En forenklet teknik for

Mohit Parekh¹, Stefano Ferrari¹, Enzo Di Iorio¹, Vanessa Barbaro¹, Davide Camposampiero¹, Marianthi Karali², Diego Ponzin¹, Gianni Salvalaio¹

¹Fondazione Banca Degli Occhi del Veneto O.N.L.U.S., ²Telethon Institute for Genetics & Medicine (T.I.G.E.M.)

1. In situ Udskæring af hornhinden fra Ocular Glober

1. Tænd for laminar air flow-skab ca 15 minutter før brug. Rengøre laminært flow anvendelse af 70% isopropylalkohol. Tag personlig beskyttelsesbeklædning såsom kirurgisk hætte og maske. Skrub hænder og underarme og tørre ved hjælp af en steril håndklæde. Brug sterile handsker og kittel eller ærmer ved hjælp af aseptisk teknik.
2. Opstil sterile område ved at placere et sterilt instrument bakke aseptisk. Kontroller, at instrumenterne er sterile. Åbn den sterile instrumenter pakke og vende på den sterile område undgå forurening.
3. Placere alle sterile materialer og instrumenter (tabel 2) sammen med flasker (øjet krukker) indeholdende øjet globes således at de støder op til kanten af det sterile område for at lette anvendelsen.
4. Mærk flasker med tidligere fremstillet præservering / lagringsmedium som angivet i tabel 3 og anbringm på overfladen af ​​det laminare luftstrøm hætte sammen med I-PVP (iod-polyvinylpyrrolidon), natriumthiosulfat og en steril saltvandsopløsning PBS (phosphatbuffer saltvand).
5. Tillader okulære væv og opløsninger til opnåelse af normal stuetemperatur, når de opbevares i køleskab ved 4 ° C. Undgå gentagne opvarmning / køling cykler. Hold låget af løsningen og øjet krukker med indersiden opad ved siden af ​​deres respektive krukker.
6. Fjerne gazer og svampe fra øjet krukken med sterile pincetter. Fordyb kloden i sterilt I-PVP 0,5% i 2 minutter sanerende de okulære glober. Placere de to tangen på låget af den sterile bakken, uden for det sterile område. Overfør kloden i natriumthiosulfat 0,1% i 1 minut ved hjælp af et andet par af sterile pincet. Anvendelse af de samme pincet verden overført til flasken indeholdende steril saltopløsning (PBS) og lad det indtil det anvendes. Gentag samme procedure for andre okulære kloden fra tHan samme donor.
7. Arbejde under laminar air flow-hætte, kloden ved hjælp af steril gaze (bandager) forlader hornhinden og ca 5 mm sclera fra den udækkede hornhinden wrap. Øjet pære kan simpelthen holdes i hånden at opretholde tilstrækkeligt tryk. Vævet bør holdes fugtig under hele operationen.
8. Tang bruges sammen med en saks for at fjerne alle eventuelle rester af bindehinden. Hold instrumenter, der anvendes til ovennævnte operation adskilt fra andre instrumenter. Anvende en skalpel til at udføre en sclerale indsnit på 3-4 mm fra limbus region, derefter forlænge snit ved 360 °, så man undgår at perforere det underliggende uveale vævet eller forårsage deformation af hornhindens normale krumning. Skæres fire store incisioner fraspaltelige fire små huller undgå udskillelse af glaslegemet. Alle fire huller er skåret sikre ingen fjernelse af væv.
