Murint Model of Allergen Induced Astma

I. Allergen Sensibilisering og Challenge (se figur 1)

A. For intratrakeal Challenge

1. For første allergi, injiserer mannlig eller kvinnelig C57BL / 6 eller BALB / c mus (6-8 uker gammel) intraperitonealt på dag 0 og igjen på dag 7 med 20 mikrogram ovalbumin (OVA, Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) emulgert i 0,2 ml sterilt fosfatbufret saltvann (PBS) som inneholder 2 mg aluminiumhydroksid (Sigma-Aldrich) eller med 2 mg aluminiumhydroksid i 0,2 ml sterilt PBS som kontroll.
2. Utfordring med antigen som er hensiktsmessig (f.eks på dager 14, 16, 18 og 20). Challenge prosedyre følger.
3. Anesthetize mus med en intraperitoneal (ip) injeksjon av en blanding av ketamin (90 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg). Kontroller at musen er fullt bedøves i minst 10 min.
4. Angle drift overflate på 45 grader eller høyere. Plasser musen på denne flaten holde ventral side oppover og hodet på toppen.
5. Hook thread henhold foran fortennene å holde hodet bakover. Nivå potene med hverandre for å sikre luftrøret er rett og bruke tape for å holde beina. Sug kirurgiske området med 70% EtOH og bomullspinne.
6. Påfør bupivicaine (0,1 til 0,2 ml 0,25% løsning) topically på innsnitt området.
7. Nip hud på halsen med pinsett og trekk forsiktig utover. Lag en liten vertikal snitt med kirurgisk saks. Minimer størrelsen på såret.
8. Forbered en 1 ml sprøyte med 50 mL PBS eller 0,1% OVA i PBS og sette det inn i en repeterende pipette (Tridak Stepper, Torrington, CT). Ta pipetten i den ene hånden og bruk den andre til å holde vevet tilbake med pinsett og avsløre luftrøret.
9. Hold sprøyten som parallell til luftrøret som mulig, sette inn nål gjennom luftrøret vegg og injisere løsningen.
10. Opprettholde mus i en vertikal orientering etter injeksjon for å gi tid for løsning å bosette seg i lungene.
11. Forsiktig og sterilely tett sårområdet medpinsett og tetning med sutur.
12. Plasser mus sternum-ned på en varmepute og la det komme frem helt oppegående. Etter utvinning, tilbake musen til dyret omsorg anlegget og overvåke det daglig for tegn på serom, betennelse eller infeksjon, og sårdehiscens før såret er helt grodd.

B. For Challenge Nebulization

1. Sensitize musene på dag 0 ved intraperitoneal injeksjon av 20 mikrogram OVA (Sigma-Aldrich) emulgert i 0,2 ml sterilt PBS som inneholder 2 mg aluminiumhydroksid (Sigma-Aldrich) eller med 2 mg aluminiumhydroksid i 0,2 ml sterilt PBS som kontroll .
2. På dag 14, øke allergi ved ip injeksjon som beskrevet ovenfor.
3. På 21 ^{m, 22., 23., 24.} og ^25. dag etter første allergi, utfordre mus ved eksponering for 30 min til nebulized 1% OVA eller PBS alene levert via en ultrasonisk forstøveren (Buxco Forskning Systems, Wilmington, NC).
4. Plasser mus i hoved kammer WBP, akklimatisere dem innenfor plethysmography kammeret i minst 10 min.
5. Place 1 ml 0,1% OVA i sterilt PBS eller sterilt PBS alene, som beskrevet i trinn 4-6 nedenfor, via en forstøveren kopp. Nebulize for 30 min.
6. Ta forstøveren kopp og kast eventuelle gjenværende løsning.
7. Nebulization kan utføres på alle mus samtidig ved hjelp av en nebulization kammer.

