Радиоактивный На месте Гибридизации для обнаружения разнообразных шаблонов экспрессии генов в ткани

Chen, C. C., Wada, K., Jarvis, E. D. Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue. J. Vis. Exp. (62), e3764, doi:10.3791/3764 (2012).

Знание сроков, уровня, сотовые локализации и типа клеток, что ген экспрессируется в способствует более глубокому пониманию функции гена. Каждая из этих функций может быть достигнуто с в гибридизация с мРНК в клетках. Здесь мы представляем на месте радиоактивного метода гибридизации изменение от Clayton и соавт. (1988) ^1, который успешно работает в нашей лаборатории в течение многих лет, особенно для взрослых позвоночных мозг ^2-5. Долго комплементарной РНК (кРНК) зондов для целевой последовательности позволяет для обнаружения низких стенограммы изобилие ^6,7. Включение радиоактивных нуклеотидов в кРНК зондов позволяет дальнейшее чувствительность обнаружения низкого стенограммы изобилия и количественного анализа, либо светочувствительных рентгеновской пленки или эмульсии покрытие на ткани. Эти методы обнаружения обеспечивают долгосрочную целевую запись экспрессии генов. По сравнению с нерадиоактивных зонд методамиОРВ, таких как DIG-маркировки, радиоактивный метод гибридизации зонда не требует несколько этапов усиления использования HRP-антитела и / или TSA набор для обнаружения низких стенограммы изобилия. Таким образом, этот метод обеспечивает линейную зависимость между интенсивностью сигнала и количество целевых мРНК для количественного анализа. Это позволяет обрабатывать 100-200 слайдов одновременно. Он хорошо работает на разных стадиях развития эмбрионов. Большинство развития изучении экспрессии генов использовать все эмбрионы и нерадиоактивных подходы ^8,9, отчасти потому, что эмбриональная ткань более хрупкая, чем у взрослых ткани, с меньшим количеством сцепление между клетками, что делает его трудно увидеть границу между клеточной популяции с срезах тканей. В отличие от наших радиоактивных подход, в связи с большим диапазоном чувствительности, может получить более высокую контрастность в резолюции экспрессии гена ткань между регионами, что делает его легче видеть границы между популяциями. Используя этот метод, исследователи смогли выявитьвозможные значения вновь выявленных генов, и в дальнейшем прогнозировать функции гена.

1. Подготовка ткани

1. Урожай свежих тканей. Для птичьего эмбриона, осторожно откройте яйца и очистить эмбрион в чашке с 1xPBS, в два раза. Для взрослого мозга, быстро удалить мозга и осторожно промыть 1 х PBS.
2. Вставить эмбрионов или взрослого мозга в форме встроенного полный ОКТ ткани тек, ориентируясь ткани, сколько необходимо для секционирования и быстро заморозить блока, поместив его в этанол и сухую смесь льда, будьте осторожны, чтобы не получить смесь внутри блока .
3. Нарежьте замороженных образцов в криостате в 10-12 мкм разделов. Для ткани головного мозга и эмбриональными, лучшие резки умеренно находится в пределах от -18 ° C до -20 ° C.
4. Установите замороженных срезов на супер плюс стеклах.
5. Хранить разделы в режиме слайд-поле при температуре -80 ° C.

2. Поколение радиоактивных Riboprobes (используйте радиационной безопасности процедур вашей организации)

