Het overwinnen van reageert niet in experimentele autoimmune encefalomyelitis (EAE) Resistant muizenstammen door adoptieve overdracht en Antigene Challenge

1. Voorbereiden CFA-geëmulgeerde Antigen

1. Los cavia MBP (bereid volgens de werkwijze van Swanborg1 en opgeslagen in gevriesdroogde vorm bij 4 ° C) in fosfaatbufferoplossing (PBS) in een concentratie van 2 mg / ml. Als gesynthetiseerd MBP peptiden (MBP _60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) ² worden gebruikt, stelt een 2 mg / ml oplossing. Opstellen van een geschikte hoeveelheid antigeen-oplossing (0,1 ml per muis om te worden gevaccineerd) in een glazen injectiespuit met luer-lok.
2. Stel een volume volledig Freund's adjuvans H37Ra (0.1WT%) (CFA, Difco Laboratories) gelijk aan het antigeen oplossing in een injectiespuit met luer-lok.
3. Sluit de twee glazen spuiten met een drie-weg kraan. Meng de MBP oplossing met de CFA door op de plunjers heen en weer. Houd de beweging tot een emulsie wordt gevormd.
4. Om te testen of er een emulsie ontstaat, duwt al het mengsel in een spuit. Maak de lege spuit, trek thij zuiger iets en ontladen een druppel van de resterende emulsie in een bekerglas van schoon water bij kamertemperatuur. Indien de emulsie druppel blijft intact op het oppervlak van het water wordt een emulsie gevormd. Als de emulsie druppel verspreidt, sluit u de spuiten en verder het mengen beweging.
5. Gebruik een 1 ml plastic spuit voor de immunisatie proces om de levering van een nauwkeurige dosering van antigeen te verzekeren. Om het antigeen emulsie te dragen aan de plastic spuit, trek de zuiger en plaats de lege plastic spuit in de opening van drie-weg kraantje waar de vorige glazen injectiespuit werd verbroken als in 1.4.
6. Vul de plastic spuit van de rand door de zuiger van de injectiespuit. Plaats de zuiger van de plastic spuit heen en terug te duwen overtollige emulsie tot het bereiken van de 1,2 ml markering op de plastic spuit. Deze manoeuvre zorgt ervoor dat er geen luchtbel zit gevangen in de plastic spuit.
7. Verwijder het plastic spuit van de drie-weg kraan. Attach een # 26 gauge naald voor aan de plastic spuit. Duw de zuiger naar de 1 ml markering, zodat de emulsie nu het dode volume van de naald vult.

2. Immunisatie van Donor Muizen

Let op: Vrouw C57BL / 6 muizen zijn meestal geïnjecteerd met antigeen-emulsie in vier plaatsen in de flanken, naar aanleiding van de methoden die oorspronkelijk ontworpen door de groep McFarlin's ³ bij de National Institutes of Health. Voor een ervaren onderzoeker, kan een persoon uit te voeren van de gehele taak. Voor beginners, kan hulp worden gevraagd, zodat een persoon de muis houdt en de andere persoon doet de injectie. Alternatief kan de muis worden verdoofd voor de injectie.

1. Vasthouden van de muis bij de nek en de huid leggen dat de staart tussen de 4 ^e en 5 ^e vingers zodanig dat de thorax en de buik zijn gemakkelijk bereikbaar.
2. Plaats de naald van de 1 ml plastic spuit op een plaats in de thorax iets boven de rechter oksel (van de mogebruiken) en subcutaan injecteren 0,05 ml van het antigeen emulsie. Een kleine uitstulping van de witachtige CFA kan worden gezien door de bleke huid. Herhaal hetzelfde voor de site in de thorax iets boven de linker oksel.
3. Laat de staart en pak de rechtervoet (van de muis), draai hem en houd hem tussen de 4 ^e en 5 ^e vingers. Ga naar de website net onder de rib geval in de rechter flank en injecteer 0,05 ml van het antigeen emulsie.
4. Laat de rechter voet, draait u de muis de andere kant op en houd de linker voet (van de muis) tussen de 4 ^e en 5 ^e vingers. Ga naar de website net onder de rib geval in de linkerflank en injecteer 0,05 ml van het antigeen emulsie.
5. Ga verder met een nieuwe naald na de injectie van 10 muizen, of als de naald wordt afgestompt.

