Une technique simplifiée pour

Mohit Parekh¹, Stefano Ferrari¹, Enzo Di Iorio¹, Vanessa Barbaro¹, Davide Camposampiero¹, Marianthi Karali², Diego Ponzin¹, Gianni Salvalaio¹

¹Fondazione Banca Degli Occhi del Veneto O.N.L.U.S., ²Telethon Institute for Genetics & Medicine (T.I.G.E.M.)

1. Dans excision in situ de la cornée à partir de globes oculaires

1. Allumez la hotte à flux laminaire de l'air environ 15 minutes avant utilisation. Nettoyer la hotte à flux laminaire en utilisant 70% d'alcool isopropylique. Mettre des vêtements de protection individuelle tels que bonnet de chirurgien et le masque. Frotter les mains et les avant-bras et sécher avec une serviette stérile. Porter des gants stériles et une blouse ou des manchons en utilisant une technique aseptique.
2. Mettre en place le champ stérile en plaçant un plateau instrument stérile de façon aseptique. Vérifiez que les instruments sont stériles. Ouvrez l'emballage stérile des instruments et retourner sur le champ stérile en évitant toute contamination.
3. Placez tous les matériaux et des instruments stériles (tableau 2) ainsi que des bouteilles (pots oculaires) contenant globes oculaires afin qu'ils soient à proximité du bord du champ stérile pour la facilité d'utilisation.
4. Étiquetez les bouteilles avec la préservation préalablement préparé / support de stockage comme indiqué dans le tableau 3 et placez lem sur la surface de la hotte à écoulement laminaire d'air le long d'I-PVP (polyvinylpyrrolidone iodée-), le thiosulfate de sodium et une solution saline stérile PBS (solution saline de tampon phosphate).
5. Autoriser les tissus oculaires et des solutions pour atteindre la température ambiante normale car ils sont conservés dans des réfrigérateurs à 4 ° C. Eviter de multiplier les réchauffement / refroidissement des cycles. Gardez les couvercles de la solution et les bocaux avec les yeux face intérieure tournée vers le haut à côté de leurs pots respectifs.
6. Retirer gazes et les éponges de la jarre œil en utilisant des pinces stériles. Plongez dans le monde stérile I-PVP 0,5% pendant 2 minutes pour décontaminer les globes oculaires. Placer les deux pinces sur le couvercle du bac stérile, en dehors du champ stérile. Transfert du globe en thiosulfate de sodium 0,1% pendant 1 minute en utilisant une autre paire de pinces stériles. En utilisant les mêmes pinces, transférer le globe à la bouteille contenant une solution saline stérile (PBS) et le laisser jusqu'à ce qu'il soit exploité. Répétez la même procédure pour le globe oculaire d'autres à partir de til même donneur.
7. De travail sous la hotte à flux laminaire de l'air, envelopper le monde entier en utilisant une gaze stérile (bandages), laissant la cornée et d'environ 5 mm sclérotique de la cornée à découvert. L'ampoule œil pouvait être simplement tenu à la main en maintenant la pression adéquate. Le tissu doit être maintenue humide durant toute l'opération.
8. Les forceps sont utilisés avec des ciseaux pour enlever tous les restes éventuels de la conjonctive. Gardez les instruments utilisés pour l'opération ci-dessus séparée des autres instruments. Utilisation d'une lame de scalpel pour effectuer une incision sclérale de 3-4 mm de la région limbe, puis l'incision s'étend de 360 ​​°, en évitant de perforer le tissu sous-jacent ou uvéal provoquer une déformation de courbure normale de la cornée. Couper quatre incisions de grandes lacunes en laissant quatre petites en évitant la sécrétion du corps vitré. Tous les quatre lacunes sont coupés assurer aucun enlèvement de tout autre tissu.