1. Создать очищенный линейный DNШаблон вашего кДНК интерес либо фермент ограниченной дайджест клонированного фрагмента окружении РНК-полимеразы промоутер сайтов с плазмидной ДНК методом ПЦР или вкладыша прикреплены к РНК-полимеразы промоутер сайтов связывания. Кроме того, можно создавать ПЦР фрагментов РНК-полимеразы промоутеров в рамках 3 'и 5' ПЦР праймера. Гели очистить ваш ограниченный или ПЦР фрагментов Geneclean комплект очистки гель.
2. Для 0,5 мл трубки Эппендорфа, добавьте 0,5-1 мкг очищенного линейной матричной ДНК, транскрипция буфера, DTT, RNasin, AGC нуклеотидных решение смеси, и РНКазы свободной воды довести объем до необходимого количества. Затем добавьте S ^35-UTP и соответствующие РНК-полимеразы, чтобы ни антисмысловых или чувство riboprobes.
3. Выдержите смесь в течение 1 часа при 37 ° С на водяной бане. Добавьте еще аликвоту РНК-полимеразы и инкубировать в течение еще 1 часа.
4. Добавить 3М ацетата натрия, раствор (0,1 раза от общего объема) и 100% этанола (2,5 лД. от общего объема) в трубку Eppendorf для осаждения синтезированы РНК riboprobe.
5. Инкубируйте в сухой лед или -80 ° C в течение 15 минут или более чем на 3 часа, чтобы помочь осадков.
6. Гранул РНК центрифугированием при 4 ° С и 15000 оборотов в минуту в настольной центрифуге Эппендорф в течение 30 мин.
7. Удалить супернатант и промыть осадок 70% этанолом, коснитесь пальцами смешать гранулы хорошо.
8. Гранул РНК снова центрифугированием при 4 ° С и 15000 оборотов в минуту в течение 30 мин.
9. Удаляют супернатант полностью пипетировать, а затем добавить 40 мкл раствора гибридизации. Хорошо перемешать по пипетировать и выход.
10. Положите 1 мкл раствора в 3 мл безопасностью Решите решение в сцинтилляционный флакон, хорошо перемешать и измерить импульсов в сцинтилляционных счетчиков.
11. Поместите Эппендорф с riboprobe при температуре -20 ° C для использования в течение одной недели.

3. Ткань лечение

1. В капот, подготовить свежий PBS буфером 4% paraformaldehyде-решение до 3-5 ° C выше комнатной температуры. Место слайды от -80 ° C хранение в металлической стойке на сухом льду, довести до рабочего пространства под капотом, а затем установите решетку на 4% параформальдегид решение, и инкубировать 5 минут при комнатной температуре.
2. Промыть 3 раза в 1 х PBS около 15 провалов каждый (около 1 секунды за провал).
3. В капот, чтобы ацетилирования буфера и энергично встряхните его в течение 10 секунд. Сразу вылить в лоток, стойки слайды и инкубировать в течение 10 мин, чтобы уменьшить фон связывания riboprobe.
4. Промыть 3 раза в 2 х ГНПП для 15 повторений.
5. Высушить в 70%, 95% и 100% этанола последовательный в течение 2 минут на каждом этапе (не должно быть в капюшоне).
6. Высушите слайдов под капотом, по крайней мере 10-15 минут.

4. Гибридизация

1. Рассчитать количество riboprobe (0,5 1x10 ⁶ копий в минуту в слайд) и гибридизации решения (100 мкл на слайд), необходимых для всех слайдов. Prewaгт riboprobe-гибридизации смеси до 65 ° C в течение 5 минут для денатурации riboprobe.
2. Внесите 100 мкл riboprobe-гибридизация решение в линейке по слайду, а также использовать стекло покровное, чтобы равномерно распределяют его по ткани и покровное. Место скользит горизонтально, вертикально стоящих в стойку металл и место стойке медленно вертикально на 65 ° C масляной ванне в течение минимум 4 часов и до 16 часов. Масло создает герметичное уплотнение по всему покровные.
3. Удалите металлические стеллажи с масляной ванне и протрите излишки жира вокруг стойки с папиросной бумагой.
4. Смыть масло с закрытой горки и металл стойки в стеклянных или металлических лотков, содержащих хлороформ, в два раза. ^2-й хлороформ мытья можно использовать в качестве первой для следующего эксперимента.
5. Трансфер в стойку с закрытыми вставляется лоток на 0,1% β-меркаптоэтанол + 2 х ГНПП решение и двигаться вверх и вниз в течение нескольких провалов, чтобы ослабить покровные и удалить избыток растворить гибридизации решенияТион.
6. Трансфер в стойку с закрытыми слайдов в свежий раствор 0,1% β-меркаптоэтанол + 2 х ГНПП, а затем удалите покровные с РНКазы бесплатно пинцетом в растворе для предотвращения царапин срезах тканей. Передача непокрытой слайды в свежем стойке в лоток горизонтальный держатель стойки слайд, в растворе 0,1% β-меркаптоэтанол в 2 х ГНПП.
7. Инкубируйте стойку с горки на свежем 0,1% β-меркаптоэтанол + 2 х ГНПП раствора при комнатной температуре в течение 1 часа, чтобы удалить избыток несвязанных РНК зонд. Сбросьте эту и предыдущую водных растворов стирки, а также покровные, как радиоактивные отходы.
8. Трансфер в стойку с горки на подогретую 2x ГНПП решение при 65 ° С, добавить β-меркаптоэтанол к окончательному 0,1% концентрации, и инкубировать при температуре 65 ° С в течение 1 часа. Выбросить в качестве радиоактивных отходов.
9. Передача и инкубировать в стойку с горки два раза в подогретую 0,1 х SPPE при 65 ° С в течение 30 минут каждый. Количество радиоактивного удаленыэтот шаг очень мало и больше не считается чрезмерным радиоактивные отходы после этого шага.
10. Высушить стойки и горки в 70%, 95% и 100% этанола в течение 2 минут каждый.
11. Высушите слайды в капюшоне, по крайней мере 30 мин.

