Modelo murino de asma inducida por alergenos

I. La sensibilización alérgica y el desafío (ver Figura 1)

A. Para Challenge intratraqueal

1. Por sensibilización inicial, inyectar macho o hembra C57BL / 6 o ratones BALB / c (6-8 semanas de edad) por vía intraperitoneal el día 0 y de nuevo el día 7 con 20 mg de ovoalbúmina (OVA; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) emulsionado en 0,2 ml de fosfato de solución salina estéril tamponada (PBS) que contenía 2 mg de hidróxido de aluminio (Sigma-Aldrich) o con 2 mg de hidróxido de aluminio en 0,2 ml de PBS estéril como control.
2. Desafío con el antígeno como apropiado (por ejemplo, en los días 14, 16, 18 y 20). Desafío procedimiento siguiente.
3. Anestesie ratón con una inyección intraperitoneal (ip) de inyección de una mezcla de ketamina (90 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). Asegúrese de que el ratón está totalmente anestesiado durante al menos 10 minutos.
4. La superficie de operación de ángulo a 45 grados o más. Coloque el cursor sobre esta superficie de mantenimiento de la parte ventral hacia arriba y la cabeza en la parte superior.
5. Hook tHRead en los incisivos delanteros para mantener la cabeza hacia atrás. Nivel de las patas entre sí para garantizar la tráquea es recta y use cinta de etiquetas para mantener las piernas. Remoje sitio quirúrgico con EtOH 70% y el hisopo.
6. Aplicar bupivicaína (0,1 a 0,2 ml de solución al 0,25%) por vía tópica en el sitio de la incisión.
7. Nip piel de la garganta con unas pinzas y tirar suavemente hacia afuera. Hacer una pequeña incisión vertical con unas tijeras quirúrgicas. Reducir al mínimo el tamaño de la incisión.
8. Preparar una jeringa de 1 ml con 50 l de PBS o el 0,1% OVA en PBS y se inserta en una pipeta repetitiva (Tridak paso a paso, Torrington, CT). Tomar la pipeta en una mano y usar la otra para mantener el tejido de vuelta con las pinzas y exponer la tráquea.
9. Sosteniendo la jeringa como paralela a la tráquea como sea posible, insertar la aguja a través de la tráquea pared e inyectar la solución.
10. Mantener el ratón en una inyección de la orientación vertical de las siguientes para dar tiempo a la solución para resolver en los pulmones.
11. La herida suavemente y cerca estéril área conpinzas y sello con sutura.
12. Coloque el ratón el esternón hacia abajo en un cojín de calefacción y permitir su recuperación hasta que esté completamente ambulatoria. Después de la recuperación, devolver el ratón para la instalación de cuidado de los animales y monitorear diariamente para detectar signos de seroma, inflamación o infección, y la dehiscencia de la herida hasta que la herida haya cicatrizado completamente.

B. Para Challenge por nebulización

1. Sensibilizar ratones en el día 0 por inyección intraperitoneal de 20 mg de OVA (Sigma-Aldrich) emulsionado en 0,2 ml de PBS estéril que contiene 2 mg de hidróxido de aluminio (Sigma-Aldrich) o con 2 mg de hidróxido de aluminio en 0,2 ml de PBS estéril como control .
2. En el día 14, aumentar la sensibilización por inyección ip como se describió anteriormente.
3. El día ^21, 22 ^ª, 23 ^ª, 24 ^ª y 25 ^ª después de la sensibilización inicial, los ratones desafío por la exposición durante 30 minutos a la OVA nebulizada al 1% o PBS solo entrega a través de un nebulizador ultrasónico (Buxco de Investigación de Sistemas, Wilmington, Carolina del Norte).
4. Los ratones lugar en la cámara principal de WBP; aclimatarlos dentro de la cámara pletismografía por lo menos durante 10 minutos.
5. Colocar 1 ml de 0,1% OVA en PBS estéril o PBS estéril solo, como se describe en los pasos 4-6 abajo, a través de un nebulizador. Nebulizar durante 30 min.
6. Retire del nebulizador y descartar cualquier solución restante.
7. Nebulización puede realizarse en todos los ratones simultáneamente mediante el uso de una cámara de nebulización.