9. Tilstedeværelse af små sclerale plaques kan hæmme skæring, så sørg for at compLete den sclerale excision med mikrokirurgi saks. Denne operation skal udføres uden at beskadige årehinden, retina og glaslegemet.
10. Undersøg snit til at sikre, at det er komplet. Hvis snittet er udført korrekt corneo-sclerale fælge overholder de ciliære organer kun på det punkt i korrespondance med hornhinden.
11. Sæt den indpakkede okulære kloden ned nær centrum af det sterile område. Fuldføre corneale fjernelse under anvendelse af en pincet til at holde den sclerale kant stationære og den side, der anvendes til udskæring til at trække det ciliære legeme, choroid nedad og bort fra corneo-sclerale knappen.
12. Forsigtigt adskille eventuelle resterende adhæsioner fra corneo-sclerale knappen. Hverken trække corneo-sclerale kant på en måde, der kunne forårsage tværs corneal spænding eller lade det falde ned på det forreste kammer.
13. Endotelcellen densitet af hornhinden kontrolleres ved hjælp af en hypotonisk opløsning, og cellemortalitet kontrolleres ved hjælp af en trypen blå farvning omkring 1 min, og cellerne tælles derefter under et optisk mikroskop og måles som celler / mm ^2. Forkammeret skal vende mod låget, medens den bageste skal vende bunden af ​​petriskål. Den endotelcelle tæthed kan tælles manuelt ved hjælp af et gitter i målet under 100X forstørrelse. Den mindste accepterede celletal til transplantation i Italien er 2200 endotelceller / mm ^2.
14. Overføre corneo-sclerale kant ved hjælp af en hornhinde klo til tidligere fremstillet hornhinden lagermedium opbevaret ved RT (stuetemperatur) som vist i tabel 3.
15. Undersøge bagkammeret for naturlige krystallinse. Hvis sclera er forberedt, fjerne alle rester af uvea og glaslegemet fra kloden. Forsigtigt pakke og returnere den resterende bageste segment til dets respektive øjet krukke med aseptisk teknik. Gentag proceduren for den anden verden ved hjælp af nye instrumenter. Fastgør hornhinden with hornhinde klo og bevare under lagringsmedie (orgel kultur) ved 31 ° C. Det udskårne hornhinden, som vist i figur 1a, kan derefter anvendes til keratoplasti eller forskning.
16. Aflever de unødvendige materialer og bio-farligt affald i passende skraldespande. Rengør arbejdsområdet, når arbejdet er afsluttet med 70% isopropylalkohol spray.
17. Hvis der efter 28 dage hornhinden bevarer alle de vurderingskriterier [såsom morfologi, celletal, gennemsigtighed, tykkelse og mikrobiologi test - bakteriel og svampe med Bactec 9240 instrument (Becton Dickinson, Milano, Italien)], kan det så blive transporteret til hospitalerne hjælp af transportmediet er vist i tabel 4. Hornhinden skal fjernes og anbringes i lageret at transportere mediet under laminar luftstrøm kabinettet.
18. Da under opbevaring, hornhinden bliver tykkere, end den sædvanlige størrelse, der kræves for transplantation, øjen banker benytter de-kvældningsmidler for at reducere tykkelsen. Vibruge 6% dextran T500 at få hornhinden tilbage til sin normale størrelse i transportmedium. Selvom 4-8% dextran T500 kan anvendes, er 6% tjent bedst for os. Dette gør det lettere for kirurger at transplantere hornhinden, så snart de modtager det.