5. Визуализация радиоактивных сигналов

1. Поместите сухой скользит в кассету и в темной комнате, поместите рентгеновской пленки (Kodak BioMax MR фильм) на слайдах, и закройте кассету. Убедитесь, что слайды с которыми сталкиваются стороны эмульсии рентгеновской пленки. Вынести слайды ~ 1-7 дней в зависимости от ожидаемого изобилия стенограммы.
2. Развитие рентгеновской пленки в стандартных разработчик и фиксаж. Гибридизации сигнала отображается как черный (серебро подвергается зерен в эмульсии) на пленке (рис. 1).
3. 1. (Необязательно) Чтобы определить клеточный разрешение и увидеть сигнал на ткани, слайды должны быть, смоченной в фотоэмульсии и контрастно.Если вы собираетесь в конечном счете, контрастирующая окраска с крезиловый фиолетовый, то delipidize разделов путем инкубации в ксилоле в течение 5 мин при комнатной температуре в два раза, увлажняет 1 мин каждая на 100%, 100%, 95%, 95%, 70% и 50% этанола , а затем в дистиллированной воде. Если вы не собираетесь пятно с красителем, который не требует delipidization, то delipidization не является необходимым. Сухой слайды и под капотом, по крайней мере 2-3 часов.
   2. В темной комнате, на основе безопасных свет, выкопайте достаточно Kodak НТБ эмульсии, чтобы покрыть половину слайд продольные (т.е. ткани) в стеклянном контейнере погружения, а затем растопить в 42 ° С на водяной бане 20-30 мин. Затем разбавить его дистиллированной водой до 1:1. Уровень эмульсии должно охватывать все разделы на слайде, когда слайд погружается в нее. Если у вас есть много слайдов, может потребоваться дополнительная подготовка эмульсии.
4. Dip слайды в разбавленной эмульсии в 42 ° С на водяной бане и сухой ближнего слайды в закрытом светонепроницаемый контейнер overnigНТ в темной комнате, или в духовке при температуре 37 ° С в течение 2-3 часов, с выключенным светом.
5. Передача слайдов в стойках слотов в черных коробках, содержащих сушильные шкафы, будьте осторожны на слайдах не соприкасаются друг с другом и тем самым создать артефакты. Печать краям коробки с черной изоленты медленно, чтобы предотвратить статический вызванных искрами света, а затем обернуть коробки в алюминиевую фольгу. Храните коробки на 4 ° С от нескольких дней до нескольких недель (сигнал от 1 дня на рентгеновской пленке похож на 5 дней в эмульсию).
6. Теплый слайд коробки до комнатной температуры в течение 1 часа.
7. В темной комнате, снимите стойку с горками (или местом, слайды в металлической стойке при использовании коробки со слайд-слота) из коробки и развивать их в Kodak D-19, разработчик при 16 ° С в течение 3,5 мин.
8. Вымойте разработаны слайды в водопроводной воде при комнатной температуре в течение 1 мин.
9. Инкубируйте слайды дважды в фиксаж на 19 ° С в течение 6 минут каждый. Свет может быть включен во второй инкубации фиксаж. Вымойте слайды в проточной воде при комнатной температуре в течение 30 мин и очистить эмульсией с обратной стороны слайд-при "мокрых" бритвой, чтобы не поцарапать стекло.
10. Пятно ткани с 0,3% крезиловый фиолетовый в водопроводной воде в течение 5 мин.
11. Вымойте дополнительные крезиловый решение фиолетовый в пресной водой из-под крана в течение ~ 15 повторений.
12. Высушить слайды ~ 15 повторений в каждом спиртовом растворе: 50%, 70%, 95%, 95%, 100% и 100% этанола.
13. Инкубируйте слайды в ксилоле в течение 5 мин при комнатной температуре в два раза.
14. Покровные стекла с Permount среды на слайд и высушите покрытый слайдов в капюшоне на ночь (> 16 часов), это займет несколько дней до клея достаточно крепкими, чтобы очистить слайды дальше.