II. Determinación de la hiperreactividad bronquial a la metacolina

A. no invasiva de medición de la hiperreactividad de la vía aérea mediante pletismografía corporal (WBP; Buxco de Investigación de Sistemas, de Wilmington, Carolina del Norte)

1. Dejar que la botella metacolina en polvo a calentar a temperatura ambiente antes de la apertura (metacolina es muy higroscópico y formar montones inútiles si se permite que absorben agua). Preparar una 200 mg / ml de solución madre en PBS estéril, a continuación, hacer serie 2-diluciones (por ejemplo, 100, 50, 25, 12,5 y 60,25 mg / ml). Mantenga las soluciones de frío.
2. Instale el equipo de la siguiente manera: conectar la entrada principal de WBP de nebulizador, el sesgo de flujo de entrada a la bomba de aire, y la salida a la trampa de gas WBP utilizando ajustada tubo de goma. Coloque el transductor de presión para reducir las salidas de las principales cámaras y referencia de la WBP. Conecte el transductor de presión para el preamplificador con los cables suministrados, y conectar a la PC usando preamplificador específico de adquisición de datos de la tarjeta.
3. Calibrar el preamplificador utilizando el software de acuerdo a las recomendaciones del fabricante.
4. Los ratones lugar en la cámara principal de WBP; aclimatarlos dentro de la cámara pletismografía por lo menos durante 10 minutos, a continuación, registrar lecturas de referencia (Penhbase) durante 3 min.
5. Colocar 1 ml de PBS estéril en el vaso del nebulizador. Nebulizar durante 2 minutos y luego monitorear las variables respiratorias durante 6 minutos durante la fase de secado. Retire del nebulizador y descartar cualquier resto de PBS.
6. Colocar 1 ml de 6,25 mg / ml de metacolina en la taza del nebulizador y rEPEAT nebulización durante 2 minutos más un ciclo de seguimiento de 6 min.
7. Repita la medición con 12,5, 25, 50 y 100 mg / ml de metacolina, con el mismo período de 2 minutos de la nebulización y la 6-min ciclo de supervisión.
8. Retire los ratones de las cámaras y devolverlos a sus jaulas.
9. Vuelva a llenar la taza del nebulizador con 1 ml de PBS estéril y ejecutar otra secuencia para limpiar la tubería.
10. Apague los flujos de aire, desmontar, y limpie todas las cámaras antes de ejecutar un segundo grupo de animales.

B. invasiva de medición de la capacidad de respuesta por la vía aérea controlada por ordenador Ventilador (flexiVent; SCIREQ Inc., Montreal, Canadá)

1. Pesar el ratón y anestesiar por vía intraperitoneal (ip) la inyección de 60 mg por kg de peso corporal de sodio pentobarbital.
2. Después de la anestesia adecuada posición, los ratones ventro-dorsal de la traqueostomía.
3. Desinfecte la piel del cuello con un 70% de etanol. Aplicar bupivicaína (0,1 a 0,2 ml de solución al 0,25%) por vía tópica en el incision sitio. Una incisión y abrir la piel del cuello. Separe los músculos del cuello y exponer la tráquea.
4. Haga un 1 - a 2 mm de incisión en la tráquea con tijeras finas (estar seguro de no cortar la tráquea) e introduzca el tubo traqueal con cautela. Atar una sutura alrededor de la tráquea para evitar una fuga de aire.
5. Coloque el ratón en la cámara de pletismógrafo corporal y conectar el tubo que se inserta la tráquea al respirador.
6. Iniciar la ventilación mecánica. Establezca la frecuencia respiratoria adecuada y el volumen corriente / carrera (150 golpes por minuto y 200 l, respectivamente, para un ratón de 20 g). Asegúrese de que el tórax se mueve en sincronía con el ventilador. Si el ratón está "luchando" con el respirador (auto-respiración), inyectar más anestesia y esperar a la sincronización.
7. Después de las mediciones de referencia, mantener los ratones en la ventilación de referencia para otros 3 minutos, y luego tomar un 2 ^º conjunto de las mediciones de impedancia. Este 2 ^º conjunto de mediciones de referencia se utiliza para calcmular los valores basales medias.
8. Entregar PBS o metacolina (MM) retos (6,25, 12,5, 25, 50 y 100 mg / ml) por canalizar el flujo inspiratorio del respirador a través de un nebulizador ultrasónico.
9. Después de cada reto con MM (6,25, 12,5, 25, 50 y 100 mg / ml), se devolverá el pistón a la entrega de un Vt de 10 ml / kg a 120 respiraciones por minuto y tomar las mediciones de impedancia.