3. Isolatie van lymfeknoopcellen voor Tissue Culture 7 tot 10 dagen na immunisatie

1. Zeven tot 10 dagen na immunisatie, offeren de muizenen verwijder de drainerende lymfeklieren. De voorkeursmethode van euthanasie met _CO2 inhalatie. Na het offer, leg de muis op zijn rug op een dissectie bord met de ledematen gestrekt en bevestigd aan het bord met pinnen. De muizen werden bevochtigd met een nevel van 70% ethanol.
2. Ingesneden in de huid lengterichting in het midden van de onderzijde van de buik naar de kin met steriele scharen en tang.
3. Snij de buik huid van het gebied van de lies aan elke poot. Trek en speld van de huid, waardoor de lies lymfeklieren.
4. Snijd de huid langs de voorpoten (links en rechts), zodat de huid kan worden geschild terug en vastgepind op de axillaire lymfeklieren in de buurt van de oksels bloot te leggen.
5. Met twee paar tang samen te werken, weg te trekken het bindweefsel over en rond de lies lymfeklieren. Als het bindweefsel worden gewist, zet een paar tangen onder de lymfeklier en weg te trekken uit het lichaam. Plaats hetlymfeklieren in een 35 mm petrischaal gevuld met steriele PBS.
6. Trek de bindweefsels die de twee okselklieren gebruik van twee paar pincetten. Isoleer de lymfeklieren en plaats ze in de petrischaal. Wees zeer voorzichtig dat u de bloedvaten het oversteken van de gebied als bloeding maakt het identificeren van de lymfeklieren heel moeilijk te doorbreken.
7. Nadat alle lymfeklieren worden verzameld, verplaatst u de petrischaal op een bioveiligheid kap. Breken en uit elkaar te plagen de lymfeklieren met de twee paren van de verlostang, slijpen de een tegen de ander. Alternatief kan de lymfeknopen worden gebroken met de platte kant van de plunjer van een 3 ml plastic spuit drukken tegen de lymfeknopen op de bodem van de petrischaal.
8. Haal het gepest lymfeklier celsuspensie door middel van een nylon mesh aan de membranen en vuil te verwijderen.
9. Maak de lymfeklier celsuspensie tot 50 ml met een steriele PBS. Centrifugeer bij 1000 rpm gedurende 10 minuten. Resuspendeer de pellet in kweekmedium. Doe een levensvatbare cell tellen en de concentratie aan te passen aan 4 x 10 ⁶ cellen / ml. UseRPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal kalfserum, 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat MEM, 0,1 mM MEM niet essentiële aminozuren, 100 U / mL penicilline, 100 pg / ml streptomycine, 10 mM Hepes buffer en 5 x 10 ^-5 M 2-ME. Pre-warm de cultuur voordat resuspenderen de cellen.
10. Cultuur de cellen in 24-well kweekplaten met 2 ml per putje (eindcelconcentratie 8 x 10 ⁶ cellen / putje). Voeg antigeen in elk putje met een uiteindelijke concentratie van 100 pg / ml. Plaats de cultuur plaat in een 37 ° C incubator met 5% CO _2. Incubeer cellen gedurende 5 dagen.