9. Présence de petites plaques sclérales peuvent entraver la coupe, alors assurez-vous complete l'excision scléral avec des ciseaux de microchirurgie. Cette opération doit être réalisée sans endommager le corps choroïde, la rétine et du vitré.
10. Inspecter l'incision afin de s'assurer qu'elle est complète. Si l'incision a été effectuée correctement, la cornéo-sclérales adhère à la jante des corps ciliaires seulement au point de correspondance avec la cornée.
11. Réglez le globe oculaire vers le bas enveloppé près du centre du champ stérile. Terminez le retrait cornée en utilisant une pince pour tenir la jante scléral stationnaire et la main utilisée pour l'excision de tirer le corps ciliaire-choroïde vers le bas et en dehors du bouton cornéo-scléral.
12. Séparez délicatement les adhérences restantes à partir du bouton cornéo-scléral. Ni tirez la jante cornéoscléral d'une manière qui pourrait causer des croix-cornéen tension ni lui permettre de redescendre sur la chambre antérieure.
13. La densité des cellules endothéliales de la cornée est vérifiée en utilisant une solution hypotonique, et la mortalité des cellules est vérifiée en utilisant un trypune coloration bleue pendant environ 1 min et les cellules sont ensuite comptées sous un microscope optique et mesurée en tant que cellules / mm ^2. La chambre antérieure doit faire face le couvercle tandis que le postérieur doit faire face le fond de la boîte de Pétri. La densité des cellules endothéliales pouvaient être comptés manuellement à l'aide d'une grille dans l'objectif sous un grossissement de 100X. Le nombre de cellules minimale acceptée pour la transplantation en Italie est de 2200 cellules endothéliales / mm ^2.
14. Transfert de la jante cornéoscléral utilisant une griffe cornée à support de stockage préalablement préparé la cornée conserve à température ambiante (température ambiante), comme indiqué dans le tableau 3.
15. Examiner la chambre postérieure d'un cristallin naturel. Si la sclérotique est préparé, enlever tous les résidus de l'uvée et l'humeur vitrée du globe. Soigneusement déballer et retourner le segment restant postérieure à son bocal oeil respectif, en utilisant une technique aseptique. Répétez la procédure pour le monde d'autres à l'aide de nouveaux instruments. Fixer l'esprit la cornéeh griffe cornée et de préserver dans les supports de stockage (culture de l'orgue) à 31 ° C. La cornée excisée, comme le montre la figure 1a, peut alors être utilisé pour kératoplastie ou de recherche.
16. Éliminer les matériaux inutiles et bio-déchets dangereux dans les poubelles appropriées. Nettoyer la zone de travail une fois que le travail est terminé en utilisant 70% de pulvérisation d'alcool isopropylique.
17. Si, après 28 jours de la cornée conserve tous les paramètres d'évaluation [tels que la morphologie, la numération des cellules, la transparence, l'épaisseur et les tests de microbiologie - bactérienne et fongique en utilisant l'instrument Bactec 9240 (Becton Dickinson, Milan, Italie)], il peut alors être transporté à les hôpitaux en utilisant le moyen de transport indiqué dans le tableau 4. La cornée doit être retiré et placé dans le stockage pour le transport de fluide sous hotte à flux laminaire de l'air.
18. Comme, pendant le stockage, la cornée devient plus épaisse que sa taille habituelle nécessaire pour la transplantation, les banques oculaires utiliser de l'enflure des agents pour réduire l'épaisseur. Nousutiliser 6% de dextrane T500 pour obtenir la cornée à sa taille normale en milieu de transport. Bien que 4-8% de dextran T500 pourrait être utilisé, 6% qui a le mieux servi pour nous. Cela rend plus facile pour les chirurgiens de transplantation de la cornée dès qu'ils le reçoivent.

