Synthèse d'un

Justin Lam¹, Paul C. Simpson^2,3, Phillip C. Yang¹, Rajesh Dash¹

¹Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University Medical Center, ²Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California, San Francisco, ³San Francisco VAMC

Adapté de l'étude préalable ^1.

1. Conjugaison de l'annexine V à SPIO

1. Oxyder particules SPIO (Océan Nanotech Inc, 5 mg / ml) pendant 1 heure à 20 ° C dans l'obscurité dans une solution de sodium à 0,15 M periodate (NaIO ₄₎ (4:1 rapport poids: poids) ^2.
2. Incuber la SPIO oxydé pendant 12 heures avec la protéine purifiée ANX (ratio 1:1, poids: poids) dans 0,15 M de borate de sodium (Na ₂ B ₄ O ₇ 10H ₂ O) à 20 ° C.
3. Réduire le mélange en outre pendant 1 h avec du borohydrure de sodium (NaBH ⁴⁾ sous la hotte, puis étancher avec 0,15 M de Tris-HCl.
4. Séparer le ANX libre de ANX-SPIO par centrifugation à 14.000 xg (75 um des pores Microcon filtre, Millipore, Billerica, MA).
5. Affiner le composé en éliminant les impuretés non liées à l'aide d'un dispositif séparateur magnétique (Océan Nanotech, Inc.)
6. Quantifier le filtre rétentat (ANX-SPIO) la teneur en protéinespar dosage de la protéine de Bradford et de conserver à -80 ° C à 2 mg / mL dans 0,1 M de Tris-HCl avec 1% de sérum albumine inhibiteurs de protéase et inhibiteurs de protéase (Halt, Thermo Scientific, 1-50 mg / mg ANX).

2. Diffusion de la lumière dynamique

1. Séparément diluer le SPIO et ANX-SPIO dans du PBS à une densité optique de 0,1 et d'analyser par la diffusion dynamique de la lumière dans une machine Zetasizer Nano DLS (Malvern Inc, la sauce Worcestershire, Royaume-Uni) ^3.
2. Obtenir des pics monomodales (idéalement) pour le composé, avec une taille de particule moyenne Z et l'indice de polydispersité (PDI). Comparez cette taille à la taille DLS-mesurée de la nanoparticule d'oxyde de fer seul. ANX-SPIO résultats DLS a montré un diamètre de particule conjugué hydrodynamique de 78 nm avec un PDI de 0,13 ^1, reflétant un groupe homogène ANX-SPIO espèces ^3.

3. Culture cellulaire, l'induction de l'apoptose dans la culture, et de l'IRM de cellules en culture

1. Culture souris adulte de moelle osseuse mésenchymateuse scellules TEM (mMSCs) dans du DMEM supplémenté avec 10% de FBS et 1% de pénicilline-streptomycine (Invitrogen, Inc), de préférence au passage ²⁰ au 30 avril.
2. Induire l'apoptose dans les cellules en culture en traitant pour faire varier les temps à 37 ° C avec DOX (Sigma, 1 mM dans une solution saline à 0,9%, une concentration de 1 uM dans les médias) ^12.
3. Quantifier le montant de l'apoptose en culture en utilisant soit l'IRM avec ANX-SPIO (décrite au point 3.4 ci-dessous) ou en utilisant la microscopie après coloration TUNEL (APO-BrdUTM essai TUNEL Kit, Molecular Probes / Invitrogen, Eugene, OR) ou après la tache avec ANX-FITC (Roche, Suisse).
4. Marquez les cellules avec ANX-SPIO (10 mg de protéine / mL de milieu, sauf indication contraire), ou avec un poids équivalent de libre SPIO (5 mg), pendant 15 min à 37 ° C. Laver 4 fois avec du PBS et de superposition avec 1 ml d'agarose à 1% pour empêcher la diffusion des nanoparticules SPIO. Effectuer IRM des plats (décrit ci-dessous). Sinon, laver les cellules et trypsiniser après DOX et ANX-SPIO étiquetage, puis permettre aux cellules deformer des pastilles de tubes Eppendorf.

4. In Vitro IRM

1. Utilisez un 1,5 ou 3 Tesla GE Signa EXCITE scanner avec bobine genou récepteur standard pour l'analyse in vitro IRM.
2. Placez les boîtes de culture ou de tubes dans un fantôme gélose, et l'image en utilisant une séquence en écho de gradient de gradient: temps de répétition (TR) 550 ms, temps d'écho (TE) 10 ms, angle de bascule de 15 °, matrice de 256 x 256, sur le terrain de vue de 3 cm x 3 cm, épaisseur de coupe de 1,3 mm, le nombre de moyennes (NEX) 2, l'espacement 0 mm ^5. Image axialement à travers la couche de cellules sur la plaque pour la perte de signal T2 *, en utilisant les régions d'intérêt (ROI) d'une zone fixe (par exemple, 0,8 mm ^2). Ajuster afin d'obtenir le contrôle de fond en utilisant ROI signal du fantôme agar. Mesurer le bruit de fond du signal de l'air environnant le fantôme.
3. Calculer le contraste IRM-to-Noise Ratio (CNR: [SI échantillon ROI-SI de contrôle ROI] / [SD du SI du bruit de fond], où SI est l'intensité du signal, etSD est l'écart-type) a été calculé pour chaque boîte de culture.

