En förenklad Teknik för

Mohit Parekh¹, Stefano Ferrari¹, Enzo Di Iorio¹, Vanessa Barbaro¹, Davide Camposampiero¹, Marianthi Karali², Diego Ponzin¹, Gianni Salvalaio¹

¹Fondazione Banca Degli Occhi del Veneto O.N.L.U.S., ²Telethon Institute for Genetics & Medicine (T.I.G.E.M.)

1. In situ Excision av hornhinnan från Ocular Jordglober

1. Slå på det laminära luftflödet skåp ca 15 minuter före användning. Rengöra huven laminärt flöde med användning av 70% isopropylalkohol. Sätt på personlig skyddsutrustning som kirurgisk mössa och mask. Skrubba händer och underarmar och torka med användning av en steril duk. Använd sterila handskar och klänning eller hylsor med aseptisk teknik.
2. Ställ in det sterila området genom att placera ett sterilt instrument fack aseptiskt. Kontrollera att instrumenten är sterila. Öppna den sterila instrument förpackningen och vända på det sterila fältet undvika kontaminering.
3. Placera alla sterila material och instrument (tabell 2) tillsammans med flaskor (ögonen burkar) som innehåller öga klot så att de gränsar till kanten av det sterila området för enkel användning.
4. Märk flaskan med tidigare framställd konservering / lagringsmedium såsom anges i tabell 3 och placeram på ytan av det laminära luftflödet huv tillsammans med I-PVP (jod-polyvinylpyrrolidon), natriumtiosulfat och en steril saltlösning PBS (fosfatbuffrad saltlösning).
5. Tillåta de okulära vävnaderna och lösningar för att uppnå normal rumstemperatur när de är konserverade i kylskåp vid 4 ° C. Undvik upprepade uppvärmning / kylning cykler. Håll locken av lösningen och burkar ögon med insidan uppåt bredvid sina respektive burkar.
6. Ta bort gasväv och svampar från ögat burken med steril pincett. Sänk ned världen i steril I-PVP 0,5% under 2 minuter att sanera okulära glober. Placera de två tången på locket till den sterila brickan, utanför det sterila området. Överför världen i natriumtiosulfat 0,1% under 1 minut med ett annat par av sterila pincett. Med samma tång, överföra världen att flaskan innehåller steril koksaltlösning (PBS) och lämna den tills den används. Upprepa samma procedur för den andra okulär världen från Than samma donator.
7. Arbeta under laminära luftflödet huva, linda hela världen med steril gasväv (bandage) lämnar hornhinnan och cirka 5 mm sklera från avslöjats hornhinnan. Ögat lampa kan enkelt hållas i handen upprätthålla tillräckligt tryck. Vävnaden bör hållas fuktig under hela operationen.
8. Tång används tillsammans med sax för att ta bort alla eventuella rester av bindhinnan. Håll instrument som används för ovanstående operation separat från andra instrument. Använda ett skalpellblad för att utföra ett skleralt snitt på 3-4 mm från limbus regionen och sträcker sig snittet genom 360 °, för att undvika att perforera den underliggande uveala vävnaden eller orsaka någon deformation av hornhinnan normala krökning. Skär fyra stora snitt lämnar fyra små luckor undvika utsöndring av glaskroppen. Alla fyra luckor skärs se inget avlägsnande av någon annan vävnad.
9. Förekomst av små sklerala plack kan försvåra skärningen, så se till att complete den sklerala excision med mikrokirurgiska saxar. Denna operation kan utföras utan att skada åderhinnan, näthinnan och glaskropp.