2. Udtagning af Retina fra Ocular Globe efter udtagelse af Cornea

1. Efter udskæring er hornhinden valgt til transplantation eller forskning baseret på dens morfologi og endotelcelle densitet og er placeret i lageret eller konservering medium ved 31 ° C. Den resterende del af den okulære verden derefter behandles til yderligere anvendelse, såsom sclera isolation til kirurgiske formål, retina for forskning osv.
2. Forud for retinal excision, sørg for, at okulære kloden er intakt, og kun hornhinden med en del af sclera er fjernet. Hvis det gelatinøse glaslegeme er at udskille ud bliver det vanskeligt at fjerne en retinal væv.
3. Hvis donor er under 65 år, sclera erbevaret under steril PBS til kirurgiske formål efter serologisk test. I dette tilfælde er sclera udskåret, kun glaslegemet fjernes, og hele sclera bevares.
4. For retinal excision, begynder med et lille snit eller snit fra hornhindens side af sclera bevæger sig i retning af synsnerven med sterile pincetter og sakse. Holde den del af sclera med pincet og skåret med en saks lige over den optiske nerve opskæring del for del undgå beskadigelse af glaslegemet.
5. Koroidale plaques skal adskilles fra sclera, når de hænger sammen. Skære hele sclera at blotlægge årehinden væv. Når sclera fuldstændigt skåret, adskille sclera med den resterende del af glaslegemet ved at skære den i nærheden af ​​synsnerven. En hel kugle glaslegemet dækket med årehinden vil være synlige som vist i figur 2a.
6. Brug to sterile pincet fjerne årehinden lag forsigtigt ved at samle det op med entang og at fjerne det med den anden. Alternativt kan årehinden lag fjernes ved hjælp af en saks, men dette bør ideelt undgås, da det kan forårsage skade på retina. Fjern choroidea lag delvist og klippe det til at lette fjernelsen.
7. Når årehinden lag fjernes, vil et transparent lag af retina ses tydeligt som vist i figur 2b. Årehinden lag har en indvendig Bruch membran, som også kan fjernes, men det er vanskeligt at identificere den med en blotte øje.
8. Tilsvarende anvender to pincet til at fjerne den retinale lag som vist i figur 2c. Det er let at isolere store mængder af nethinden, hvis udskåret nær synsnerven. Alle lagene i øjet kan nu ses som vist i figur 2d.
9. Når retinavæv er blevet fjernet, kan det anvendes til forskellige formål, og derfor de efterfølgende trin og betingelser, der anvendes til konservering, kan variere i overensstemmelse hermed. For eksempel,nethindevævet kan anbringes i rør indeholdende RNA stabilisering reagenser (såsom RNAlater) eller lysisbuffer (for RNA eller DNA ekstraktion), dispase / trypsin (for isolering af celler), fastsættelse opløsninger (før integrere væv i paraffin eller OCT for immunhistokemi).
10. Ryd hele arbejdsområdet og rengør området med 70% isopropylalkohol spray.

3. Repræsentative resultater

Den corneo-skleral kant som vist i figur 1a er en passende udskåret hornhinden med krævede mængde sclerale randen og endotel morfologi, denne type hornhinden anvendes generelt til gennemtrængende keratoplasti. Hvis den forreste stroma af det udskårne hornhinden er beskadiget med tilstedeværelsen af ​​opacitet, kan hornhinden anvendes til endotel keratoplasti / posteriore lamellær keratoplastik (endothelium med en del af stroma). Henviser, når endothellaget er beskadiget, eller hvis endotelcelle densitet <2200 celler / mm ² (Detalian standard) kan hornhinden anvendes til anterior lamellær keratoplastik (epitel med en del af forreste stroma). Hvis endotelcelletal er mindre end den ønskede, kan hornhinden anvendes til anterior lamellær keratoplastik eller forskning henviser, når hornhinden er beskadiget fuldstændigt, kan det anvendes til forskning, som vist i figur 1b, 3b og 3c eller kasseres. Skaden kan være en årsag til fejlhåndtering vævet, før grå stær operationer, der fører til stroma eller Descemet endoteliale ar, udvikling af fysisk skade i patientens liv osv. Derfor bliver det nødvendigt at kontrollere alle væv med spaltelampe og derefter under optisk mikroskop for fine ar / folder / afdelinger. Hornhinden er normalt bevaret under to forskellige forhold, såsom orgel kultur (ca. 31 ° C) normalt bruges i europæiske lande eller hypotermiske betingelser (ca. 4 ° C), der normalt anvendes i USA. Vi bruger organ kulturen, da det hjælper til at regenerere dæmningenalderen epitelceller, at re-vitalisere endothelcelle kontrol med en høj post mortem tid, en opbevaringsperiode på 4 uger, som giver tilstrækkelig vindue for at planlægge en operation, giver tilstrækkelig tid til mikrobiologisk (bakterie-og svampe) og serologiske undersøgelser mv hornhinden kan velbevaret i transportmediet i 7 dage.

Den sclera kunne skæres en del af en del sikre skånsom fjernelse af alle choroidale plaques. Den glasagtige væske kan udskille når den optiske nerve, årehinden eller retina skæres kraftigt som vist i figur 4. Nethinder hvis udtaget til RNA-analyse bør bevares i RNAlater, så snart de væv er fjernet. Sædvanligvis 1x1 cm årehinden og retinal lag udskæres, og efter at holde det i RNAlater i 24 timer ved 4 ° C opretholdes under -80 ° C i friske Eppendorf-rør (sikkert blokering rør, 2 ml), indtil der anvendes eller leveres med tør is. Nethindevævet skal udskæres ved hjælp af to tænger nær synsnerven fra iriseller ciliaere margin til at undgå forurening med andre pigmenterede strukturer og bør overføres til at bevare containeren umiddelbart som RNA bliver ustabil under hentning af nethinden.