2. L'éviscération de Retina du Globe oculaire après la suppression des Cornea

1. Après excision, la cornée est sélectionné pour la transplantation ou à la recherche sur la base de la morphologie et la densité des cellules endothéliales et est placé dans l'espace de stockage ou de conservation à 31 ° C. Le reste du globe oculaire est ensuite traitée pour une utilisation ultérieure comme l'isolement sclère à des fins chirurgicales, de la rétine pour la recherche, etc
2. Avant l'excision de la rétine, assurez-vous que le globe oculaire est intact et que seul la cornée avec une partie de la sclérotique est retiré. Si le corps vitré est gélatineuse sécrétant des, il devient difficile de retirer un tissu rétinien.
3. Si le donneur est en dessous de 65 ans, la sclérotique estconservés sous PBS stérile à des fins chirurgicales après des tests sérologiques. Dans ce cas, la sclérotique n'est pas coupé, seul le corps vitré est enlevé et la sclérotique entier est conservé.
4. Pour l'excision de la rétine, commencer avec une petite coupure ou de l'incision de la cornée côté de la sclérotique se déplaçant vers le nerf optique à l'aide de pinces stériles et des ciseaux. Tenez la partie de la sclérotique aide de pinces et couper avec les ciseaux en ligne droite vers le nerf optique de coupe de part en part en évitant d'endommager le corps vitré.
5. Choroïdiens plaques doit être séparée de la sclérotique qu'ils sont collés ensemble. Couper la sclérotique ensemble pour exposer le tissu choroïde. Une fois la sclérotique est complètement coupé, séparer la sclère avec le reste du corps vitré en le coupant près du nerf optique. Une boule entière de corps vitré recouvert de la choroïde sera visible comme le montre la figure 2a.
6. L'utilisation de deux pinces stériles enlever la couche choroïde doucement par le ramasser avec unpaire de forceps et le retirer de l'autre. Alternativement, la couche choroïde peut être enlevé avec des ciseaux, mais cela devrait idéalement être évitée car elle peut causer des dommages à la rétine. Retirer la couche de la choroïde et la couper partiellement pour faciliter le transfert.
7. Une fois la couche choroïde est retiré, une couche transparente de la rétine va être perçu clairement comme le montre la Figure 2b. La couche choroïde a membrane de Bruch une intérieure, qui pourraient également être supprimées, mais il est difficile de l'identifier à l'oeil nu.
8. De même, utiliser deux pinces pour enlever la couche de rétine comme le montre la figure 2c. Il est facile d'isoler le montant élevé de la rétine si excisé près du nerf optique. Toutes les couches de l'œil pourrait être désormais considérée comme le montre la figure 2d.
9. Une fois le tissu rétinien a été enlevé, il pourrait être utilisé à des fins différentes et donc les étapes suivantes et les conditions utilisées pour la conservation peut donc varier en conséquence. Par exemple,le tissu rétinien peut être placé dans des tubes de stabilisation contenant de l'ARN réactifs (tels que RNAlater) ou un tampon de lyse (pour l'extraction d'ARN ou ADN), la dispase / trypsine (pour l'isolement de cellules), des solutions de fixation (avant d'incorporer les tissus dans de la paraffine et OCT immunohistochimie).
10. Effacer toute la zone de travail et nettoyer la zone à l'aide de 70% de pulvérisation d'alcool isopropylique.

3. Les résultats représentatifs

La jante cornéoscléral comme on le voit dans la figure 1a est une cornée correctement excisée avec la quantité requise de la jante et de la morphologie endothéliale scléral, ce genre de la cornée est généralement utilisé pour kératoplastie. Si le stroma de la cornée antérieure excisé est endommagé avec présence d'opacité, la cornée peut être utilisé pour kératoplastie endothéliale / postérieure kératoplastie lamellaire (endothélium avec une partie de stroma). Considérant que, si la couche endothéliale est endommagée ou si la densité cellulaire endothéliale est <2200 cellules / mm ² (IlAlian standard), la cornée peut être utilisé pour kératoplastie lamellaire antérieure (épithélium avec une partie de antérieure du stroma). Si le nombre de cellules endothéliales est inférieure à la nécessaire, la cornée peut être utilisé pour kératoplastie lamellaire antérieure ou de recherche tandis que, si la cornée est endommagée complètement, il pourrait être utilisé pour la recherche comme le montre la figure 1b, 3b et 3c ou mis au rebut. Les dommages pourraient être une cause de mauvaise manipulation du tissu, les chirurgies de la cataracte avant menant à stromales ou Descemet cicatrices endothéliales, le développement de la blessure physique au cours etc la vie du patient Par conséquent, il devient nécessaire de vérifier tous les tissus avec lampe à fente, puis sous le microscope optique pour fines cicatrices ou des plis et détachements. La cornée est habituellement conservée dans deux conditions différentes, comme la culture d'organes (environ 31 ° C) habituellement utilisé dans les pays européens ou les conditions d'hypothermie (environ 4 ° C) habituellement utilisé aux Etats-Unis. Nous utilisons la culture d'organes, car il contribue à régénérer le barrageâge des cellules épithéliales, de revitaliser contrôle des cellules endothéliales avec un temps de post-mortem de haut, une période de stockage de 4 semaines, ce qui donne la fenêtre suffisante pour la planification d'une chirurgie, donne suffisamment de temps pour les tests microbiologiques (bactéries et champignons) et sérologiques, etc La cornée peut être bien conservés dans le milieu de transport pour 7 jours.

La sclérotique pourrait être réduit de part en part assurer l'élimination en douceur toutes les plaques choroïdiens. Le liquide du vitré peuvent excréter lorsque le nerf optique, la choroïde ou de la rétine est fortement diminuée comme le montre la figure 4. Rétines si excisées pour l'analyse d'ARN doivent être conservés dans le RNAlater dès que les tissus sont excisées. Habituellement 1X1 cm de la choroïde et la rétine couche est excisé et après le garder dans RNAlater pendant 24 heures à 4 ° C est conservé sous -80 ° C dans des tubes Eppendorf frais (tubes Safe-Lock, 2 ml) jusqu'à son utilisation ou expédiés à sec glace. Le tissu rétinien devrait être excisée à l'aide de deux pinces à proximité du nerf optique loin de l'irisou de la marge ciliaire à éviter une contamination par d'autres structures pigmentées et doit être transférée dans le récipient en préservant immédiatement ARN obtient instable lors de la récupération de la rétine.