10. Inspektera snittet för att säkerställa att den är klar. Om snittet har utförts på ett korrekt sätt hornhinne-sklerala fälg följer med ciliära instanser endast vid den punkt i överensstämmelse med hornhinnan.
11. Ställa det lindade okulära globen ned nära centrum av det sterila området. Fullborda korneal avlägsnande med användning av pincetter för att hålla den sklerala kanten stationär och den hand som används för utskärning för att dra ciliarkroppen-åderhinnan nedåt och bort från hornhinne-sklerala knappen.
12. Försiktigt separera eventuella återstående sammanväxningar från hornhinne-skleral knappen. Varken dra hornhinne-skleral kanten på ett sätt som kan orsaka över hornhinnan spänning eller tillåta den att falla tillbaka ned mot den främre kammaren.
13. Den endotelcellernas densitet hornhinnan kontrolleras med hjälp av en hypoton lösning och cellen dödligheten kontrolleras med hjälp av en Trypen blåfärgning efter omkring 1 minut och cellerna räknades sedan under ett optiskt mikroskop och mättes som celler / mm ^2. Den främre kammaren ska vara vänd locket medan den bakre ska vara vänd ner i Petri plattan. Den endotelceller tätheten kunde räknas manuellt med ett rutnät i mål enligt 100X förstoring. Det minsta accepterade celltal för transplantation i Italien är 2200 endotelceller / mm ^2.
14. Överföra hornhinne-sklerala kanten med användning av en korneal klo till tidigare framställda korneal lagringsmedium konserverade vid RT (rumstemperatur) såsom visas i tabell 3.
15. Undersök den bakre kammaren för en naturlig kristallin lins. Om sklera är beredd, ta bort alla rester av druvhinna och glaskroppen från världen. Försiktigt packa och returnera den återstående bakre segmentet till dess respektive öga burk, med aseptisk teknik. Upprepa proceduren för den andra världen med hjälp av nya instrument. Fäst hornhinnan with hornhinnan klo och bevara under lagringsmedia (orgel kultur) vid 31 ° C. Det utskurna hornhinnan, såsom visas i figur 1a, kan sedan användas för keratoplastik och forskning.
16. Kasta onödiga material och bio-farligt avfall i lämpliga avfallskärl. Rengör arbetsområdet när arbetet är färdigt att använda 70% isopropylalkohol spray.
17. Om, efter 28 dagar hornhinnan håller alla utvärderingar parametrar [såsom morfologi, cellräkning, öppenhet, tjocklek och mikrobiologi tester - bakterier och svamp med Bactec 9240 instrument (Becton Dickinson, Milano, Italien)], kan den sedan transporteras till sjukhusen hjälp transportmediet visas i tabell 4. Hornhinnan bör tas bort och placeras från lagringsutrymmet att transportera medium under laminärt luftflöde skåp.
18. Som under lagring blir hornhinnan tjockare än vanliga storleken som krävs för transplantation, ögonbanker använder de svällande medel för att minska tjockleken. Vianvända 6% dextran T500 att få hornhinnan tillbaka till sin normala storlek i transportmedium. Även 4-8% dextran T500 kan användas, har 6% varit bäst för oss. Detta gör det lättare för kirurger att transplantera hornhinnan så snart de får det.

