アレルゲン誘発性喘息のマウスモデル

I.アレルゲンの感作とチャレンジ（ 図1を参照）

気管内チャレンジA.

1. 初期作では、卵白アルブミン20μgの（; Sigma-Aldrich社、セントルイス、MO OVA）を0日目にして、再度7日目の雄または雌C57BL / 6またはBALB / cマウス（6-8週齢）腹腔内に注入する2水酸化アルミニウムのミリグラム（Sigma-Aldrich社）またはコントロールとして滅菌PBS 0.2ml中2mgの水酸化アルミニウムとを含む緩衝生理食塩水（PBS）滅菌リン酸0.2 mlで乳化した。
2. 適切な抗原とチャレンジ（例えば、日14、16、18、20ページ）。チャレンジ手順は次のとおりです。
3. ケタミン（90 mg / kg）及びキシラジン（10 mg / kg）の混合物の腹腔内（ip）注射でマウスを麻酔。マウスは、少なくとも10分間完全に麻酔であることを確認します。
4. 45度以上の角度で操作面。この上向きの腹側を保持面と上部の頭の上に置いてマウス。
5. フックトン後頭部を保持するために、フロント歯下hread。レベル気管がまっすぐであることを確認して足を保持するためにラベル·テープを使用するには、互いに足。 70パーセントエタノールと綿棒で手術部位を浸す。
6. 切開部位に局所的にbupivicaine（0.25％溶液0.1〜0.2ml）を適用します。
7. ニップピンセットで喉の皮膚と外側にゆっくり引き出します。外科はさみ、小さな縦切開を行います。切開の大きさを最小限に抑えることができます。
8. 50μlのPBSまたはPBSに0.1％のOVAで1 mlの注射器を準備し、繰り返しピペット（Tridakステッパー、トリントン、コネチカット州）に挿入します。片手でピペットを取り、ピンセットで戻って組織を保持し、気管を露出するために他を使用しています。
9. できるだけ気管に平行に注射器を保持、気管壁を通して針を挿入して、ソリューションを注入します。
10. 肺に解決するソリューションのための時間を確保するために注射を次の垂直方向にマウスを維持します。
11. 穏やかに無菌的に創傷部を閉じ縫合とピンセットとシール。
12. 場所は、加熱パッド上でマウス胸骨ダウン、それは完全に歩行可能まで回復することができます。回復後、動物のケア施設には、マウスを戻し、傷が完全に治癒するまで血清腫、炎症や感染症、創傷裂開の兆候がないか毎日それを監視することができます。

噴霧によるチャレンジB.

1. 水酸化アルミニウムの2ミリグラム（Sigma-Aldrich社）を含む滅菌PBS 0.2 mlに、またはコントロールとして滅菌PBS 0.2ml中2mgの水酸化アルミニウムと乳化OVA20μgの（Sigma-Aldrich）を腹腔内注射により0日目にマウスを感作。
2. 上記のように14日目に、腹腔内注射によって感作性を向上させます。
3. ²¹日^、22日^、23日^、24日と25日^目に単独で超音波ネブライザー（Buxco研究システム、Wilmi経由で配信噴霧1％OVAまたはPBSに30分間曝露による最初の感作、チャレンジマウスの後にngton、NC）。
4. WBPのメインチャンバー内にマウスを置くと、少なくとも10分間プレチスモグラフィチャンバー内でそれらを慣らす。
5. 噴霧器のコップを経由して、下記の手順4-6に示すように滅菌PBSまたは単独で滅菌したPBSに0.1％OVAの代わり1ミリリットル。 30分間、霧状に。
6. ネブライザーのカップを取り外し、残りのすべてのソリューションを破棄します。
7. 噴霧は、噴霧チャンバを使用することによって、同時にすべてのマウスで実行することができます。