II. Fastsettelse av Airway hyperreaktivitet til Methacholine

A. Ikke-invasiv måling av Airway hyperreaktivitet ved Whole-body Plethysmography (WBP; Buxco Forskning Systems, Wilmington, NC)

1. La pulverisert methacholine flasken varmes opp til romtemperatur før åpning (methacholine er veldig hygroskopisk og vil danne unyttige klumper om lov til å absorbere vann). Forbered en 200 mg / ml stamløsning i sterile PBS, så gjør serielle to-fold fortynninger (f.eks, 100, 50, 25, 12,5 og 60,25 mg / ml). Hold løsninger kald.
2. Sett opp utstyret som følger: koble main innløpet WBP til forstøveren, bias-flow innløp til luft-pumpe, og WBP utløp for gass felle bruke tettsittende gummi slange. Fest trykktransduser å bygge bro over utsalgssteder av de viktigste og referanse kamrene i WBP. Koble trykktransduser til forforsterker med de kablene som følger, og koble forforsterker til PC ved hjelp av spesifikke data-oppkjøpet kort.
3. Kalibrer forforsterker bruke programvaren i henhold til produsentens anbefalinger.
4. Plasser mus i hoved kammer WBP, akklimatisere dem innenfor plethysmography kammeret i minst 10 min, deretter spille baseline målinger (Penhbase) for 3 min.
5. Place 1 ml steril PBS i forstøveren koppen. Nebulize for 2 min og deretter overvåke luftveier variabler for en ekstra 6 min under tørkefasen. Ta forstøveren kopp og kast eventuelle gjenværende PBS.
6. Place 1 ml av 6,25 mg / ml methacholine i forstøveren koppen og rEPEAT nebulization for 2 min pluss en 6-min overvåkingssyklusen.
7. Gjenta målingen med 12,5, 25, 50 og 100 mg / ml methacholine, bruker den samme 2-min nebulization periode og 6-min overvåkingssyklusen.
8. Fjern musene fra kamrene og returnere dem til sine bur.
9. Påfyll forstøveren kopp med 1 ml steril PBS og kjøre en annen sekvens for å skylle slangen.
10. Slå luften strømmer, demontere, og tørk rengjør alle kamrene før du kjører et annet sett av dyr.

B. Invasiv Måling av luftveienes reaktivitet ved Datastyrt Ventilator (flexiVent; SCIREQ Inc., Montreal, Canada)

1. Vei musen og anesthetize ved intraperitoneal (ip) injeksjon av 60 mg per kg kroppsvekt pentobarbital natrium.
2. Etter tilstrekkelig anestesi, posisjon musene ventro-dorsally for trakeostomi.
3. Desinfiser hals huden med 70% etanol. Påfør bupivicaine (0,1 til 0,2 ml 0,25% løsning) topically på incision nettsted. Incise og åpne halsen huden. Skill nakkemusklene og avsløre luftrøret.
4. Lag en 1 - til 2-mm snitt i luftrøret med fine saks (være sikker på ikke å kutte i luftrøret) og sett inn trakealtuben forsiktig. Knytt en sutur rundt luftrøret for å hindre en luftlekkasje.
5. Legg mus i kroppen pletysmograf kammeret og koble inn trakealtuben til ventilatoren.
6. Begynn mekanisk ventilasjon. Sett passende respirasjonsfrekvens og tidevann / slagvolum (150 slag / min og 200 mL, henholdsvis for en 20-g mus). Vær sikker på at thorax beveger seg synkront med ventilator. Hvis musen er "slåss" med ventilator (self-respirasjon), injiserer mer bedøvelse og vente på synkronisering.
7. Etter basismålinger, vedlikeholde mus etter baseline ventilasjon for en annen 3 min, og deretter ta en 2 ^nd sett med impedans målinger. Denne 2 ^nd sett med basismålinger brukes til calculate gjennomsnittlig baseline verdier.
8. Lever PBS eller methacholine (MCH) utfordringer (6,25, 12,5, 25, 50 og 100 mg / ml) ved å kanalisere inspiratorisk flow fra ventilator gjennom en ultrasonisk forstøveren.
9. Etter hver utfordring med MCH (6,25, 12,5, 25, 50 og 100 mg / ml), tilbake stempelet til å levere en Vt på 10 ml / kg ved 120 åndedrag / min og ta impedans målinger.