Figure 1: Comparaison entre une bonne et une cornée de mauvaise qualité:. A) Une cornée correctement excisée. Une telle cornée est habituellement conservé dans la culture d'organe pendant 4 semaines. Microbiologiques (en utilisant l'instrument Bactec 9240) et morphologiques (coloration des cellules avec du bleu trypan pour la détermination de la mortalité cellulaire et en observant les cellules sous un microscope optique avec un grossissement de 100X) l'examen est effectué avant de le transporter à l'hôpital (figure 3a), b) une cornée plié , ce qui mène finalement à un rejet du greffon en raison de plis à haute Descemet et haute dommages aux cellules endothéliales examinés à l'aide d'un microscope lampe à fente. Une telle cornée est habituellement utilisé pour les research ou est rejeté.

Figure 2. Méthode utilisée pour assurer une excision précise du tissu rétinien. A) Dissection de la sclérotique de l'globe oculaire à l'aide de lame 24mm avec 95 mm ou des ciseaux courbes extrémités franches stériles et 100 mm 11x2 gouvernés par 0,70 mm pince dents stériles. La sclérotique doit être coupé par la tenue d'un côté avec la pince en le coupant tout droit vers le nerf optique à l'aide des ciseaux. La couche choroïde sera maintenant facile de voir; b) L'utilisation de deux 100 mm 11x2 gouvernés par 0,70 mm dents des pinces stériles, de la choroïde est éliminé par le déchirer, ce qui révèle le sous-jacent couche transparente la rétine; c) Transparent couche de la rétine est excisé très soigneusement à proximité de le nerf optique, sans l'excrétion du fluide vitreux en conformité avec la pince mêmes. Les deux pinces devrait tenir de chaque côté de la rétine et le tissu doit être enlevé doucement starting près du nerf optique se déplaçant vers la cornée, pour obtenir une bonne quantité de tissu rétinien. Le tissu peut être coupé en différentes tailles et utilisés pour des expériences d'analyse; d) Les différentes couches de l'œil après l'enlèvement de cornée peut être consulté dans cette figure. Le corps est retiré choroïde d'abord suivi par la rétine sans endommager les autres parties de l'oeil.

Figure 3. Comparaison des différents types de densité cellulaire et de la morphologie vues sous un grossissement de 100 fois un microscope optique. A) la densité des cellules endothéliales bonne (> 2200 cellules / mm ²⁾ et de la morphologie (polymorphisme moins, la dégénérescence faible, la dystrophie pas et 0% mortalité) dans une cornée qui est approprié pour la transplantation, b) la densité des cellules endothéliales pauvre (environ 1200 - 1400 cellules / mm ²⁾ et de la morphologie (polymorphisme très élevé et dégénérescenceration des cellules) avec environ 30-40% de la mortalité globale sont observées après coloration au bleu trypan; c) Une partie des cellules endothéliales sont endommagés en raison de détachement d'une feuille endothéliale lors de la récupération de la cornée à partir de globe oculaire. Ceci est confirmé par l'observation de la mortalité des cellules dans la région teinté au bleu trypan; d) plis de Descemet sont formés en raison de mauvaise gestion de la cornée par pliage, la création de croix de tension de la cornée, en utilisant les instruments intensément etc au moment de l'excision. La figure montre les épais développés plis iatrogènes trouvés entre la périphérie et la zone optique de la cornée.

Dommages Figure 4. À la choroïde et la rétine tout en tissus à exciser la cornée mène éventuellement à l'excrétion du fluide vitré. La rétine se impliqué dans le corps vitré qui rend difficile l'accise un bon tissu de qualité wiThout contamination.

Tableau 1. Résumé de la gamme d'activités effectuées à l'aide globes oculaires humains en 2009 et 2010 à la Fondazione Banca Degli Occhi (Venezia, Italie). Environ 60% des tissus ont été utilisés pour la transplantation, laissant ainsi un grand nombre de globes oculaires (environ 40%) pour la recherche scientifique et médicale.

Figure 1 supplémentaire. Anatomie de l'oeil humain ^5. Différentes parties de l'œil humain sont indiqués dans cette figure, utilisée pour suivre la position exacte des tissus.