II。メサコリンに対する気道過敏性の決定

全身プレチスモグラフィーで気道過敏性のA.非侵襲計測（WBP、Buxco研究システム、ウィルミントン、ノースカロライナ州）

1. 粉末メタコリンボトルが開く前に室温まで昇温することができます（メタコリンは非常に吸湿性であり、水を吸収するために許可されている場合は無駄な塊を形成します。）滅菌したPBSで200 mg / mlのストック溶液を調製し、シリアル2倍希釈（例えば、100、50、25、12.5、6作る0.25 mg / ml）を。ソリューションは、冷やしておく。
2. 次のように機器を設定します。タイトフィットゴムチューブを用いたガスをトラップするネブライザー、エアーポンプへのバイアス流入口、およびWBPコンセントにWBPの主な入口を接続します。 WBPのメインと基準チャンバーの出口を埋めるために圧力変換器を取り付けます。付属のケーブルとプ​​リアンプに圧力トランスデューサーを接続し、特定のデータ·アクイジション·カードを使用してPCにプリアンプを接続します。
3. メーカーの推奨に従って、ソフトウェアを使用して、プリアンプのキャリブレーションを行います。
4. WBPの主室に配置したマウスは、少なくとも10分間プレチスモグラフィチャンバー内でそれらを慣らすし、3分間のベースライン測定値（Penhbase）を記録。
5. ネブライザーカップで滅菌したPBSの代わりに1ミリリットル。 2分間霧状にし、乾燥段階でさらに6分間の呼吸変数を監視することができます。ネブライザーのカップを取り外し、残りのPBSを捨ててください。
6. ネブライザーカップとrの6.25 mg / mlのメタコリンの代わりに1ミリリットル2分を加えた6分間の監視サイクルのEPEATの噴霧。
7. 同じ2分の噴霧時間と6分間監視サイクルを使用して、12.5、25、50および100 mg / mlのメタコリンで測定を繰り返します。
8. チャンバーからマウスを削除し、それらのケージに戻す。
9. 1ミリリットル滅菌PBSで補充ネブライザーカップとチューブをフラッシュするために別のシーケンスを実行します。
10. 、空気の流れをシャットダウンして分解し、動物の2番目のセットを実行する前に、すべてのチャンバを拭いてください。

コンピュータ制御された人工呼吸による気道反応性B.侵襲計測（flexiVent。SCIREQ社、モントリオール、カナダ）

1. マウスの重さと体重ペントバルビタールナトリウム60 mgの腹腔内（ip）注射により麻酔。
2. 気管切開のための腹·背マウス十分な麻酔、位置を次に示します。
3. 70％エタノールで首の皮膚を消毒する。 iに局所bupivicaine（0.25％溶液0.1〜0.2ml）を適用するncisionサイト​​。首の皮膚を切開して開きます。首の筋肉を分離し、気管を公開します。
4. 細かいハサミで気管に2mmの切開（気管を切断しないように特定のある）にと慎重に気管チューブを挿入して - 1を作成します。空気漏れを防ぐために、気管の周囲に縫合糸を結ぶ。
5. 体プレチスモグラフチャンバ内にマウスを置き、人工呼吸器に挿入し気管チューブを接続します。
6. 機械的人工換気を開始します。適切な呼吸率と潮汐/ストロークボリューム（150ストローク/分および200μlの、それぞれ20 gのマウス用）を設定します。胸部は人工呼吸器と同期して動いていることを確認してください。マウスが人工呼吸器（自己呼吸）と "戦い"されている場合は、より多くの麻酔薬を注入し、同期を待ちます。
7. ベースラインの測定に続いて、別の3分間のベースラインの換気下にマウスを維持し、インピーダンス測定値のセット²回目^になり^ます 。ベースライン測定値のセットは、この²回目^は、calcのために使用されますベースライン時の平均値をulate。
8. 超音波ネブライザーを介して人工呼吸器からのチャネリング吸気流量によってPBSまたはメタコリン（MCH）の課題（6.25、12.5、25、50および100 mg / ml）を提供します。
9. MCH（6.25、12.5、25、50および100 mg / ml）をそれぞれファウル、120回/分で10ミリリットル/ kgのVtを提供することにピストンを戻し、インピーダンス測定を行う。