2. Urtagning av Retina från Ocular Globe efter skära hornhinnan

1. Efter excision är hornhinnan väljs för transplantation eller forskning baserad på morfologi och endotelceller densitet och placeras i lagring eller konservering medium vid 31 ° C. Återstoden av den okulära världen sedan bearbetas för vidare användning som sklera isolering för kirurgiska ändamål, näthinnan för forskning mm
2. Före retinal excision, se till att den okulära världen är intakt och endast hornhinnan med en del av sklera tas bort. Om den gelatinösa glaskroppen är utsöndrar ut det blir svårt att avlägsna en näthinnevävnad.
3. Om givaren är under 65 år, är skleraförvaras i sterila PBS för kirurgiska ändamål efter serologiska tester. I detta fall är sklera inte skära, bara glaskroppen tas bort och hela sklera bevaras.
4. För retinal excision, börja med en liten snitt eller snitt från hornhinnan sidan av sklera rör sig mot synnerven med sterila pincett och sax. Hålla delen av sklera med användning av pincett och skars med sax rak riktning mot den optiska nerven skärning del för del undvika skada på den vitrösa kroppen.
5. Koroidala plack bör separeras från sklera när de sitter ihop. Skär hela sklera att exponera åderhinnan vävnaden. När väl den sklera är helt skära, separera den sklera med återstoden av den vitrösa kroppen genom att skära den i närheten av synnerven. En hel boll av glaskroppen täckt med åderhinnan kommer att vara synlig, såsom visas i fig. 2a.
6. Med hjälp av två steril tång bort åderhinnan lagret försiktigt genom att plocka upp det med enpincett och avlägsna den med den andra. Alternativt kan åderhinnan skiktet avlägsnas med användning av sax, men detta bör helst undvikas eftersom det kan orsaka skador på näthinnan. Ta bort åderhinnan lagret delvis och skär den för att underlätta avlägsnande.
7. När väl åderhinnan skiktet avlägsnas, kommer en transparent skikt av näthinnan ses tydligt, såsom visas i figur 2b. Åderhinnan skiktet har en inre Bruchs membran som också kan avlägsnas men det är svårt att identifiera den med en blotta ögat.
8. På liknande sätt använder två pincett för att avlägsna retinaskiktet såsom visas i figur 2c. Det är lätt att isolera stora mängder av näthinnan om exciderades nära den optiska nerven. Alla skikten hos ögat kan nu betraktas som visas i figur 2d.
9. När väl näthinnevävnad har avlägsnats, kan det användas för olika ändamål och därför efterföljande steg och betingelser som används för skydd kan variera i enlighet därmed. Till exempel,näthinnans vävnad kan placeras i rör som innehåller RNA-stabilisering reagens (t.ex. RNAlater) eller lysisbuffert (för RNA eller DNA-extraktion), dispas / trypsin (för isolering av celler), fastställer lösningar (före att bädda vävnader i paraffin eller oktober för att immunohistokemi).
10. Rensa alla arbetsområdet och rengör området med hjälp av 70% isopropylalkohol spray.

3. Representativa resultat

Den hornhinne-sklerala kanten såsom framgår av figur 1a är en korrekt exciderades hornhinnan med erforderlig mängd skleral fälgen och endotelial morfologi, denna typ av hornhinnan är vanligtvis används för penetrerande keratoplasti. Om den främre stroman av det exciderade hornhinnan skadas med närvaron av opacitet, kan hornhinnan användas för endotelial keratoplasti / posteriora lamellär keratoplasti (endotel med en del av stromat). För om endotelskiktet är skadad eller om endotelcell tätheten är <2200 celler / mm ² (DetAlian standard), kunde hornhinnan användas för främre lamellär keratoplasti (epitel med en del av främre stroman). Om antal endotelceller är mindre än den erforderliga, kan hornhinnan användas för främre lamellär keratoplasti eller forskning medan om hornhinnan är skadad helt, kan det användas för forskning, som visas i figur 1b, 3b och 3c, eller kasseras. Skadan kan vara en orsak till misskötsel vävnaden före gråstarroperationer leder till stromala eller Descemets endotelceller ärr, utveckling av fysisk skada under patientens liv etc. Därför blir det nödvändigt att kontrollera varje vävnad med spaltlampa och sedan under optiskt mikroskop för fina ärr / veck / avdelningar. Hornhinnan vanligen förvaras i två olika tillstånd, såsom organkultur (ca 31 ° C) vanligtvis i europeiska länder eller hypotermiska förhållanden (omkring 4 ° C) vanligtvis används i USA. Vi använder organkultur eftersom det hjälper att regenerera dammenåldern epitelceller, att åter vitalisera endotelcell kontroll med en hög post mortem tid ger en lagringstid på 4 veckor som ger tillräckligt fönster för att planera en operation, tillräcklig tid för mikrobiologisk (bakterier och svampar) och serologisk testning etc. Hornhinnan kan också bevaras i transportmediet under 7 dagar.

Sklera skulle skäras en del av en del att se skonsam avlägsnande av alla koroidala plack. Den glasartade vätskan kan utsöndra när synnerven, åderhinnan eller näthinnan skärs kraftigt som visas i figur 4. Näthinnor Om utskurna för RNA-analys bör bevaras i RNAlater så snart vävnaderna excideras. Vanligtvis 1x1 cm av åderhinnan och näthinnan lagret skärs och efter att hålla den i RNAlater i 24 timmar vid 4 ° C förvaras i -80 ° C i nya Eppendorf-rör (safe-lock rör, 2 ml) tills används eller transporteras med torr is. Den näthinnevävnad ska ut med två tänger i närheten synnerven från iriseller ciliära marginal för att undvika kontaminering med andra pigmenterade strukturer och bör överföras till att bevara behållaren omedelbart när RNA blir instabil när hämta näthinnan.