6. Создание изображения Darkfield цвета

1. При необходимости дальнейшего чистый избыток эмульсии на фоне слайдов (не coversliped стороне без ткани) на смачивание ее водой и очищая с лезвием бритвы.
<LI> промыть стекла с 80% этанола и решение уничтожить 1-2 раз осторожно, чтобы избавиться от мусора и пыли.
2. Фотосъемка в темном поле или светлом освещении. Шаги 6.2 и 6.3, возможно, придется повторить 2-3 раза, чтобы получить хорошее изображение без частицы пыли, которые хорошо видны на темном поле при вскрытии микроскопом.

7. Представитель Результаты

Два основных способа просмотра на месте результаты гибридизации на срезах тканей гибридизации с S ³⁵ радиоактивных зондов: 1) рентгеновской пленки, которая была помещена на слайды или 2) эмульсия, которая была покрыта на слайдах. Третий подход использует phosphorimager экран, расположенный на слайдах, но мы не были удовлетворены решением этого подхода. Рентгеновской пленки обеспечивают быстрый результат и анализ общего состояния гибридизации. Рентгеновской пленке данные также показывает широкую анатомическую разрешение и может быть использована для количественного analys^10. Примеры рентгеновской пленке изображение конце главы птичьего эмбриона гибридизации с антисмысловые зонды для FoxP1 и CoupTF2 экспрессии генов в цифрах 1A и B. Оба гена весьма распространены в конкретных подразделениях головного мозга. Хорошего качества рентгеновской пленки результат должен быть острым (не размытыми) и имеют высокое отношение сигнал к фону. Размытое изображение может быть связано с неравномерным контакт между рентгеновской пленке и стекле с гибридизированных ткани.

Для эмульсии ближнего слайды, эмульсия содержит светочувствительные соли серебра наносят на ткань, соединенный того, что на пластик рентгеновской пленки. Во время разработки, S ^35, подвергшихся воздействию солей серебра превращаются в металлическое серебро зерна, как и в рентгеновской пленке. Тем не менее, месторождение серебра из них видно непосредственно на клетки представляют экспрессии генов, которые можно наблюдать и измерять качественно под микроскопом. Металлических зерен серебра блокировать прямой свет черези выглядят как черные точки зрения в светлое. Крезиловый контрастирующая окраска появляется фиолетовый фиолетовый цвет (рис. 3А, 3С, а на рис. 4). В темном поле, серебро зерна отражать свет, исходящий со стороны и появляются в виде белых точек (рис. 1C, 1D, 3B и 3D). В этой ситуации, фиолетовые пятна крезиловый появляется красный цвет. В светлом, гибридизация сигнал легче просматривать при большом увеличении на клеточном резолюцию, в то время как в темном поле, кроме того, гибридизация сигнал можно рассматривать под более низкий увеличение по всей ткани. Вид темного поля является подход, мы обычно используем, чтобы показать общую картину экспрессии генов. Тем не менее, по сравнению с быстрым результатом, полученным с рентгеновских снимков, слайдов эмульсии ближнего занимает больше времени (от одного до нескольких недель) и более чувствительна к получению фоне.