III。空域への細胞浸潤の測定

A.は、気管支肺胞洗浄（BAL）を実行

1. AHRを測定した後、CO ₂でマウスを安楽死させる、手術パッドの上に、その裏面にそれぞれのマウスを置きます。
2. 70％エタノールで領域を浸す。
3. 下腹部から始まる、腹腔を開いてカットしてリブに向かって上向きに移動し、肌/筋肉の上部を取り外します。
4. リブが表示されていたら、慎重に穴を開けるには絞りをはさみを使用しています。肺は横隔膜から離れて崩壊する必要があります。特にカリフォルニア州であるrefulないニックネーム肺や心臓へ。
5. 完全に肺/心臓を露出させ胸郭を切り取る（サイトの充填から血を保つためにすべての主要な血管を切断しないでください）​​。
6. 27ゲージの注射針（BDシリンジ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）、穿刺心臓の心室、ゆっくりと慎重に血液を収集するために注射器を引き戻すと1mlシリンジを使用します。心の崩壊を避けるために注意してください。
7. 標準プロトコルを使用して、この血液から血清を収集します。 -70℃で保存、使用するまで。
8. 気管が明らかにされるまで、喉から皮膚や組織を切り取る。フィールド内で簡単に作業するのに十分な組織を一掃する（再度、すべての主要な血管を切断しないでください）​​。
9. パスをクリアするために気管の下にカット湾曲したハサミを使用して、。
10. 気管の下に湾曲した鉗子のポイントを通過して、縫合糸の部分の端をつかみます。気管の下に縫合糸を描画します。
11. 喉の低い、気管約緩いハーフ結び目を作る。
12. Carefully縫合糸の上に、カニューレのサイズに十分な、ノッチを切った。
13. 慎重に縫合糸のポイントを過ぎて穴に、気管カニューレを挿入してダウン。カニューレだけ（;：BAL回復しようと折りたたみ気管短すぎる穿刺肺すぎ）、肺の入り口に出てくるまで、ゆっくりと前方に押します。
14. カニューレの周囲に気管を密封するために縫合糸と完全な結び目を締めます。
15. カニューレのロックシリンジ（1mlのPBSを含む）を、ゆっくりと肺に流体を押してください。肺葉は、個別に徐々に膨らませる必要があります。オーバーフィルしないでください。完全に成長したマウス0.9〜1.0ミリリットルの絶対最大値です。 0.8ミリリットルより安全かもしれません。カニューレに大まかに注射器をロックし、それ以外の場合は解除しようとしたときに損傷を引き起こす可能性があります。
16. 肺から液体を引き出す。抵抗が発生した場合（カニューレに吸い込まれる組織）を押しカニューレが徐々に肺にさらにとすると、削除を再開します。また、場所にカニューレを回転させてみてください。もしすべてのELSeが失敗した場合、カニューレの途中を撤回し、気管は、はるかにこのケースでは崩壊する可能性があります。
17. カニューレ、コンテナ内の預金BAL液から、注射器を切り離し、新鮮なPBS溶液で2回を繰り返します。
18. スピンダウンまで氷上でBALソリューションを保持します。
19. BAL液と市販のマウスIgE ELISAキット（MDのバイオ製品、セントポール、MN）を用いてOVA特異的IgEを測定するために血清を使用しています。

B.細胞をカウントし、格差を決定する

1. 〜600×gでBAL液で5分間、4℃で遠心し
2. PBSで穏やかに細胞ペレットを再懸濁し、氷上に保持します。
3. 希釈細胞懸濁液で標準ノイバウアーの血球をロードし、細胞をカウントします。
4. cytospins 10〜40μlの体積で2×10 ⁴細胞のアリコートを削除します。必要に応じて細胞を希釈します。
5. cytospins、ミックス2×10 ⁴細胞、130μlのPBSと10μlのFBSのために。 DOUB全体を細胞混合物を追加します。ル·サイトスピンは、重複する試料について二重cytoslidesを使用して、700 rpmで10分間遠心分離漏斗と。
6. スライドを染色する前に1時間室温で乾燥させます。
7. （シーメンス、ニューアーク、デラウェア州）をDiff-Quick染色を使用してスライドを染色。

IV。代表的な結果

挑発的な刺激に続く過度の気道狭窄は、臨床喘息の顕著な特徴です。 flexiVentシステム（ 図3）を使用して、全身プレチスモグラフィ（ 図2）と強制振動：我々は、OVA感作とチャレンジマウスでメタコリン、このような気道過敏性を測定するための2つの方法について説明します。どちらの方法でも、OVA感作と課題は、マウスの気道過敏性をもたらすことを示しています。

好酸球豊富な気道炎症は、マウスの臨床喘息とアレルギー性​​気道疾患の両方の別の顕著な特徴です。 図4に示すように、

証拠は、感作抗原に対するIgE抗体の過剰産生からのアレルギー性​​気道疾患の結果を示します。我々は記述プロトコルを使用して、OVAで感作と課題は、（ 図5）投与したマウスの血清およびBAL液の両方でIgE値が増加します。

図1。 OVA誘発性アレルギー性喘息のための実験的なスキーマです。マウスではでは、続いて滅菌したPBS単独で0.2 mlの滅菌PBS 0.2 mlの水酸化アルミニウム2mgの、または水酸化アルミニウム2mgの中で乳化OVA20μgので2回IP感作したそれによって指定された時点では0.1％OVAまたは滅菌したPBS溶液を用いて、または日常の元で挑戦 PBSまたはPBSに噴霧1％OVA〜30分間posureは、単独で超音波ネブライザー（Buxco）を介して配信されます。最後のOVA暴露24時間後には、気道過敏性を決定した。その後、BAL液、血液サンプル、肺細胞、および組織をさらなる分析のため収集した。