III. Måling av Cellular infiltrasjon i luftrommet

A. Perform Bronchoalveolar lavage (BAL)

1. Etter å måle AHR, avlive mus med CO _2, og posisjonere hvert mus på ryggen på den kirurgiske pad.
2. Væt området med 70% EtOH.
3. Begynnelsen på den nedre del av magen, kutte åpne bukhulen og fjerne hud / øvre muskler, flytte oppover mot ribbeina.
4. Når ribbeina er synlige, bruker saks til å nøye punktere membranen. Lunger bør skjule bort fra mellomgulvet. Vær spesielt careful ikke nick lungene eller hjerte.
5. Skjær bort brystkasse å fullt utsette lungene / hjerte (unngå å skjære noen store blodkar for å holde blodet i å fylle hele området).
6. Bruk en 1 ml sprøyte med en 27 gauge nål (BD sprøyter, Franklin Lakes, NJ), punktere hjertet ventriklene og langsomt og forsiktig trekke tilbake sprøyten å samle blodet. Pass på å unngå kollapset hjertet.
7. Samle serum fra dette blodet ved hjelp av standard protokoll. Oppbevares ved -70 ° C inntil bruk.
8. Skjær vekk hud og vev fra halsen til luftrøret er avslørt. Rydd unna tilstrekkelig vev til å arbeide lett innenfor feltet (igjen, unngå å skjære noen store blodårer).
9. Ved hjelp av buede saks, klippet under luftrøret for å rydde vei.
10. Pass poenget med et buet tang under luftrøret og ta tak i enden av et stykke sutur. Tegn sutur tråden under luftrøret.
11. Knyt en løs halv knop om luftrøret, lav i halsen.
12. Carefully klippe et hakk, tilstrekkelig i størrelse for kanylen, over sutur tråden.
13. Forsiktig sett kanylen inn i hullet og ned i luftrøret forbi punktet i sutur tråden. Trykk forsiktig fremover til kanylen kommer, like ved inngangen til lungene (for langt: punktere lungene, for kort: kollaps trachea når du forsøker å gjenopprette BAL).
14. Stram sutur tråden og komplett knute å forsegle luftrøret rundt kanyle.
15. Lock sprøyte (inneholder 1 ml PBS) på kanylen, og press væsken inn i lungene. Lung lobes bør individuelt blåses sakte. Gjør ikke over-fill. For en fullvoksen mus 0,9 til 1,0 ml er det absolutte maksimum. 0,8 ml kan være tryggere. Lås sprøyten løst til kanyle, ellers er det sannsynlig å forårsake skader når du prøver å løsne.
16. Uttak væske fra lungene. Hvis motstanden er oppstått (vev sugd inn kanyle), trykker kanylen sakte videre inn i lungene og gjenoppta fjerne. Prøv også å snu kanylen på plass. Hvis alle Else mislykkes, trekke kanylen delvis ut, luftrøret er mye mer sannsynlig å skjule i denne saken.
17. Koble sprøyten fra kanylen, innskudd BAL væske i beholderen, og gjenta 2 ganger med frisk PBS løsning.
18. Hold BAL løsning på is inntil spunnet ned.
19. Bruk BAL væske og serum for å måle OVA spesifikt IgE bruke kommersielt tilgjengelig mus IgE ELISA kits (MD biprodukter, St. Paul, MN).

B. Telle celler og Bestem Differensialer

1. Sentrifuger BAL væsken 5 min på ~ 600 × g, 4 ° C.
2. Resuspender cellepelleten forsiktig i PBS og holde på is.
3. Legg en standard Neubauer hemacytometer med fortynnet cellesuspensjon og telle cellene.
4. Fjern alikvoter av 2 × 10 ⁴ celler i 10-40 mL volum for cytospins. Fortynn celler hvis nødvendig.
5. For cytospins, blande 2 × 10 ⁴ celler, 130 mL PBS og 10 mL FBS. Legg hele cellen blandingen til double Cytospin trakt og sentrifuger 10 min ved 700 rpm, med doble cytoslides etter like prøver.
6. La lysbilder tørke i romtemperatur i 1 time før farging.
7. Flekk lysbildene ved hjelp av Diff-Quick flekk (Siemens, Newark, DE).

