使用的探针，如果可能的话。如果没有，我们交叉杂交探针对其他物种的部分路段和降低杂交和洗涤温度在3-5°C间基础上的同源性，如果已知增量。如果不知道，然后我们进行试验和错误的杂交和洗涤温度。如果温度降低过多，cDNA探针可以交叉杂交与其他基因跨物种或相似的序列，在¹¹种相同。在实践中，我们发现的cDNA〜95％相同或更大的组织中的mRNA的目标，严格的杂交和洗涤温度（65℃）条件下工作得很好。对于序列的响〜50范围内，可能需要降低到60°C〜85至94％相同，杂交和洗涤温度的ES

在大多数的步骤中使用的金属架的原因是使用氯仿洗涤和二甲苯。这两种有机物融化多种塑料。玻璃和塑料的某些类型的抗这些有机物。但是，玻璃很容易打破，将融化长期间接触有机物和一些塑料制品，起初有抗药性。

图1。放射自显影原位杂交图像，从X光片和乳液浸幻灯片。 （AB）的X射线胶片图​​像矢状斑胸草雀鸣鸟在胚胎第10天（一）FOXP1或（B）与明照明CoupTF2，在解剖显微镜下，杂交反义riboprobes整个头部部分。黑色，暴露谷物显示表达明确的电影离子。比例尺= 500微米。 （CD）的乳液蘸矢状斑胸草雀的整个头部部分的幻灯片图像，在孵化后第6天与义riboprobes杂交（三）FOXP1（四）CoupTF2解剖显微镜下，用暗视野照明。白，银颗粒暴露在上面显示的mRNA表达的组织乳液。红，甲酚紫染色。比例尺= 200微米。所有图片，是左边的喙嘴。一天，浸幻灯片​​3天暴露在X-射线胶片图​​像。 FOXP1探头是178个基点至1544年至1711年BP的m​​RNA; CoupTF2是545个基点至1-545 bp的部分基因。可以看出，内脑FOXP1表达丰富的mesopallium（男），纹状体（ST）和背侧丘脑（DT），而CoupTF2丰富的nidopallium（N）arcopallium（一），腹侧丘脑。暴露类型和年龄之间的表达有一致性。与浸幻灯片，但是，更高分辨率的标签被看作，三维组织界限，分支机构直接确定。这些和其他所有的文件显示图像是使用标准的65°C的紧缩杂交部分。

图2。比较反义和正义的标签显示不同的图案。 （一）反义链的PAX6表达在大脑中，尤其是脑室区（白色箭头）。显示的是整个头部矢状斑胸草雀在胚胎第12天的片X光片显影。 （二）相邻节义链的PAX6杂交揭示整个胚胎头没有背景表达，但明显表达反义链（黑色箭头）在视网膜色素层。虚线表示的整个大脑的轮廓。 ：小脑。

荣>图3。乳液浸幻灯片下旬萌芽阶段下的明场和暗场的意见，从斑胸草雀脑基因表达的原位信号。 （一）明场图像D1B表达在胚胎10天，从正常曝光的乳液。标签（黑），勉强可以看到在这个倍率。探头是625个基点至1-625 bp的部分基因。 （二）同第（一），但倍率切换视图显示标签的暗场（白）在纹状体（ST）和丘脑（TH）。 （三）明场图像Slit3表达在胚胎第12天从曝光过度乳化。标签（黑），可以很容易地看到。探头是779个基点，以1243年至2021年的mRNA部分。 （b）相同的部分，在（A）的放大倍率切换到暗场视图显示标签（白）在脊髓（SC），明的形象相匹配。延髓是面向左侧。 CB：小脑。

/ 3764/3764fig4.jpg“ALT =”图4“/>
图4。银粒在细胞水平上的决议。显示FOXP1在斑胸草雀脑mRNA的银颗粒（黑点），上述细胞在不同的大脑区域和年龄（甲酚紫）相比，低功耗影像图1A和1C的标签。 （一）对单个细胞的高丰度表达（黑色箭头）在成年斑胸草雀mesopallium。 （二）对单个细胞在同一节相邻nidopallium（黑色箭头），低丰度表达。 （C）最高FOXP1多细胞mRNA的表达在胚胎12天mesopallium（黑色箭头）。 （四）对细胞的低丰度表达（黑色箭头）在同一节相邻nidopallium。例如细胞与黄线盘旋。胚胎干细胞（C和D）是体积更小，更紧凑与成年细胞（A和B）。以来，有一些细胞和乳液之间的空间，面积暴露SI从S ³⁵探针的的绿儿颗粒略高于胞体面积大。比例尺= 10微米。

放射性原位杂交mRNA表达被广泛用于多种用途，包括研究区域组织的组织，细胞类型和脑功能活动^{2-5,10,12-14。}以后使用，其大脑中的mRNA表达是依赖于神经活动增加，活动相关的基因通常被称为即早基因的基因。与这些用途中，我们的方法已被应用于多个物种，包括鸟类，哺乳类动物（如人类），鱼类，两栖类动物;在多个组织，包括脑，皮肤，肌肉和多个年龄段，包括幼体/新生儿，青少年，成人，并在整个胚胎部分^{2,3,5,15-17。}我们的协议的特殊功能包括：（1）产生一个解剖特异性和特异性定量之间的平衡。量化基因表达的X射线胶片上，我们采取的数码照片的图像（如： 图1A和1B），使用“保护海港条例”toshop（;）直方图功能，在该地区的利益来衡量的像素密度和减去组织以外的胶片上的背景水平，但仍然在载玻片上^2,4。为了量化在细胞水平上的表达，我们采取了图像的银粒细胞在高倍率下（40-100X， 图4）。然后，我们使用图像J的阈值和测量功能，在美国国立卫生研究院韦恩Rasband来计算图像中的银颗粒的数量，而不在载玻片上的细胞在类似的区域减去背景计数，分化的细胞数量，获得每个细胞中的表达^。4,18 A值（2）它可以是相对较高的吞吐量，允许100-200幻灯片同时处理，由于紧张的盖玻片密封矿物油浴。标准的原位杂交方法需要较长的时间密封幻灯片封口膜，指甲油，和其他手段，幻灯片占用了大量的空间;（3）它是高度的敏感的低丰度的成绩单，由于硫酸葡聚糖和登哈特的杂交缓冲^2,13的解决方案;（4）在暗视野成像的方法产生高对比度的图像，由于在解剖显微镜^4,5暗场照明下图片。此外，它可以让敏感的微小变化，如在活动依赖的基因表达，基因表达的检测，以确定特定的大脑激活区域的^19个具体行为的感知和生产过程中。相对非放射性协议的限制，后者是在蜂窝决议和细胞内的基因的位置清晰，并与乳液的工作是非常敏感的操纵和光。这是可能的，结合我们的方法与其他方法，如非放射性原位杂交标记mRNA表达多个基因在同一组织^10,17,20。它可以结合免疫细胞化学标注上相同的样品RNA和蛋白表达，以合作，本地化与某些类型的细胞的基因^10。这种双标记实验所需的协议修改描述中引用的参考文献。

总之，我们的做法有利于细胞的基因表达的时间和位置的认识，以便了解区域组织，组织功能活动，和基因功能。

我们什么都没有透露。

作者要感谢所有的贾维斯实验室成员多年来的改进协议。

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