Figur 1 Sammenligning mellem en god og en dårlig kvalitet hornhinde:. A) En korrekt skåret hornhinden. Sådan en hornhinde sædvanligvis opbevares i organkultur i 4 uger. Mikrobiologisk (bruger Bactec 9240 instrument) og morfologiske (farvning af cellerne med trypanblåt for cellemortalitet beslutsomhed og observere celler under et optisk mikroskop med 100X forstørrelse) undersøgelse udføres, inden den transporteres til hospitalet (figur 3a), b) en bøjet hornhinde , hvilket til sidst fører til afstødning af transplantatet på grund af høj Descemets folder og høj endotelcelle beskadigelse undersøges under anvendelse af en spaltelampe mikroskop. En sådan hornhinde er normalt bruges til research eller kasseres.

Figur 2. Metode til at sikre en nøjagtig udtagelse af den retinale væv. A) dissekere sclera fra okulære verden med 24mm klinge med 95 mm buet eller stumpe ende steril saks og 100 mm 11X2 regeret af 0,70 mm tænder steril pincet. Sclera skal skæres ved at holde en side med pincet skære det lige i retning af synsnerven ved hjælp af saks. Det choroid lag vil nu let ses, b) Brug af to 100 mm 11X2 regeret af 0,70 mm tænder sterile pincet, bliver årehinden fjernes ved at rive den fra hinanden, der afslører den underliggende transparente retinale lag c) Transparent nethinden lag er skåret meget omhyggeligt tæt synsnerven uden udskillelse af glasagtige fluid anvendelse af de samme pincet. Begge tangen skulle holde hver side af nethinden, og vævet skal forsigtigt fjernes Starting nær synsnerven bevæger sig mod hornhinden at opnå en god mængde af retinavæv. Vævet kan skæres i forskellige størrelser og anvendes til analyse eksperimenter d) Forskellige lag af øjet efter hornhinde fjernelse kan ses i denne figur. Årehinden organ fjernes først efterfulgt af retina uden at beskadige de øvrige dele af øjet.

Figur 3. Sammenligning af de forskellige typer celledensitet og morfologi betragtes under 100X forstørrelse af et optisk mikroskop. A) god endotelcelle densitet (> 2200 celler / mm ²⁾ og morfologi (mindre polymorfi, lav degeneration ikke dystrofi og 0% dødelighed) på en hornhinde, der er egnet til transplantation b) Dårlig endothelcelle densitet (ca. 1200 - 1400 celler / mm ²⁾ og morfologi (høj polymorfi og Degenved forbrænding af celler) sammen med 30-40% total dødelighed er observeret efter trypan blue-farvning c) En del af endotelceller er beskadiget på grund af frigørelse af en endothelcelle plade under hentning af hornhinden ved okulær verden. Dette bekræftes ved at observere mortaliteten af cellerne i området farvet med trypanblåt, d) Descemets folder dannes på grund af forkert behandling af hornhinden ved at bøje, hvilket skaber tværs hornhinde spænding ved hjælp af de instrumenter, intenst osv. ved excision. Figuren viser de tykke udviklede iatrogene folder findes mellem periferien og optiske zone af hornhinden.

Figur 4. Skader på choroidea og retinale væv, mens udskære hornhinden sidste ende fører til udskillelse af glasagtigt fluid. Nethinden bliver indblandet i glaslegemet gør det vanskeligt at udskære en god kvalitet væv without kontaminering.

Tabel 1. Resumé af den vifte af aktiviteter, der udføres ved hjælp af humane okulære glober i løbet af 2009 og 2010 på Fondazione Banca Degli Occhi (Venezia, Italien). 60% af væv blev anvendt til transplantation, hvilket giver et stort antal af okulære globes (ca. 40%) for medicinsk og videnskabelig forskning.

Supplerende Figur 1. Anatomi det menneskelige øje ^5. Forskellige dele af menneskelige øje er vist i denne figur, anvendes til at følge den nøjagtige position af vævene.