IV. Representative Resultater

Overdreven luftveier innsnevring etter provoserende stimuli er et fremtredende trekk ved klinisk astma. Vi beskriver to metoder for å måle slik luftveienes hyperreaktivitet til methacholine i OVA-sensibiliserte og utfordret mus: Whole-body plethysmography (figur 2) og tvang oscillasjon bruke flexiVent systemet (figur 3). Begge metodene viser at OVA sensibilisering og utfordring produserer luftveier hyperreaktivitet hos mus.

Eosinophil-rik Airway betennelse er en annen fremtredende trekk både klinisk astma og allergisk luftveissykdom hos mus. Som vist i figur 4

Mye tyder på at allergiske luftveissykdom resultater fra overproduksjon av IgE antistoffer mot sensibiliserende antigener. Sensibilisering og utfordringen med OVA ved hjelp av protokollene vi beskriver øker IgE nivåer i både serum og BAL væske av behandlede mus (figur 5).

Figur 1. Eksperimentelle skjema for OVA-indusert allergisk astma. Musene var sensibilisert dobbelt ip med 20 mikrogram OVA emulgert i 2 mg aluminiumhydroksid i 0,2 ml sterilt PBS, eller 2 mg aluminiumhydroksid i 0,2 ml sterilt PBS alene, fulgte på indikerte tidspunkter ved den utfordrer med 0,1% OVA eller steril PBS løsning eller daglig ex posure i 30 minutter til nebulized 1% OVA i PBS eller PBS alene levert via en ultrasonisk forstøveren (Buxco). Tjuefire timer etter siste OVA eksponering, ble luftveienes reaktivitet bestemt. Deretter ble BAL væske, blodprøver, lungeceller, og vev samles for videre analyse.

Figur 2. Vurdering av allergen-indusert luftveier hyperreaktivitet av en invasiv metode. Mus (n = 4/group) var sensibilisert og utfordret med OVA. Tjuefire timer etter siste utfordringen, ble luftveiene hyperreaktivitet til inhalert methacholine bestemmes ved hjelp av hele kroppen plethysmography som beskrevet i protokollen. Penh ble bestemt og uttrykt som Penh ratio (gjennomsnitt Penh over 8-min intervall med methacholine dividert på gjennomsnittlig Penh over 8-min intervall med PBS). *, P <0,05 vs PBS.

iles/ftp_upload/3771/3771fig3.jpg "/>
Figur 3. Vurdering av allergen-indusert luftveier hyperreaktivitet av en invasiv metode (tvunget oscillasjon). Mus (n = 4/group) var sensibilisert og utfordret med OVA. Tjuefire timer etter siste utfordringen, ble luftveiene hyperreaktivitet til økende konsentrasjoner av inhalert methacholine bestemt av tvungen svingning (flexiVent)-metoden som beskrevet i protokollen. A, B) Airway motstand; C) Lung elastance. *, P <0,05 vs PBS.

Figur 4. BAL væske celletall. Mus (n = 4/group) var sensibilisert og utfordret med OVA. Tjuefire timer etter siste utfordringen, (Til toppen) BAL celler ble samlet og totalt celler ble regnet som beskrevet i protokollen. (Nederst) Cytospin lysbilder var prepared og farget med Diff-Quick. Tot = totalt celler; Eos = eosinofile, Neu = nøytrofile; Mac = makrofager; Lym = lymfocytter. *, P <0,05 vs PBS.

Figur 5. OVA-spesifikk IgE. Mus (n = 4/group) var sensibilisert og utfordret med OVA. Tjuefire timer etter siste utfordringen, ble IgE målt i BAL væske og i serum fra blod tatt av hjertestans punktering som beskrevet i protokollen. *, P <0,05 vs PBS.