4. Oogsten Gekweekte lymfeknoopcellen 5 dagen na aanvang van culturen

1. Meng de cellen in elk putje met en neer te pipetteren een Pasteur pipet of glas een klein volume pipet. Oogst de cellen een 50 ml centrifugebuis.
2. Centrifugeer de cellen bij 1000 rpm gedurende 10 minuten. Resuspend de celpellet in een klein volume PBS.
3. Tel cellen en stel de levensvatbare cellen concentratie 2,5 x 10 ⁸ cellen / ml met steriele PBS. Teken de cellen in een injectiespuit voorzien van een # 26 gauge naald.
4. Plaats een warmte lamp boven de kooi van de ontvangende muizen om te helpen verwijden de staartader.
5. Een muis houder uitstrekken de staart van de muis door de gleuf in de houder. Trek aan de staart uit te breiden. Zoek de ader.
6. Injecteer 0,2 ml / muis van de celsuspensie gelijk 5 x 10 ⁷ cellen.

5. Antigene uitdaging van de ontvanger Muizen 20 dagen na de Cell overdracht en ontwikkeling van de ziekte symptomen

1. Challenge ontvanger muizen niet tekenen van de ziekte met het antigeen. De procedures zijn dezelfde als hoofdstuk 2 inzake "Immunisatie van Donor Muizen".
2. Let op de ontwikkeling van de ziekte van verlamde 7 tot 10 dagen na de antigene uitdaging.
   1. Ziekte begint met zwakte in de staart. Ziekte wordt ingedeeld bij eenAls de staart wordt slap. Ziekte wordt ingedeeld bij een 2 als de muis is verlamd in een achterpoot. Ziekte wordt beoordeeld 3 wanneer beide achterpoten verlamd zijn en de muis sleept beide achterste ledematen bij het kruipen naar voren. Ziekte wordt beoordeeld 4 wanneer de muis verliest gebruik van beide voorpoten, waardoor de muis volledig immobiel. Ziekte wordt beoordeeld 5 wanneer de muis is ten dode opgeschreven en het lichaam krult omhoog. De dood wordt gescoord als de ziekte van klas 6 ^4.
3. MBP-specifieke EAE geïnduceerd in C57BL / 6 muizen na dit protocol is monofasische. De muizen kunnen herstellen van de ziekte, maar niet ondergaan spontane terugval.

6. Representatieve resultaten

Muizen die ontvangen primer en in vitro-uitgebreide donor lymfeknoopcellen niet ontwikkelen van EAE symptomen van de ziekte, als gevolg van hun resistentie tegen ziekten inductie. Echter, ernstige ziekte ontwikkeld na antigene uitdaging (Tabel I), waaruit blijkt het vermogen van de antigene uitdaginghet omkeren van de resistentiemechanisme. Twee speciale kenmerken van de bekende antigene uitdaging is de dosering van antigeen en de kinetiek van uitdaging om ziekte te veroorzaken. Zeer lage dosis antigeen nodig als weergegeven in tabel III. Verrassenderwijs kan muizen die donorcellen een jaarlijks nog vroeger van ernstige ziekte bij provocatie met het antigeen (Tabel IV). Deze twee observaties suggereren de betrokkenheid van de "lange duur" T-cellen in het handhaven van EAE weerstand. Dit protocol is voor vele EAE resistente muizenstammen ^4.

Figuur 1. Stroomdiagram van de experimentele opzet voor de inductie van EAE in het beroemde resistente muizenstammen.

Tabel I. Inductie van MBP-gemedieerde EAE in C57BL / 6 muizen. Adoptieve overdracht van primer en in vitro-uitgebreide donor cellen induceerde geen EAE in C57Bl / 6 muizen. Antigene uitdaging bericht cel overdracht maakte de muizen gevoelig voor de ziekte van inductie. Av., Gemiddeld. ND, niet gedaan.

Tabel II. De specificiteit van de antigene uitdaging. Ontvanger muizen geprikkeld met de priming antigeen en andere irrelevant antigenen. Alleen de priming antigeen veroorzaakt ernstige ziekte. OVA: kip ovalbumine. Av., Gemiddeld.

Tabel III. Challenge antigeen doses die nodig zijn voor de ziekte van inductie. Verschillende concentraties van MBP gebruikt voor het ontvangende muizen uitdagen werden getest. Av., Gemiddeld.