III. La medición de la infiltración celular en el espacio aéreo

A. Realice el lavado broncoalveolar (LBA)

1. Después de la medición de la AHR, la eutanasia a los ratones con el CO _2, y la posición de cada ratón en su parte posterior en la plataforma quirúrgica.
2. Remoje el área con 70% de EtOH.
3. Comenzando en la parte inferior del abdomen, corte la cavidad abdominal y remover la piel / superior de los músculos, moviéndose hacia arriba, hacia las costillas.
4. Una vez que las costillas son visibles, con unas tijeras cuidadosamente perforar el diafragma. Los pulmones deben colapsar lejos del diafragma. Tenga especial careful de no dañar los pulmones o el corazón.
5. Corte la caja torácica para exponer completamente los pulmones o del corazón (evitar cortar cualquier principales vasos sanguíneos para que la sangre se llene el lugar).
6. Con una jeringa de 1 ml con una aguja de calibre 27 (BD jeringas, Franklin Lakes, NJ), la punción de los ventrículos del corazón y poco a poco y con cuidado tire hacia atrás de la jeringa para recoger la sangre. Tenga cuidado para evitar el colapso del corazón.
7. Recoger el suero de la sangre utilizando este protocolo estándar. Almacenar a -70 ° C hasta su uso.
8. Corte y retire la piel y el tejido de la garganta hasta la tráquea se revela. Borrar el tejido suficiente para trabajar con facilidad en el campo (de nuevo, evitar cortar cualquier principales vasos sanguíneos).
9. Con unas tijeras curvas, cortados en la tráquea para despejar el camino.
10. Pase el punto de un fórceps curvados bajo la tráquea y sujete el extremo de un trozo de hilo de sutura. Tire del hilo de sutura en la tráquea.
11. Haga un medio nudo suelto sobre la tráquea, la baja en la garganta.
12. CAREFUlly cortar una muesca, un tamaño suficiente para que la cánula, por encima del hilo de sutura.
13. Cuidadosamente insertar la cánula en el agujero y abajo de la tráquea más allá del punto del hilo de sutura. Presione suavemente hacia adelante hasta que la cánula sale justo a la entrada a los pulmones (demasiado lejos: pulmones punzantes, demasiado cortos: la tráquea colapso cuando se trata de recuperar BAL).
14. Apretar hilo de sutura y el nudo completo para sellar alrededor de la tráquea cánula.
15. Bloqueo de la jeringa (que contiene 1 ml de PBS) en la cánula, y presione suavemente el líquido en el pulmón. Lóbulos pulmonares de forma individual debe inflar lentamente. No llene excesivamente. Para un total de ratón cultivadas 0,9-1,0 ml es el máximo absoluto. 0,8 ml puede ser más seguro. Bloqueo de la jeringa a la cánula sin apretar, de lo contrario es probable que cause daños al tratar de desactivar.
16. Retirar el líquido de los pulmones. Si se encuentra resistencia (tejido aspirado dentro de la cánula), presione lentamente la cánula más allá en el pulmón y volver a remover. También pruebe a girar la cánula en su lugar. Si todos los ELSe no, retirar la cánula parte del camino, la tráquea es mucho más probable que se hunda en este caso.
17. Retire la jeringa de la cánula, el líquido depositado en el contenedor BAL, y repetir 2 veces con solución de PBS fresca.
18. Mantenga la solución BAL en hielo hasta centrifugarse.
19. Usar el líquido de BAL y el suero para medir la OVA de IgE específica mediante disponible en el mercado del ratón IgE kits de ELISA (Bioproductos MD, St. Paul, MN).