Dyremodeller av allergisk luftveissykdom gi viktige verktøy for studier som er relevante for klinisk astma. En rekke forskjellige modeller, sysselsetter varierende art og antigener, har blitt utviklet. Musen, et attraktivt og mye brukt laboratorie arter, tilbyr også en rekke fordeler for modeller av allergisk luftveissykdom. ^9,10 Selv om slike modeller ikke etterligne astma i enhver henseende, ¹¹ med aspekter ved kronisk sykdom blir spesielt vanskelig å reprodusere, ^12,13 vi bekrefter her at mange av de viktigste funksjonene er gjengitt. Vi viser også at som i menneskelig astma, er disse funksjonene knyttet til økning i antigen-spesifikk IgE i både serum og BAL væske. Vi presenterer to murine modeller, både ansette egg som antigen, men bruk annen utfordring teknikker. Intratrakeal administrasjon er noe komplisert og tidkrevende, men har den fordelen av å levere en kjent mengde antigen direkte tillunge. Det er også mulig at denne metoden leverer antigenet dypere inn i lungene enn gjør alternativer. Vi beskriver en invasiv metode for intratrakeal levering, men antigen kan også leveres intratracheally via en tube eller kanyle inn via munnhulen. Denne metoden er beskrevet andre steder i Jove. ¹⁴ Nebulization er enklere og mer direkte etterligner vanlige ruten for human eksponering. Kvantitering er mer variabel, imidlertid, og levering til lungene kan være mindre effektiv. ^Femten faktisk, er det sannsynlig at en betydelig, men ukjent brøkdel av dosen avsettes i øvre luftveier. Et tredje alternativ, ikke er beskrevet her, er intranasal levering. Igjen, er det sannsynlig at en betydelig andel av dosen vil bli deponert i de øvre luftveiene.

Selv om vår demonstrasjon er utført ved hjelp C57BL / 6 mus, tyder bevisene på at enkelte andre stammer kan gi mer robuste resultater på spesifikke endepunktene. I sammenligninger av C57BL / 6 med BALB / c ¹⁶ eller med begge BALB / c og FVB / NJ ¹⁷ mus, de C57BL / 6 mus viste den minste økningen i AHR. På den annen side viste C57BL / 6 mus større økning i eosinofili i en studie ^16, men ikke i den andre. ¹⁷ cytokin økningene var både stamme-og cytokin-spesifikk. Den foretrukne belastningen kan derfor avhenge av endepunkt anses viktigste.

To hovedtrekk allergisk luftveissykdom blir ofte valgt for vurdering for å fastslå effekten av eksperimentelle manipulasjoner: Ahr og omfang luftveier betennelse. AHR kan måles enten ved hele kroppen plethysmography (WBP) eller ved tvang pendling. I begge tilfeller er methacholine brukt som provoserende utfordring. WBP er en funksjonell in vivo måling som tillater analyse av luftveier reaktivitet på bevisst, fritt flytte eller minimalt behersket mus uten invasiv kirurgi og anestesi. Airway reaksjonsevne er uttrykt ved hjelp"Forbedret pause" (Penh) som en parameter av endret luftveier funksjon. Penh er en empirisk parameter som reflekterer endringer i boksen flyten bølgeform fra både inspirasjon og utløp, og kombinerer den med sammenligning av tidlig og sent ekspiratorisk boks flyt. WBP har flere potensielle fordeler sammenlignet med invasive midler for måling lunge motstand, siden det er teknisk mindre krevende og gjør målinger av luftveienes reaktivitet overfor aerosolized sentralstimulerende midler. Denne metoden reduserer både effekter av psykologisk stress og dyr forberedelse tid, noe som gjør det ideelt for gjentatte målinger (undersøkelse av samme dyr ved ulike tidspunkt) og måling over lang tid (> 24 timer), hvor en rekke av aerosoler kan gis på en kontrollert og repeterbar måte. Resultatene samsvarer sterkt med de av invasive metoder, men det er raskere og enklere.