Figur 1 Jämförelse mellan en bra och en dålig kvalitet hornhinna. A) En korrekt skars hornhinna. Sådan hornhinnan vanligtvis förvaras i organkultur i 4 veckor. Mikrobiologisk (med Bactec 9240 instrument) och morfologiska (färgning av celler med trypanblått för cell mortalitet beslutsamhet och observera celler under ett optiskt mikroskop med 100X förstoring) undersökning utförs innan du transporterar den till sjukhuset (figur 3a), b) en böjd hornhinna , leder som slutligen till transplantatavstötning på grund av hög Descemets veck och hög endotelcellskada undersöktes med användning av ett mikroskop spaltlampa. En sådan hornhinna används vanligen för förnybara energikällorök eller kastas bort.

Figur 2. Metod för att säkerställa en korrekt excision av näthinnans vävnad. A) Analysera sklera från okulära världen med 24mm blad med 95 mm böjd eller trubbiga änden steril sax och 100 11X2 mm styrs av 0,70 mm Tänder steril pincett. Sklera ska klippas genom att hålla en sida med pincetten skära rakt mot synnerven med hjälp av sax. Åderhinnan lagret kommer nu att lätta att se, b) Med hjälp av två 100 mm 11X2 styrs av 0,70 mm Tänder sterila pincett är åderhinna bort genom att riva sönder den, som avslöjar underliggande transparenta retinaskiktet, c) Transparent retinaskiktet skärs mycket noga i närheten synnerven utan utsöndring av glaskroppen vätska med samma tång. Både tången skulle hålla varje sida av näthinnan och vävnaden bör försiktigt tas bort Starting nära den optiska nerven i riktning mot hornhinnan, för att erhålla en god mängd av näthinnevävnad. Vävnaden kan skäras i olika storlekar och som används för analys försök, d) Olika skikt i ögat efter hornhinnan borttagning kan ses i denna siffra. Åderhinnan kroppen avlägsnas först följt av näthinnan utan att skada andra delar av ögat.

Figur 3. Jämförelse av de olika typerna av celldensiteten och morfologi studerades under 100X förstoring av ett optiskt mikroskop. En) Bra endotelcell densitet (> 2200 celler / mm ²⁾ och morfologi (mindre polymorfism, låg degeneration, ingen dystrofi och 0% dödlighet) i en hornhinna, vilken är lämplig för transplantation, b) Dålig endotelcell densitet (cirka 1200 - 1400 celler / mm ²⁾ och morfologi (mycket hög polymorfism och Degenbete av celler) tillsammans med ca 30-40% totala dödligheten observeras efter trypan blue-färgning, och c) En del av endotelceller skadas beroende på frigöring av en endotelial arket medan hämtning hornhinnan från okulära globen. Detta bekräftas genom att observera dödligheten av cellerna i regionen färgade med trypanblått, d) Descemets veck bildas på grund av misskötsel av hornhinnan genom att böja, vilket skapar kors hornhinnan spänningar med hjälp av instrument som intensivt etc vid tiden för excision. Figuren visar de tjocka utvecklade iatrogena veck som finns mellan periferin och optiska zonen av hornhinnan.

Figur 4. Skador på åderhinnan och retina vävnader medan excidering hornhinnan så småningom leder till utsöndring av glaskroppsvätska. Näthinnan blir inblandat i den vitrösa kroppen gör det svårt att skära en god kvalitet vävnad wiDC-layout kontaminering.

Tabell 1. Sammanfattning av olika aktiviteter som utförs använda mänskliga ögats klot under 2009 och 2010 Fondazione Banca Degli Occhi (Venezia, Italien). Ungefär 60% av vävnader användes för transplantation, vilket lämnar ett stort antal okulära klot (cirka 40%) för vetenskaplig och medicinsk forskning.

Kompletterande Figur 1. Anatomi av det mänskliga ögat ^5. Olika delar av människans öga indikeras i denna figur, som används för att följa den exakta positionen av vävnaderna.