図2。非侵襲的方法によるアレルゲン誘発性気道過敏性の評価。マウス（n = 4/group）は、感作し、OVAでチャレンジした。最後のファウル二十四時間では、メサコリンに対する気道過敏性は、プロトコルで説明したように全身プレチスモグラフィを用いて決定した。プノンペンを決定し、プノンペン比（PBSで8分間隔で平均プノンペンで割ったメタコリンの8分の時間間隔の平均値プノンペン）として表した。 * P <0.05対PBS。

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図3。侵襲的な方法（強制振動）によるアレルゲン誘発性気道過敏性の評価。マウス（n = 4/group）は、感作し、OVAでチャレンジした。プロトコルで説明したように最後の挑戦に続く24時間後、吸入メサコリン濃度の増加に気道過敏性は、強制振動（flexiVent）メソッドによって決定された。 A、B）の気道抵抗、C）の肺エラスタンス。 * P <0.05対PBS。

図4。 BAL液の細胞数。マウス（n = 4/group）を感作したとOVAでチャレンジ。最後のファウル二十四時間、（ 上 ） BAL細胞を回収し、プロトコルに記載された全細胞を計数した。 （ 下 ）サイトスピンスライドはpであったreparedとをDiff-Quickで染色した。 TOT =総細胞;イオス=好酸球、ノイ=好中球、マック=マクロファージ、リンパ球=リンパ球。 * P <0.05対PBS。

図5。 OVA特異的IgE。マウス（n = 4/group）は、感作し、OVAでチャレンジした。最後のファウル二十四時間では、IgEがBAL液中に、プロトコルで説明したように心臓穿刺により採取した血液から血清中で測定した。 * P <0.05対PBS。

アレルギー性​​気道疾患の動物モデルは、臨床的喘息に関連する研究のための重要なツールを提供しています。様々な種や抗原を用いて様々なモデルの数は、開発されている。マウス、魅力的で、頻繁に使用される実験動物はまた、アレルギー性気道疾患のモデルに対して多くの利点を提供しています^{。9,10この}ようなモデルが再現することが特に困難である慢性疾患の側面とあらゆる点で喘息^、11を模倣^していませんが、 ^12,13私たちは主要な機能の多くが再現されていることをここで確認してください。我々はまた、ヒトの喘息のように、これらの機能は血清およびBAL液の両方の抗原特異的IgEの増加に関連付けられている、ことを示している。我々は、抗原として​​OVAを採用したが、別のチャレンジ技術を利用して、両方の、二つのマウスモデルを提示します。気管内投与はやや複雑で時間がかかりますが、直接抗原の既知量を提供するという利点があります肺。それは、このメソッドは、DOの選択肢よりも肺に深く抗原を提供することも可能である。我々は、気管内送達のための侵襲的な方法について説明しますが、抗原はまた、口腔を介して挿入したチューブや気管カニューレを介して配信することができます。このメソッドはJoveの他の場所で説明されています¹⁴噴霧が簡素化され、より直接的にヒトへの暴露の通常の経路を模倣しています。定量しかし、多くの変数であり、肺への送達が少なく効率的であるかもしれません。実際に^15日 、それは線量のかなりが未知の端数は、上部気道に沈着している可能性があります。ここで説明されていない3番目の選択肢は、鼻腔内送達である。再び、これは投与量のかなりの割合が上気道に沈着される可能性がある。

私たちのデモはC57BL / 6マウスを使用して実行されていますが、証拠は、他の特定の株は、特定のエンドポイント上で、より堅牢な結果を与えることを示唆している。 BとC57BL / 6との比較でALB / C ¹⁶またはBALB / cおよびFVB / NJ ¹⁷マウスの両方を、C57BL / 6マウスはAHRの中で最小の増加を示した。一方、C57BL / 6マウスではなく、他の内の1つの研究¹⁶の好酸球増加に大きな増加を示した¹⁷サイトカインの上昇がひずみとサイトカイン特有の両方であった。好ましい菌株は、したがって、最も重要なものとみなさエンドポイントに依存する場合があります。