Есть четыре основных источников сильного фона: 1) История всей рентгеновской пленки, как правило, сделать, чтобыпроблемы с застройщиком или закрепитель или частично отснятой пленкой, 2) Справочная информация о стеклах, как правило, из-за проблем со стиральной или стекло подготовки, такие как неправильное silination из слайдов из коммерческих источников или самостоятельно подготовленные, 3) Эмульсия воздействия и предпосылки развития и 4) Справочная информация по разделу связано либо с отсутствием тщательного после гибридизации шаги стирки, слишком низкую температуру гибридизации, низкое качество гибридизации решение, параформальдегид загрязнения мыть посуду вызывает датчиков постоянно перекрестные ссылки на ткани, riboprobe, ведущих к деградации малых молекул маркировке ткани неспецифически, неактивные DTT или β-меркаптоэтанол в результате сшивки из S ^{35-РНК-зонды} в ди-сульфидных связей в ткани, и ждать слишком долго для ацетилирования. Очень важно, чтобы слайды в ацетилирования решение в течение нескольких секунд смешивания ангидрида уксусной кислоты и триэтаноламин. Если несколько минут пройти withouт добавив решение слайды, а затем ацетил группы, не будут эффективно удалены, а затем связываются с РНК, не специально. Другие факторы включают гибридизация в течение 20 часов, которые могут генерировать слишком сильным сигналом, а избыток капель масла на слайды, которые поглощают гибридизации решение на слайдах во время моющие растворы, в результате радиоактивного пятна на ткани и слайды дает темный фон сигналов. Если вы работаете с большим количеством слайдов (более 100 срезов), добавить ³ хлороформа мыть или изменить хлороформ моет, для предотвращения чрезмерного частиц масла из оставшихся на слайдах. Неосторожное обращение ткани, то есть не замораживание достаточно быстро (в течение 5-10 мин после вскрытия) или размораживания и повторного замораживания и увеличивает фон, связанный с мРНК деградации. Будьте внимательны и не перепутайте фон для передержки.

Для эмульсии на фоне ближнего слайды можно, потому что это очень светочувствительными и требует длительной экспозиции в темноте. Com проблемы пн фоне включают слишком высокой температуры для разработчиков и фиксаж. При температуре выше 19 ° C, близко или теплее комнатной температуры, более серебряном фоне зерна получается. Воздействие низких уровнях света просачивается в темной комнате может привести эмульсии фоне. Не вымывания фиксаж достаточно долго (по крайней мере 30 минут в проточной воде), оставят фиксаж, что тогда вступает в реакцию с крезиловый фиолетовый для создания коричневатый осадок всей эмульсии. Однако, если слайды промывают в воде дольше, чем 90 минут после фиксации перед окрашиванием крезиловый фиолетовый, это может привести к эмульсии, чтобы стать свободным и разделы пятно плохо. Если нет достаточно времени, чтобы пятно слайдов в пределах 30-90 мин после фиксации окна и стирки, после 30 минут мыть, сушить слайды в ночное время и продолжить крезиловый фиолетового окрашивания на следующий день. Как правило, большинство мРНК имеют специфические закономерности экспрессии генов, в то время как фоновый сигнал более равномерным.

Для лучшей интерпретации зонд специфику, датчики контроля смысл должен быть применен на нескольких соседних участках. Большинство датчиков смысле не показывают сигнал, но некоторые делают, и когда они это сделают, мы находим, что часто отличается от антисмысловых сигнала. Мы считаем, что это может быть связано с антисмысловые синтеза или иного гена на антисмысловой нити генома. Приведем пример Pax6 смысл и антисмысловых зондов (рис. 2, Б). Антисмысловых нитей показывает, маркировка по желудочка зоне переднего мозга, мозжечка и глаз, как ожидалось (рис. 2), но смысл показывает, лаbeling в пигментный слой сетчатки (рис. 2В).