To alternative noninvasive metoder gir målinger som er sagtå være mer direkte knyttet til luftveiene innsnevring. I dobbel-kammer plethysmography musen er tvunget til å stikke hodet gjennom et hull i fronten av thoracoabdominal kammeret. ¹⁸ A nasal kammer blir så montert på forsiden av thoracoabdominal kammer og et hode-hull er skåret i selfangst latex filmen mellom kamrene. Dette hullet er nettopp dimensjonert for å gi en lufttett forsegling mellom kamrene uten å begrense luftveiene luftstrøm. Plethysmographic målinger blir deretter tatt i begge kamre og forsinkelsen mellom nese og thoracoabdominal strømmer brukes til å beregne spesifikke luftveismotstanden (sRAW). Head-out plethysmography er lik bortsett fra at luften flyter fritt i nasal kammeret og ingen plethysmographic målinger er gjort der. ^19. primære beregnet parameteren er strømningsrate på midexpiratory fase (EF _50). Begge teknikker, som WBP, er egnet for gjentatte målinger over flere timer, tillater vurdering av both tidlig og sent svar. Men begge krever dyrene å være tilbakeholdne, noe som kan gi uberegnelige resultater med mindre dyrene er vant til apparatet i løpet av flere dager. Det kan også være vanskelig å sikre en effektiv lufttett forsegling, som er avgjørende i begge tilfeller. Videre har siden både Penh og sRAW vist å korrelere sterkt med invasive målinger, og Penh og sRAW har vist seg å korrelere direkte i marsvin, ²⁰ det kan stilles spørsmål ved om ytterligere informasjon innhentet rettferdiggjør økt eksperimentelle problemer.

I tvunget svingning metoden, er dypt anesteserte mus tracheotomized og en mekanisk ventilator er koblet til røret. Pressure-flow målinger som ventilator blåses og deflates lungen da tillate direkte måling av pulmonal motstand og dynamisk etterlevelse. Dette gir informasjon om Airway mekanikk som ikke er tilgjengelig med WBP. ForCED oscillasjon er teknisk vanskeligere, imidlertid, og er vanligvis en terminal prosedyre. Som eksperimentelle endepunkter, de to prosedyrene generelt gi lignende resultater. ¹⁹

Den andre fremtredende trekk ved klinisk astma vanligvis brukes til å vurdere effekten av eksperimentelle manipulasjoner i murine allergisk luftveissykdom er eosinofil inflammasjon. Selv om andre aspekter ved betennelse kan måles i tillegg, dette oftest innebærer fastsettelse av omfanget av inflammatorisk celle (spesielt eosinophil) infiltrasjon i luftveiene, lungene, eller begge deler. Antall og type celler i luftveiene bestemmes i BAL væske: Første total celle nummer bestemmes ved å telle i en hemacytometer, og deretter celle type er bestemt av differensial farging følgende Cytospin. Selv BAL væskeansamling kan i prinsippet utføres i levende mus, som det er hos mennesker, er det mer normalt og praktisk utført etter dødshjelp. Eosinophilinfiltrasjon i lungene blir vurdert ved lunge eksisjon etterfulgt av standard histopatologiske teknikker.

I noen tilfeller kan det også være nyttig å vurdere i hvilken grad antigen sensibilisering og utfordring stimulerer beger (slim-produserende) celleproliferasjon. Dette gjør du enkelt ved farging lunge seksjoner med periodisk syre-Schiff-tallet, som er spesifikk for slim. Antigen-spesifikke IgE kan også måles i BAL væske og serum ved hjelp av lett tilgjengelige kits. IgE måling kan være viktig i miljøer hvor graden av allergi, til forskjell fra slutten-orgelet respons, er en avgjørende parameter. Det finnes en rekke andre målinger, blant annet cytokiner og T-celle responser, som er verdifulle tingene som til studiet av allergisk luftveissykdom i dyremodeller at vi ikke har beskrevet her. Det er bredt utvalg av relevante tiltak som antigen sensibilisering og utfordring kan framprovosere at gjengi slike modeller verdifull i study av denne sykdommen.