気道炎症のAHRと範囲：アレルギー性​​気道疾患の2つの主な機能は一般的に、実験操作の効果を決定するために、評価のために選ばれています。 AHRは、全身プレチスモグラフィ（WBP）または強制振動のいずれかによって測定することができる。両方のケースでは、メサコリンは、挑発的な挑戦として使用されます。 WBPは、自由に侵襲手術と麻酔なしで最小限に抑制したマウスを移動させたり、意識的に気道反応性の解析を可能にするin vivoでの測定で機能します。気道過敏性は、使用して表現さ​​れ変更された気道機能のパラメータとして "強化された一時停止"（プノンペン）。プノンペンはインスピレーションと有効期限の両方からボックスの流量波形の変化を反映し、初期および後期呼気ボックスの流れの比較でそれを組み合わせた実証的なパラメータです。 WBPは、それが技術的には以下の要求であり、エアロゾルの覚せい剤に対する気道反応性の測定を可能にするため、肺抵抗を測定するための侵襲的な手段に比べていくつかの潜在的な利点があります。このメソッドは、長時間（> 24時間）、上の繰り返し測定（異なる時点で同じ動物の検査）と測定に理想的、両方の心理的ストレスの影響や動物の準備時間を最小限に抑えることがエアロゾルの様々なことができ、その間制御された反復可能な方法で投与される。結果は、侵襲的な方法のものと強く相関し、それが迅速かつ容易になります。

二つの代替非侵襲的な方法では、と言われている測定値を提供より直接的に気道狭窄に関連することができます。ダブルチャンバープレチスモグラフィーでマウスが胸チャンバーの前面の穴に通し、その首を突っ込むことを余儀なくされている^18。鼻室は、次に胸室の前面に装着されており、ヘッド穴がシールラテックスフィルムにカットされチャンバーの間に。この穴は、呼吸気流を制限することなく、チャンバ間の気密シールを提供するために正確に大きさである。容積脈波の測定は、両方のチャンバーで撮影されており、鼻と胸のフロー間の遅延は、特定の気道抵抗（吸入後）を計算するために使用されます。ヘッドアウトプレチスモグラフィは、空気が鼻のチャンバー内で自由に流れず、脈波測定がそこに行われていないことを除いて同様である^19を主要な計算されたパラメータがmidexpiratory相（EF _50）での流量です。 WBPのように両方の技術は、bの評価を可能にして、数時間にわたって繰り返し測定に適しています朝早くから夜遅くまで応答をOTH。ただし、両方の動物は動物が数日間にわたって装置に慣れていない限り、不安定な結果を生成することができる、拘束する必要があります。また、どちらの場合も不可欠である効果的な気密シールを確保するために困難な場合があります。さらに、プノンペンsRawおよび両方以来、侵襲的な測定値と強く相関することが示されており、プノンペンsRawおよび、それが得られる追加情報が増加した実験的な難しさを正当化するかどうかを疑問視することができモルモット^、20に直接相関することが示されています。

強制振動法では、深く麻酔したマウスは、気管切開され、人工呼吸器をチューブに接続されています。人工呼吸器などの圧力流量測定は膨張し、肺の抵抗と動的コンプライアンスの直接測定を可能にして肺を縮小します。これは、WBPでは使用できません気道力学に関する情報を提供します。のためにCED発振しかし、技術的に困難であり、通常は端末の手順です。実験的なエンドポイントとして、2つの手順は一般的には同様の結果を与える^19。

一般的にマウスアレルギー性​​気道疾患の実験操作の効果を評価するために使用される臨床喘息の他の顕著な特徴は、好酸球性炎症である。炎症の他の側面も同様に測定してもよいが、これは最も一般的に気道、肺、または両方に炎症細胞（特に好酸球）浸潤の程度の決定を含む。気道内のセルの数とタイプはBAL液中に決定されます：まず、総細胞数を血球計でカウントによって決定され、その後、細胞の種類は、サイトスピン後に差染色によって決定されます。それが人間であるとして、BAL液中のコレクションが原理的には、生きているマウスで行うことができますが、それはより一般的に且つ簡便に行う安楽死、次のとおりです。好酸球肺への浸潤は、標準的な病理組織学的技法に続いて肺切除によって評価されています。

一部のインスタンスではそれはまた、抗原感作と課題は、ゴブレット（粘液産生）細胞増殖を刺激する程度を評価するために役に立つかもしれません。これは簡単に過ヨウ素酸 - シッフ、粘液のために特定のある肺の切片を染色することによって達成される。抗原特異的IgEは、容易に入手可能なキットを使用して、BAL液および血清中で測定することができる。 IgEの測定は、末端器官の反応とは異なる感作の程度は、重要なパラメータである設定で重要であるかもしれません。我々はここで説明されていないことを動物モデルにおけるアレルギー性​​気道疾患の研究に貴重な補助剤であるサイトカインとT細胞応答を含む他の測定、多種多様があります。それは、抗原感作と課題は、スタッドの貴重なこのようなモデルをレンダリングすることを引き出すことができ、関連する応答の多種多様です。この病気のy。