B. Contar las células y determinar Diferenciales

1. Centrifugar el líquido de BAL 5 minutos a ~ 600 × g, 4 ° C.
2. Resuspender el sedimento celular suavemente en PBS y mantener en hielo.
3. Cargar un estándar hemacitómetro Neubauer con la suspensión celular diluida y contar las células.
4. Retire las alícuotas de 2 × 10 ⁴ células en 10 a 40 l de volumen de cytospins. Diluir las células, si es necesario.
5. Para cytospins, mezcle 2 × 10 ⁴ células, 130 l de PBS y el FBS al 10 l. Agregue la mezcla de célula entera de doubLe citospina embudo y centrifugar 10 min a 700 rpm, utilizando cytoslides dobles para las muestras duplicadas.
6. Permitir que los portaobjetos se seque a temperatura ambiente durante 1 h antes de la tinción.
7. Mancha de las diapositivas mediante el uso de Diff-Quick mancha (Siemens, Newark, DE).

IV. Los resultados representativos

Constricción de las vías respiratorias después de estímulos provocadores excesiva es una característica prominente de asma clínica. Se describen dos métodos para la medición de la hiperreactividad bronquial a la metacolina como en ratones OVA-sensibilizado y desafiado: Pletismografía del cuerpo entero (Figura 2) y oscilación forzada utilizando el sistema de flexiVent (Figura 3). Ambos métodos demuestran que la OVA de sensibilización y desafío produce hiperreactividad bronquial en los ratones.

Rica en eosinófilos inflamación de las vías es otra característica destacada de tanto clínico del asma y la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas en ratones. Como se muestra en la Figura 4

La evidencia indica que los resultados de las vías respiratorias alérgicas enfermedades de la sobreproducción de anticuerpos IgE frente a antígenos de sensibilización. La sensibilización y el desafío con OVA utilizando los protocolos que describen aumenta los niveles de IgE en suero y líquido de BAL de ratones tratados (Figura 5).

Figura 1. Esquema experimentales para OVA inducida por el asma alérgica. Ratones se sensibilizaron dos veces ip con 20 mg de OVA emulsionado en 2 mg de hidróxido de aluminio en 0,2 ml de PBS estéril, o 2 mg de hidróxido de aluminio en 0,2 ml de estéril solo PBS, seguido en el los puntos indicados por el tiempo que desafían con un 0,1% OVA o solución estéril de PBS o por el ex diario POSICION durante 30 minutos a la OVA nebulizado 1% en PBS o PBS solo entrega a través de un nebulizador ultrasónico (Buxco). Veinticuatro horas después de la exposición OVA final, se determinó la capacidad de respuesta las vías respiratorias. Posteriormente, el líquido de BAL, muestras de sangre, células de pulmón, y los tejidos se recogieron para su posterior análisis.

Figura 2. Los ratones de evaluación de la inducida por alergenos hiperreactividad bronquial por un método no invasivo. (N = 4/group) fueron sensibilizados y desafiados con OVA. Veinticuatro horas después del último desafío, la hiperreactividad bronquial a la metacolina inhalada se determinó a través de todo el cuerpo pletismografía como se describe en el protocolo. Penh se determinó y expresó como Penh relación (promedio Penh durante el intervalo de tiempo 8-min con metacolina dividido por el promedio Penh durante el intervalo de 8-min con PBS). *, P <0,05 vs PBS.

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Figura 3. Los ratones de evaluación de la inducida por alergenos hiperreactividad bronquial por un método no invasivo (oscilación forzada). (N = 4/group) fueron sensibilizados y desafiados con OVA. Veinticuatro horas después del desafío último, hiperreactividad bronquial a concentraciones crecientes de metacolina inhalada se determinó por la oscilación forzada (flexiVent) método descrito en el protocolo. A, B) la vía aérea de resistencia; C) elastancia del pulmón. *, P <0,05 vs PBS.

Figura 4. Recuento de células BAL fluido. Los ratones (n = 4/group) fueron sensibilizados y desafiados con OVA. Veinticuatro horas después del último reto, (Arriba) BAL células se recogieron y se contaron las células totales, como se describe en el protocolo. (Abajo) Cytospin diapositivas fueron pREPARADO y se tiñeron con Diff-Quick. Total = total de células; Eos = eosinófilos; Neu = neutrófilos, macrófagos, Mac = LYM = linfocitos. *, P <0,05 vs PBS.