Для зонда размеров, мы используем кДНК зонды в любой точке диапазона 300-5000 бит в секунду. Зонды менее 300 бит работы, но сигналы, как правило, слабее. Мы не пытались зондов больше, чем 5000 бод. Лучше всего использовать датчики на ткани того же вида, если это возможно. Если нет, мы пересекаем-гибридизации зонды на участках других видов и уменьшение гибридизации и мыть температура 3-5 ° С шагом на основе идентичности последовательности, если они известны. Если не известно, то мы выполняем методом проб и ошибок гибридизации и мыть температурах. Если температура опускается слишком много, кДНК зонд может перекрестно скрещиваться с другими мРНК подобной последовательности разных видов или у тех же видов ^11. На практике мы обнаружили, что кДНК, которые составляют ~ 95% или более идентичных по цели в мРНК ткани, строгие гибридизации и температуру стирки (65 ° C) условиях работает хорошо. Для последовательностей, которые находятся в рангех годов ~ 85 до 94% идентичны, гибридизации и температуру стирки, возможно, должны быть сокращены в диапазоне от ~ 50 до 60 ° C.

Причина для использования металла стойки в большинстве шагов использования хлороформа моет и ксилол. И органические расплава многих видов пластмасс. Стекло и некоторых видов пластмасс, устойчивых к этим органики. Но стекло легче сломать, и некоторые виды пластика, что на первый устойчивы будет таять в течение длительных периодов воздействия органических веществ.

Рисунок 1. Авторадиографии в гибридизация изображения с рентгеновской пленки и эмульсии ближнего слайдов. (AB) рентгеновской пленке изображение сагиттальной целые разделы главы зебры зяблик певчих птиц в эмбриональном 10-й день, гибридизации с антисмысловой riboprobes в (A) FoxP1 или (B) CoupTF2, взятые с подсветкой светлого под микроскопом рассечения. Черный, подвергаются зерна в фильм, показывающий мРНК экспрессионов. Шкала бар = 500 мкм. (CD) Эмульсия смоченной слайд изображение сагиттальной целые разделы главы зебры зяблик на пост люк 6-й день, гибридизации с антисмысловой riboprobes (С) ​​FoxP1 и (D) CoupTF2, взятых с освещением темного поля при вскрытии микроскопом. Белый, серебро подвергается зерен в эмульсии выше ткани показывает экспрессию мРНК. Красный, фиолетовый крезиловый пятно. Шкала бар = 200 мкм. За все картины, клюв ростральной влево. Рентгеновские снимки фильм подвергались в течение одного дня, ближнего слайды в течение 3 дней. Зонд FoxP1 составляет 178 б.п. до 1544-1711 б.п. части мРНК; CoupTF2 составляет 545 б.п. до 1-545 б.п. части мРНК. Как видно, в мРНК переднего мозга FoxP1 обогащается mesopallium (M), стриатуме (St) и спинной таламус (DT), в то время как CoupTF2 обогащается nidopallium (N), arcopallium (А), и более вентральный таламус . Существует последовательность в выражении между воздействием типов (и возраста). С ближнего слайды, однако, более высокое разрешение маркировки видно,г ткани границы и подразделений, непосредственно определены. Эти и другие изображения, показанный в статье взяты из разделов используя стандартный 65 ° C высокая жесткость гибридизации.

Рисунок 2. Сравнение антисмысловых и чувство маркировка, которая показывает различные узоры. (A) антисмысловой нити Pax6 было выражено в головном мозге, особенно желудочковой зоны (белая стрелка). Показана авторадиографии на рентгеновских пленках сагиттального все кусочки глава взята из зебры зяблик в эмбриональном день 12. (B) смежные секции гибридизации с чувством прядь Pax6 не обнаруживает фон выражение всей эмбриона головой, но очевидно выражение в пигментный слой сетчатки (черные стрелки), антисмысловой нити. Пунктирная линия показывает контур весь мозг. C: мозжечка.