Både rätt excision och korrekt bevarande av hornhinnan och retinal vävnader är kritiska som mindre defekter som endotelial skada eller stort antal Descemets veck kan leda till transplantat misslyckande av hornhinnan, medan temperatur förändringar eller misskötsel kan äventyra integriteten i retinala vävnader. Syftet med denna uppsats är att visa hur hornhinnan och retinal vävnader kan isoleras optimalt, utan att inducera skador eller förändringar som kan äventyra deras användning för transplantation eller forskningsändamål. Den erforderliga minsta celltätheten (> 2200 celler / mm ^2), god morfologi som cellstorlek, struktur, låg degeneration av intercellulära gränser och avsaknad av muskeldystrofi tillsammans med god transparens och korrekt tjocklek på hornhinnan är kännetecken som gör en vävnad som lämpar sig för transplantation. Om skalpellblad används ungefär eller andra instrument används intensivt, inte bara skada på hornhinnan, men även glaskroppen som gör Furthennes excision av andra vävnader svårare (figur 4). Retina är ett transparent vävnad och därför svår att identifiera om glaskroppen vätskan frigörs med det, detta normalt gör excision av näthinnevävnad mer komplicerad. Om ut med glaskropp, kommer kvaliteten på näthinnans vävnad eller extraherade RNA vara mycket dålig på grund av kontaminering med andra okulära delar. Sålunda är en lämplig teknik för att skära en hornhinna eller näthinnan mycket viktig för att hämta en överlägsen kvalitet vävnad.

Våra tidigare uppgifter från de senaste två åren (Tabell 1) visar att cirka 60% av hornhinnor som vi samlar in från eye kloten är lämpliga för olika typer av transplantation. Detta är ytterligare bevis på att hornhinnans excision teknik som beskrivs i detta dokument är en bra metod för att samla hög kvalitet hornhinnan vävnader från okulära glober. Hornhinnorna kan naturligtvis vara olämpliga för transplantation på grund av andra parametrar sn sådan som stromala avvikelser, förorening, endotelial densitet / morfologi, givares lämplighet och mekanisk / fysisk skador orsakade samtidigt hornhinnan. Om emellertid de ovan angivna parametrarna är bra, kan den teknik som vi har beskrivit här hämtning av god kvalitet vävnader som skall användas för transplantation hos patienter med sjukdomar på ögats yta.

Även om information om urtagning av retinala vävnader från djurmodeller är allmänt tillgänglig ^11,12, så vitt vi vet är detta första gången som en sådan teknik beskrivs för isolering av retinala vävnader från mänskliga ögat glober. I själva verket, forskning om litteraturen, inte gav något resultat på papper diskutera detta ämne. Vi tror att om mänsklig okulär världen dissektion utförs enligt beskrivningen skulle forskarna kunna få vävnader av god kvalitet för att användas för sina forskningsprojekt. Många ögonbanker runt om i världen kommer sannolikt att få öga lökar (men även hornhinnor) som inte äruitable för transplantation. I vårt fall kan nästan 40% av hornhinnor (och ögon glödlampor) som vi samlar in och processen inte transplanteras (på grund av en rad olika orsaker) men kan ändå användas för forskningsändamål. Den teknik som beskrivs i detta dokument medger insamling av högkvalitativa vävnader. Detta nyligen visats av vår grupp när man analyserar RNA med T <24 timmar ur retinala vävnader som skördats användning av den teknik som beskrivs i detta dokument ^10. Vi tror att samma teknik kan användas för att isolera de retinala vävnaderna för många andra olika ändamål såsom (i) för näthinnan Transkriptom studier, (ii) för att studera och främja användningen av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller i personlig medicin ^8, (iii ) för att utveckla RNA-expression atlas av retinitis pigmentosa gener i humana näthinnor ^9, (iv) för att optimera RNA-extraktion metod, (v) stamceller studier för att regenerera retinala vävnader etc.

Denna teknik wsjuk vara till nytta för dem som vill utföra sådana excisioner eller experiment, men har begränsad information om metoden att använda mänskliga hornhinnor eller näthinnor.