Både korrekt udskæring og korrekt opbevaring af hornhinde-og retinal væv er kritisk, da mindre fejl som f.eks endotel skader eller høje antal Descemets folder kan føre til graft svigt af hornhinden mens temperatur ændringer eller forkert håndtering kan kompromittere integriteten af ​​retinale væv. Formålet med dette oplæg er at vise, hvordan hornhinde og retinal væv kan isoleres optimalt, uden at fremkalde skader eller ændringer, der kan kompromittere deres anvendelse til transplantation eller forskningsformål. Det krævede minimum celledensitet (> 2200 celler / mm ^2), god morfologi såsom cellestørrelse, struktur, lav degeneration af intercellulære grænser og fravær af dystrofi samt god gennemsigtighed og passende tykkelse af hornhinden er kendetegnende, der gør et væv der er egnet til transplantation. Hvis skalpelblad anvendes groft eller andre instrumenter anvendes intenst det ikke kun skade på hornhinden, men også glaslegeme, hvilket gør Furtsin udskæring af andre væv vanskeligere (figur 4). Retina er et gennemsigtigt væv og derfor vanskeligt at identificere, om den glasagtige væsken frigives med den, hvilket normalt giver udskæring af retinavæv mere kompliceret. Hvis udskåret med glaslegemet, vil kvaliteten af ​​retinale væv eller ekstraherede RNA meget ringe på grund af kontaminering med andre okulære dele. Således en passende teknik at udskære en cornea eller retina er meget vigtigt at hente en overlegen kvalitet væv.

Vores tidligere data fra de sidste to år (tabel 1) viser, at cirka 60% af hornhinder, som vi indsamler fra øjet glober er velegnede til forskellige typer af transplantation. Dette er endnu et bevis på, at hornhindens excision teknikken beskrevet i dette dokument, er en god metode til opsamling af høj kvalitet hornhindens væv fra okulære glober. Hornhinderne kan naturligvis være uegnede til transplantation på grund af andre parametre ssn sådan som stromale abnormiteter, forurening, endotel tæthed / morfologi, donorers egnethed og mekaniske / fysiske traumer samtidig med at hornhinden. Hvis de ovennævnte parametre er fint, er teknikken vi har beskrevet her, tillader udtagning af god kvalitet væv, der skal anvendes til transplantation hos patienter med okulær overflade sygdomme.

Medens information om udtagning af retinale væv fra dyremodeller er almindeligt tilgængelige ^11,12, at vores viden er det første gang, at en sådan teknik er beskrevet til isolering af retinale væv fra humane øje glober. Faktisk, forskning i litteratur, ikke giver noget resultat på papir diskuterer dette emne. Vi tror, ​​at hvis menneskelige øje kloden dissektion udføres som beskrevet, vil forskere kunne få væv af god kvalitet, der skal bruges til deres forskningsprojekter. Mange øjne banker rundt om i verden er tilbøjelige til at modtage øjet pærer (men også hornhinder), der ikke eruitable til transplantation. I vores tilfælde, kan næsten 40% af hornhinder (og eye pærer), at vi indsamler og behandler ikke blive transplanteret (på grund af en bred vifte af årsager), men stadig kan anvendes til forskningsformål. Teknikken er beskrevet i dette dokument ikke tillader indsamling af høj kvalitet væv. Dette blev for nylig påvist ved vores gruppe, når der analyseres RNA med T <24 timer ekstraheres fra retinale væv, som blev høstet under anvendelse af teknikken beskrevet i dette dokument ^10. Vi tror på den samme teknik kan bruges til at isolere de retinale væv til mange andre forskellige formål såsom (i) for retinale transkriptomet undersøgelser, (ii) at undersøge og fremme brugen af menneskelige inducerede pluripotente stamceller i skræddersyet medicin ^8, (iii ) for at udvikle RNA-ekspression atlas af retinitis pigmentosa gener i humane nethinder ^9, (iv) for at optimere RNA ekstraktionsfremgangsmåde, (v) stamceller undersøgelser for at regenerere retinale væv osv.

Denne teknik wsyge være til gavn for dem, der ønsker at udføre sådanne ekscisioner eller eksperimenter, men har begrænsede oplysninger om den metode at bruge menneskefostre hornhinder eller nethinde.