Ронг> Рисунок 3. В месте сигналов экспрессии генов в эмульсии ближнего слайдов, взятых из мозга зебры зяблик на поздних эмбриональных стадий в светлом и темном поле просмотра. (A) светлое изображение D1B выражение в эмбриональном 10-й день от обычного воздействия на эмульсию. Этикетке (черный) едва ли можно увидеть на этом увеличении. Зонд составляет 625 б.п. до 1-625 б.п. части мРНК. (Б) одинаковые секции и увеличение, как в (), но перешел на мнение темнопольные показывает метки (белый) в стриатуме (St) и таламуса (TH). (C) светлое изображение Slit3 выражение в эмбриональном 12 день от воздействия на эмульсию. Label (черный) легко видеть. Зонд является 779 б.п. до 1243-2021 части мРНК. (Б) одинаковые секции и увеличение, как в (A) перешли на темном поле зрения показывает метки (белый) в спинном мозге (SC), который соответствует светлое изображение. Ростральные ориентировано влево. Cb: мозжечка.

/ 3764/3764fig4.jpg "ALT =" Рисунок 4 "/>
Рисунок 4. Серебряная зерна разрешение на клеточном уровне. Показана FoxP1 мРНК метки в зебру зяблик переднего мозга с зернами серебра (черные точки) выше клеток (крезиловый фиолетовый) в различных регионах мозга и возраста по сравнению с более низкой мощностью изображения рис. 1А и 1С. (А) Высокая выражение изобилия над отдельными ячейками (черные стрелки) у взрослых зебр зяблик mesopallium. (В) Низкая выражение изобилия над отдельными ячейками (черные стрелки) в соседних nidopallium того же раздела. (C) Высокая FoxP1 экспрессию мРНК на клетки (черные стрелки) в 12-й день эмбрионального mesopallium. (D) Низкий выражение изобилия на клетки (черные стрелки) в соседних nidopallium того же раздела. Пример клетки круг с желтой линией. Эмбриональные клетки (C и D) меньше по размеру и более плотно упакованы по сравнению с взрослыми клетками (А и Б). Так как есть некоторое пространство между клетками и эмульсии, площадь открытых сиlver зерна от S ³⁵ зонд немного большим, чем площадь клеточных тел. Шкала бар = 10 мкм.

Радиоактивные в гибридизация мРНК выражение широко используется для различных целей, в том числе для изучения региональной организации ткани, типах клеток и мозга функциональной активности ^{2-5,10,12-14.} Последующего использования на гены, экспрессия мРНК в мозге зависит от повышенной нервной деятельности, которую часто называют деятельность зависит от генов или немедленного ранних генов. С учетом этих целей, наш метод был применен на несколько видов, в том числе птиц, млекопитающих (например, человека), рыб и земноводных, во многих тканях, включая мозг, кожу и мышцы, и несколько веков, в том числе птенцов / новорожденных, подростков , взрослые, а вот в целые разделы эмбриона ^2,3,5,15-17. Особенность нашего протокола, включают: (1) дает баланс между анатомическим специфику и количественные специфику. Для количественной оценки экспрессии генов на рентгеновской пленке, мы принимаем цифровые фотографии изображений (например: Рис. 1А и 1В), используйте Photoshop (Adobe) функция гистограммы для измерения плотности пикселей в регионах, представляющих интерес и вычитание фона на пленке вне ткани, но по-прежнему на стекле ^2,4. Для количественного выражения на клеточном уровне, мы принимаем изображения зерен серебра на клетки при большом увеличении (40-100X; рис. 4). Затем мы используем порог и меру функции изображения J Уэйн Rasband в NIH для подсчета количества зерен серебра в образ, вычесть из счета фона в аналогичной области без клеток на стекле, разделите на количество клеток, чтобы получить значение выражения в клетке. ^4,18 (2) может быть относительно высокой пропускной способностью, что позволяет обработку 100-200 слайдов одновременно, из-за уплотнения покровное созданы ванны минеральные масла. Стандартный на месте методы гибридизации занимает больше времени, чтобы запечатать слайды с парафильмом, лак для ногтей и других средств, где слайды занимают много места (3) Вполнечувствительна к низким стенограммы из-за обилия декстран сульфата и решение Денхардта в гибридизации буфер ^2,13; (4) изображение подход в темном поле дает изображения с высоким контрастом благодаря съемке с освещением темного поля на вскрытии ^4,5 микроскопом. Кроме того, это позволяет чувствительны обнаружения небольших изменений в экспрессии генов, таких, как зависимого от активности экспрессии генов для выявления конкретных областей мозга активируется при восприятии и производстве конкретного поведения ^19. Ограничения относительно нерадиоактивных протоколов, что последние являются более ясной в клеточном разрешение и расположение мРНК в клетке, и работа с эмульсией очень чувствительны к манипуляциям и света. Можно объединить наш метод с другими методами, такими как нерадиоактивных в гибридизация маркировать экспрессию мРНК более чем одного гена в той же ткани ^10,17,20. Это может быть объединена с иммуноцитохимиипометить как РНК и белка выражение того же образца, с тем чтобы совместно локализации мРНК с определенными типами клеток ^10. Протокол изменения, необходимые для такой двойной маркировки эксперименты описаны в цитированной литературы.