Les deux, l'excision correcte et la bonne conservation des tissus de la cornée et la rétine sont essentielles comme des défauts mineurs tels que des lésions endothéliales ou nombre élevé de plis de Descemet peut conduire à l'échec de greffe de la cornée tandis que les modifications de température ou une mauvaise manipulation peut compromettre l'intégrité des tissus rétiniens. Le but de cet article est de montrer comment les tissus de la cornée et la rétine peut être isolé de manière optimale, sans induire des dommages ou des altérations qui pourraient compromettre leur utilisation aux fins de transplantation ou à des fins de recherche. La densité minimale requise de cellule (> 2200 cellules / mm ^2), une bonne morphologie tels que la taille des cellules, la structure, la dégénérescence faible des frontières intercellulaires et l'absence de la dystrophie avec une bonne transparence et l'épaisseur propre de la cornée sont des caractéristiques qui font un tissu apte à la transplantation. Si la lame du scalpel est utilisé en gros ou d'autres instruments sont utilisés intensément, il n'est pas seulement endommager la cornée, mais aussi le corps vitré qui fait Furtson excision des tissus autres plus difficiles (Figure 4). Rétine est un tissu transparent et donc difficiles à identifier si le liquide vitreux est libéré avec elle, ce qui rend normalement l'excision du tissu rétinien plus compliqué. Si excisé avec le corps vitré, la qualité du tissu rétinien ou l'ARN extrait est très faible en raison d'une contamination par des pièces oculaires autres. Ainsi, une technique appropriée pour une cornée d'accise ou de la rétine est très important pour récupérer un tissu de qualité supérieure.

Nos données antérieures des deux dernières années (tableau 1) indiquent qu'environ 60% des cornées que nous recueillons auprès de globes oculaires sont adaptés à différents types de transplantation. C'est une nouvelle démonstration que la technique d'excision cornée décrite dans le présent document est une bonne méthode pour la collecte de haute qualité à partir de tissus cornéens globes oculaires. Les cornées peuvent, bien sûr, ne pas convenir pour une transplantation en raison d'autres paramètres sne telle que des anomalies du stroma, la contamination, la densité endothéliale / morphologie, l'admissibilité des donneurs et des traumatismes mécaniques / physiques causés tout en conservant la cornée. Toutefois, si les paramètres ci-dessus sont très bien, la technique que nous avons décrit ici permet la récupération des tissus de bonne qualité pour être utilisés pour la transplantation chez les patients atteints de maladies de la surface oculaire.

Bien que l'information sur l'éviscération des tissus rétiniens à partir de modèles animaux est largement disponible ^11,12, à notre connaissance, c'est la première fois qu'une telle technique est décrite pour l'isolement des tissus rétiniens de globes oculaires de l'homme. En effet, la recherche sur la littérature, n'ont donné aucun résultat sur les papiers qui parlent de ce sujet. Nous croyons que si l'homme dissection globe oculaire est réalisée comme décrit, les chercheurs seraient en mesure d'avoir des tissus de bonne qualité pour être utilisés pour leurs projets de recherche. Beaucoup de banques des yeux à travers le monde sont susceptibles de recevoir des ampoules oculaires (mais aussi cornées) qui ne sont pas suitable pour la transplantation. Dans notre cas, près de 40% des cornées (yeux et les ampoules) que nous collectons et le processus ne peut pas être transplanté (en raison d'un large éventail de causes), mais pourrait encore être utilisé à des fins de recherche. La technique décrite dans le présent document ne permettre la collecte de tissus de haute qualité. Cela a été démontré récemment par notre groupe lors de l'analyse d'ARN avec T <24h extraite de tissus rétiniens qui ont été récoltées en utilisant la technique décrite dans cet article ^10. Nous croyons que la même technique pourrait être utilisée pour isoler les tissus rétiniens pour de nombreuses autres fins différentes telles que (i) pour l'étude du transcriptome de la rétine, (ii) d'étudier et de promouvoir l'utilisation de l'homme cellules souches pluripotentes induites dans la médecine personnalisée ^8, (iii ) pour développer expression de l'ARN atlas des gènes rétinite pigmentaire, à l'homme rétines ^9, (iv) pour optimiser la méthode d'extraction d'ARN, (v) les études de cellules souches pour régénérer les tissus de la rétine, etc

Cette technique de wmal être bénéfique pour ceux qui veulent effectuer des excisions ou des expériences telles, mais ont peu d'informations sur la méthode à utiliser cornées humaines ou la rétine.