Tabel IV. Kinetiek van antigene uitdaging. Ontvanger muizen werden uitgedaagd op verschillende tijdstip bericht vast te stellenive cel overdracht. Av., Gemiddeld.

Studies van EAE in muizen vaak gebruik maken van de neuroantigens, myeline basis eiwit (MBP), proteolipid proteïne (PLP) of myeline oligodendrocyt eiwit (MOG). Eerdere studies meestal gebruikt MBP. PLP stimuleert sterke en consistente reacties van SJL muizen. Meer recent, MOG is de gebruikte gemeenschappelijke neuroantigen omdat B6 muizen zijn gevoelig voor de ziekte van inductie met dit antigeen. Veel van het gen gerichte muizenstammen op de B6 genetische achtergrond. Interessant, B6 muizen zijn gevoelig voor inductie EAE met MOG, maar bestand zijn tegen ziekten inductie met MBP.

Veel van de eerdere poging in het ontrafelen van de mechanismen van EAE gericht op de inductie mechanismen van de ziekte, de gevolgen van de cytokine productie en het herstel gemedieerd door regulatoire T-cellen ^5-7. Hoe bekende EAE resistente muizen kunnen de inductie van ziekte, anderzijds ondermijnen niet was uitgebreid onderzocht. Dit kan omdat het moeilijk te kwantificeren unresponsiveness. Arnon ⁸ 1981 eerste gebleken dat de behandeling met cyclofosfamide B6 muizen deze muizen gevoelig voor EAE geïnduceerd met MBP weergegeven. Andere gebleken dat behandeling met anti-gamma interferon met succes veroorzaakt ziekte B6 en Balb / c muizen ^9,10. Er zij opgemerkt dat deze studies alle niet-antigeen-specifieke markers gericht. Anderzijds het protocol beschreven staat een ander aspect van EAE weerstand. Hier alleen specifieke antigeen gebruikt in de uitdaging kan overwinnen EAE niet-reageren en laat de inductie van de ziekte. Dit protocol omvat zowel de weerstand EAE fase adoptieve overdracht van primer donor T-cellen en de gevoeligheid fase met een antigeen (Tabel I). Experimenten kunnen worden ontworpen om de intrinsieke factoren die EAE weerstand en factoren die deze niet-reageren te keren behouden te bestuderen. Aanvankelijk werd aangetoond dat EAE resistente muizen kon autoimmuun reacties monteren als geïmmuniseerdmet MBP ^4. Later werd aangetoond dat encefalitogene T-cellen bestond deze muizen ^2. Een aantal recente studies toonden aan dat ^11,12 behandeling van B10.S muizen met anti-CD25 antilichamen voor immunisatie van de muizen te proteolipid eiwit (PLP) de muizen omgezet van bestand tegen gevoelig, wat de rol van regulerende T-cellen (Tregs) in handhaving EAE weerstand. Dit is echter niet het geval wanneer C57BL / 6 muizen soortgelijke wijze worden behandeld en geïmmuniseerd met MBP ^13. Het grootste deel van de muizen nog steeds niet reageert. Zo kan EAE verzet multi-factorieel. Aangenomen wordt dat bij C57BL / 6 muizen reageren op MBP, thymus selectie meest MBP-reactieve T-cellen, zodanig dat de frequenties van MBP-reactieve T-cellen in de omtrek zeer laag verwijderd. Dit onder de drempel-lage frequentie zou maken de muizen niet in staat om te immunisatie reageren met MBP. De provocatiedosis door onbekende mechanismen, kan de frequentie afgifte en m overwinnenount een autoimmuunreactie. Verder onderzoek van de mogelijke mechanismen zijn onder meer de rol van IL-6 ¹² tijdens de antigene uitdaging bij het ​​beïnvloeden van de gevoeligheid van encefalitogene voor remming door Tregs.