5. Les résultats représentatifs

Mesure de la perte de signal T2 * in vitro nécessite un fantôme agar homogène et l'absence de bulles d'air, ce qui créera des artefacts vide de signal. Cet artefact est difficile de distinguer à partir de véritable perte de signal T2 * de SPIO, et est essentiel à des résultats interprétables. S'il vous plaît voir la figure 1 pour un exemple d'un artefact de l'air ainsi que l'oxyde de fer véritable perte de signal T2 *.

Pour l'imagerie in vitro boîte de culture, d'appliquer un volume approprié de gélose à chaque boîte de culture, de sorte qu'un nombre suffisant de coupes axiales IRM, qui sont environ 1 mm d'épaisseur, peut être faite de manière adéquate l'image de la boîte entière. La figure 2 illustre le signal attendu IRM à partir des plaques de culture individuels dans la gélose. Il est typiquement une certaine variation de signal sur les bords de la plaque, de sorte analyse des régions de intÉREST devraient éviter ces zones inégales.

Figure 1. ANX-SPIO détecte l'apoptose dans des cultures de cardiomyocytes de rats néonatals. La figure 1A montre une photo de granulés cardiomyocytes néonataux traités avec une solution de contrôle (tube de gauche), ANX-SPIO (tube du milieu), et DOX + ANX-SPIO (tube droit) . Notez la couleur brunâtre de la DOX + ANX-SPIO cellules traitées, ce qui reflète augmentation de la rétention du composé ANX-SPIO dans les cellules apoptotiques. Figure 1B En images IRM in vitro montrent l'intense T2 perte de signal * des DOX + de ANX-SPIO cellules. En outre, une bulle d'air est observée entre les 4 ^e et 5 ^e tubes Eppendorf (petit vide de signal noir), qui est semblable au vide de signal de ANX-SPIO, et qui peuvent influer sur l'analyse de la CNR.

Figure 2. ANX-SPIOliaison est spécifique des cellules apoptotiques dans la culture. la figure 2A montre les cardiomyocytes de rats nouveau-nés sur apoptotiques des boîtes de culture, soumis à des soit-ANX fluos coloration ou ANX-SPIO coloration, avec des concentrations basses et hautes (gauche et droite, respectivement) de ANX-SPIO. Notez les différents T2 perte de signal * (signal noir) de cellules apoptotiques qui ont été traités avec fluorescente ANX (ANX-fluos) et de faibles niveaux par rapport aux niveaux élevés de ANX-SPIO. La plus grande perte de signal T2 * sur la droite est associée à une réduction marquée ANX-fluos signal, ce qui a été disputé par la hausse des hors-ASX SPIO concentrations. Figure 2B illustre la liaison compétitive de ANX-SPIO contre ANX-fluos du signal et la dissociation constante, K _i. L'axe des abscisses représente la concentration en protéine annexine en échelle logarithmique.

Film 1. Cliquez ici pour voir supplémentairefilm.

Le procédé de conjugaison décrit pour relier SPIO à l'annexine V exploite les groupes latéraux de chaîne amine de l'annexine et les groupements carboxyle de la nanoparticule SPIO. Grâce spécifiques d'oxydo-réduction étapes, la liaison covalente de ces composés peut être réalisée, et la nanoparticule fonctionnalisée obtenue peut être isolé. Cette méthode peut être généralisée à d'autres protéines et des nanoparticules d'intérêt.

Les étapes les plus critiques sont les conditions d'oxydation et de réduction, menées dans les températures appropriées et en mélangeant doucement. Rendement faible peut résulter de l'oxydation ou la réduction incomplète, qui conduit à l'annexine V résiduel libre qui est enlevée pendant l'étape de filtration. Lorsqu'il est appliqué à d'autres protéines d'intérêt, les conditions optimales peuvent varier de ceux décrits ci-dessus. Cependant, une fois ces conditions optimales sont définies, la protéine filtrée libre peut être réduite à une quantité négligeable, et donc, de filtration m microcentrifugeuseay devenu superflu. En effet, la filtration en excès peut réduire le rendement composé final en raison de la liaison non spécifique au filtre lui-même. Dans ce cas, pré-filtrage 1% d'albumine à travers le filtre se réduire une liaison non spécifique du composé conjugué au filtre et à améliorer le rendement. DLS analyse du composé final, et bien que les mesures de concentration en protéines du filtrat, aidera à déterminer si la protéine résiduelle libre est présent.

La présence de SPIO libre dans le composé final est également un contaminant potentiel. À cette fin, DLS a été utilisé pour contrôler la pureté. Un pic monomodale par DLS permet de garantir une espèce singulière d'oxyde de fer. Gratuit SPIO produit à elle seule un pic distinct DLS à 46 Nm et n'était pas présent dans ANX-SPIO préparatifs.

Plusieurs options pour bioconjugaison sont disponibles ^6-12 qui emploient les autres mécanismes de conjugaison, tels que la biotine-streptavidine ou l'interaction protéine de réticulation de personnalisés nanoparticles. La méthode présentée ici représente une approche robuste, largement applicable pour la conjugaison de nanoparticules magnétiques à des protéines d'intérêt, sans l'utilisation de nanoparticules spécialisées.