Таким образом, наш подход облегчает понимание о сроках и месте сотовый экспрессии генов для того, чтобы понимание региона организацию, функциональную активность тканей и функции гена.

Нам нечего раскрывать.

Авторы хотели бы поблагодарить всех Джарвис лаборатории членов, которые улучшили протокол на протяжении многих лет.

1. Clayton, D.F., Huecas, M.E., Sinclair-Thompson, E.Y., Nastiuk, K.L., & Nottebohm, F. Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain. Neuron. 1, 249-261, [pii] 0896-6273(88)90146-8 (1988).
2. Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E.D., & Hagiwara, M. Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization. J. Comp. Neurol. 476, 44-64, doi:10.1002/cne.20201 (2004).
3. Haesler, S., et al. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
4. Jarvis, E.D. & Nottebohm, F. Motor-driven gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).
5. Holzenberger, M., et al. Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain. J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).
6. Mahmood, R. & Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods Mol. Biol. 461, 675-686, doi: 10.1007/978-1-60327-483-8_45 (2008).
7. Wilkinson, D.G. & Nieto, M.A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
8. Acloque, H., Wilkinson, D.G., & Nieto, M.A. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).
9. Moorman, A.F., Houweling, A.C., de Boer, P.A., & Christoffels, V.M. Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol. J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).
10. Horita, H., Wada, K., Rivas, M.V., Hara, E., & Jarvis, E.D. The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons. J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901, doi:10.1002/cne.22370 (2010).
11. Braissant, O. & Wahli, W. A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections. Biochemica. 1, 10-16 (1998).
12. Kubikova, L., Wada, K., & Jarvis, E.D. Dopamine receptors in a songbird brain. J. Comp. Neurol. 518, 741-769, doi:10.1002/cne.22255 (2010).
13. Wada, K., et al. A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).
14. Jarvis, E.D., et al. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).
15. Hoke, K.L., Ryan, M.J., & Wilczynski, W. Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717, doi: 10.1073/pnas.0502361102 [pii] 0502361102 (2005).
16. Burmeister, S.S., Jarvis, E.D., & Fernald, R.D. Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity. PLoS. Biol. 3, e363, doi :10.1371/journal.pbio.0030363 [pii] 05-PLBI-RA-0135R2 (2005).
17. Jarvis, E.D., Schwabl, H., Ribeiro, S., & Mello, C.V. Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds. Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).
18. Jarvis, E.D., Scharff, C., Grossman, M.R., Ramos, J.A., & Nottebohm, F. For whom the bird sings: context-dependent gene expression. Neuron. 21, 775-788, [pii] S0896-6273(00)80594-2 (1998).
19. Feenders, G., et al. Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin. PLoS One. 3, e1768, doi:10.1371/journal.pone.0001768 (2008).
20. Chen, C.C. & Fernald, R.D. Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization. J. Comp. Neurol. 495, 314-323, doi:10.1002/cne.20877 (2006).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.