Figura 5. OVA-IgE específica. Los ratones (n = 4/group) fueron sensibilizados y desafiados con OVA. Veinticuatro horas después del desafío último, la IgE se midió en el líquido de BAL y en el suero de la sangre recogida por punción cardiaca como se describe en el protocolo. *, P <0,05 vs PBS.

Los modelos animales de enfermedad de las vías respiratorias alérgicas constituyen instrumentos importantes para los estudios pertinentes para el asma clínica. Una serie de modelos diferentes, que emplean diferentes especies y antígenos, se han desarrollado. El ratón, una especie de laboratorio atractivas y de uso frecuente, también ofrece una serie de ventajas para los modelos de la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas. ^9,10 Aunque estos modelos no asemejar al asma en todos los aspectos, ¹¹ con aspectos de la enfermedad crónica son particularmente difíciles de reproducir, ^12,13 confirmamos aquí que muchas de las características principales se reproducen. También se muestra que, como en el asma humana, estas características se asocian con el aumento de IgE específica de antígeno en el líquido de suero y BAL. Se presentan dos modelos murinos, tanto OVA empleando como antígeno, pero la utilización de diferentes técnicas de desafío. La administración intratraqueal es algo compleja y requiere mucho tiempo, pero ofrece la ventaja de proporcionar una cantidad conocida de antígeno directamente alpulmón. También es posible que este método proporciona el antígeno más profundamente en el pulmón que alternativas tienen. Se describe un método invasivo para la entrega intratraqueal, pero antígeno también se puede enviar por vía intratraqueal a través de un tubo o cánula insertada a través de la cavidad oral. Este método se describe en otra parte de Jove. ¹⁴ de nebulización es más simple y más directa imita la ruta habitual de la exposición humana. La cuantificación es más variable, sin embargo, y la entrega al pulmón puede ser menos eficiente. ¹⁵ En efecto, es probable que una fracción considerable pero desconocida de la dosis se deposita en las vías respiratorias superiores. Una tercera alternativa, no se describe aquí, es la administración intranasal. De nuevo, es probable que una fracción considerable de la dosis se deposita en las vías respiratorias superiores.

A pesar de nuestra demostración se realiza utilizando ratones C57BL / 6, la evidencia sugiere que las cepas de algunas otras pueden dar resultados más sólidos en los puntos finales específicos. En las comparaciones de C57BL / 6 con BALB / c ^16, o con ambos BALB / cy FVB / NJ ratones ^17, los ratones C57BL / 6 mostró el menor incremento en AHR. Por otro lado, los ratones C57BL / 6 mostraron mayores aumentos en la eosinofilia en un estudio de ¹⁶ pero no en el otro. ¹⁷ elevaciones citocinas fueron tanto la cepa y citoquinas-específico. La cepa preferida por lo tanto puede depender del punto final se considere más importante.

Dos características principales de la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas son comúnmente elegido para la evaluación con el fin de determinar los efectos de las manipulaciones experimentales: RHA y el grado de inflamación de las vías. AHR se puede medir, ya sea por pletismografía de cuerpo entero (WBP) o por oscilación forzada. En ambos casos, metacolina se utiliza como la prueba de provocación. WBP es un funcional en la medición in vivo que permite el análisis de la reactividad de las vías respiratorias en la conciencia, con libertad de movimientos o de los ratones restringidos mínimamente invasivo, sin cirugía y la anestesia. Vías respiratorias de respuesta se expresa mediante el"Pausa mejorado" (Penh) como un parámetro de la función pulmonar alterada. Penh es un parámetro empírico que refleja los cambios en la forma de onda de flujo de caja tanto en la inspiración y la espiración y la combina con la comparación del flujo de caja de principios y finales de la espiración. WBP tiene varias ventajas potenciales en comparación con medios invasivos para medir la resistencia pulmonar, ya que es técnicamente menos exigentes y permite realizar mediciones de la capacidad de respuesta a los estimulantes de las vías respiratorias en forma de aerosol. Este método minimiza tanto los efectos del estrés psicológico y el tiempo de preparación de los animales, lo que es ideal para mediciones repetidas (examen del mismo animal en diferentes puntos temporales) y la medición durante largos períodos de tiempo (> 24 h), durante los cuales una gran variedad de aerosoles puede se administra en una forma controlada y repetible. Los resultados se correlacionan fuertemente con los de los métodos invasivos, pero es más rápido y más fácil.

Dos métodos no invasivos proporcionar medidas alternativas que se dicea ser más directamente relacionada con la broncoconstricción. En doble cámara pletismografía el ratón se ve obligado a sacar la cabeza a través de un agujero en la parte delantera de la cámara toracoabdominal. ¹⁸ Una cámara nasal se ajusta entonces a la parte delantera de la cámara toracoabdominal y una cabeza-agujero se corta en el sellado película de látex entre las cámaras. Este agujero es precisamente dimensionado para proporcionar un sello hermético entre las cámaras sin restringir el flujo de aire respiratorio. Mediciones pletismográficos entonces se toman en ambas cámaras y el retardo entre los flujos nasales y toracoabdominal se utilizan para calcular la resistencia de las vías específica (sRaw). Cabeza de salida pletismografía es similar, excepto que el aire fluya libremente en la cámara nasal y no se hacen mediciones pletismográficas allí. ¹⁹ El parámetro principal es calcular el caudal en la fase mesoespiratorio (EF _50). Ambas técnicas, como la WBP, son ideales para mediciones repetidas a lo largo de varias horas, lo que permite la evaluación de la banto las respuestas tempranas y tardías. Sin embargo, ambos requieren los animales a ser restringida, que puede producir resultados erráticos menos que los animales están acostumbrados al aparato en el transcurso de varios días. También puede ser difícil asegurar una eficaz el sello hermético, que es esencial en ambos casos. Por otra parte, ya que ambos Penh y sRaw han demostrado una correlación significativa con medidas invasivas, y Penh y sRaw han demostrado que se correlaciona directamente en los conejillos de Indias, ²⁰ que puede ser cuestionado si la información adicional obtenida justifica el aumento de dificultad experimental.

En el método de oscilación forzada, los ratones profundamente anestesiados se traqueotomizados y un ventilador mecánico está conectado al tubo. Mediciones de flujo de presión como el ventilador infla y desinfla los pulmones luego permitir que la medición directa de la resistencia pulmonar y adaptabilidad dinámica. Esto proporciona información acerca de la mecánica las vías respiratorias que no está disponible con WBP. Paraoscilación CED es técnicamente más difícil, sin embargo, y es típicamente un procedimiento de terminal. Como criterios de valoración experimentales, los dos procedimientos por lo general dan resultados similares. ¹⁹

La otra característica importante del asma clínica comúnmente utilizado para evaluar el efecto de las manipulaciones experimentales en la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas murino es la inflamación eosinofílica. Aunque otros aspectos de la inflamación puede ser medido, así, este más comúnmente implica la determinación de la extensión de células inflamatorias (especialmente eosinófilos) la infiltración en las vías respiratorias, pulmón, o ambos. El número y tipo de células en las vías respiratorias se determinó en BAL fluido: Primer número total de células se determinó por recuento en un hemocitómetro, y luego el tipo de células se determinó por tinción diferencial citospina siguiente. Aunque de recogida de fluido BAL puede, en principio, ser realizado en ratones vivos, como lo es en los seres humanos, es más usual y convenientemente a cabo siguiendo la eutanasia. Eosinófilosinfiltración en los pulmones se evalúa mediante la escisión de pulmón seguido por técnicas estándar histopatológicos.

En algunos casos, también puede ser útil para evaluar el grado en que la sensibilización y antígeno desafío estimula copa (productora de moco) la proliferación celular. Esto se logra fácilmente mediante la tinción de las secciones de pulmón con ácido periódico de Schiff, que es específico para el moco. Antígeno-IgE específica también puede medirse en el LBA y suero utilizando kits fácilmente disponibles. IgE medición puede ser importante en situaciones donde el grado de sensibilización, a diferencia de la respuesta de los órganos diana, es un parámetro fundamental. Hay una amplia variedad de otras mediciones, incluyendo citoquinas y las respuestas de células T, que son valiosos adyuvantes para el estudio de la enfermedad de las vías respiratorias alérgicas en modelos animales que no hemos descrito aquí. Es la gran variedad de respuestas pertinentes que la sensibilización de antígeno y el desafío puede provocar que hacen de estos modelos valiosos en estudiosY de esta enfermedad.