Overvinde unresponsiveness i eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) Resistente musestammer ved adoptiv overførsel og antigenudfordring

1. Fremstilling CFA-emulgeret Antigen

1. Opløs marsvine MBP (fremstillet ifølge fremgangsmåden ifølge Swanborg1 og opbevaret i lyofiliseret form ved 4 ° C) i phosphatpufferopløsning (PBS) ved en koncentration på 2 mg / ml. Hvis syntetiserede MBP peptider (MBP _60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) ² anvendes, fremstilles en 2 mg / ml opløsning. Udarbejde en passende mængde af antigen-opløsning (0,1 ml per mus kan immuniseres) i en glassprøjte med luer-lok.
2. Opstille en volumen af ​​komplet Freunds adjuvans H37Ra (0,1 vægt%) (CFA, Difco Laboratories) svarende til antigenet opløsningen til en anden glassprøjte forsynet med luer-lok.
3. Forbinde de to glassprøjter med en tre-vejs stophane. Bland MBP opløsning med CFA ved at skubbe stemplerne frem og tilbage. Holde bevægelse, indtil en emulsion dannes.
4. For at teste om en emulsion dannes, skubbes hele blandingen i en sprøjte. Tag den tomme sprøjte, træk than stemplet lidt tilbage og udføre en dråbe af den resterende emulsion i et bæger med rent vand ved stuetemperatur. Hvis emulsionen dråbe forbliver intakt på overfladen af ​​vandet, en emulsion dannes. Hvis emulsionen dråbe spreder, tilslut sprøjter og fortsætte blanding bevægelse.
5. Anvende en 1 ml plastsprøjte til immunisering for at sikre levering af en nøjagtig dosis af antigen. At overføre det antigen emulsionen til plastsprøjte, træk stemplet og indsætte den tomme plastsprøjte ind i åbningen af ​​trevejs stophane, hvor det foregående glassprøjte blev afbrudt som i 1.4.
6. Fyld plastsprøjte til fælgen ved at skubbe stemplet i glassprøjte. Indsætte stempel plastsprøjte tilbage og skubbe overskydende emulsion indtil nå 1,2 ml mærket på plastsprøjte. Denne manøvre sikrer, at ingen luftbobler er fanget inde i plastsprøjte.
7. Fjern plastik sprøjten fra tre-vejs stophane. Attach en # 26 gauge nål til plastsprøjte. Stemplet presses til 1 ml mærket, således at emulsionen nu fylder hulrumsvolumenet af nålen.

2. Immunisering af donormus

Bemærk: Kvindelige C57BL / 6 mus er typisk injiceres med antigen emulsion i fire steder i flankerne, efter de metoder, der oprindeligt designet af McFarlin gruppe ³ ved National Institutes of Health. For en erfaren efterforsker, kan én person udføre hele opgaven. For begyndere, kan hjælpen rettes henvendelse således, at en person holder musen og den anden person gør injektionen. Alternativt kan musen bedøves til injektion.

1. Hold musen fast ved halsen huden og hæmmer halen mellem 4 ^th og 5 ^th fingre, således at brystkassen og maven er let tilgængelige.
2. Placere nålen i 1 mL plastsprøjte på et sted i thorax lidt over den højre armhule (i mobrug) og injicere 0,05 ml af antigenet emulsionen subkutant. En lille bule i hvidlige CFA kan ses gennem den blege huden. Gentag det samme for stedet i brystkassen lidt over den venstre armhule.
3. Slip hale og tage fat i højre fod (for mus), drej den og holde den mellem 4 ^th og 5 ^th fingre. Finde sted lige under ribben tilfældet i den højre flanke og injicere 0,05 ml af antigenet emulsion.
4. Slip højre fod, drej musen den anden vej og hold venstre fod (af musen) mellem 4 ^th og 5 ^th fingre. Finde sted lige under ribben tilfældet i den venstre flanke og injicere 0,05 ml af antigenet emulsion.
5. Skifte til en ny nål efter injektion af 10 mus, eller hvis nålen bliver sløve.

3. Isolering af lymfeknudeceller for Tissue Culture 7 til 10 dage efter immunisering

1. Syv til 10 dage efter immunisering, ofrer museneog fjerne de drænende lymfeknuder. Den foretrukne fremgangsmåde til eutanasi af CO ₂ inhalation. Efter aflivning lå musen på ryggen på en dissektion bord med benene strakt ud og fastgjort til bestyrelsen med stifter. Musene befugtet med en spray af 70% ethanol.
2. Skær en spalte i huden på langs i midten af ​​den nedre ende af maven til hagen med sterile sakse og tænger.
3. Skær maven huden fra området i lysken ned til hvert ben. Skræl tilbage og pin ned i huden, udsætter de inguinale lymfeknuder.
4. Skære huden langs forbens (venstre og højre), således at huden kan skrælles tilbage og holdt nede for at blotlægge de axillære lymfeknuder i nærheden armhulerne.
5. Med to par tænger samarbejder, trækkes væk bindevæv dækker og omkring de inguinale lymfeknuder. Når bindevævet er fjernet, anbringes et par tænger under lymfeknude og trække sig væk fra kroppen. Placerlymfeknuder i en 35 mm petriskål fyldt med sterilt PBS.
6. Træk væk bindevævet, der dækker de to armhulen lymfeknuder ved hjælp af to par pincet. Isoler lymfeknuder og placere dem i petriskålen. Vær meget omhyggelig med ikke at bryde de blodkar, der krydser området som blødningen gør at identificere lymfeknuder meget vanskeligt.
7. Efter alle de lymfeknuder samles, flytte petriskål op til biosikkerhed hætte. Stykker og drille lymfeknuderne fra hinanden med de to par tænger, formaling mod hinanden. Alternativt kan lymfeknuder blive brudt op ved hjælp af flade ende af stemplet i en 3 ml plastsprøjte presser mod lymfeknuderne på bunden af ​​petriskålen.
8. Passere drillede lymfeknude cellesuspension gennem en nylonsigte at fjerne membraner og debris.
9. Der fyldes op til lymfeknude cellesuspensionen til 50 ml med sterilt PBS. Centrifugeres ved 1000 rpm i 10 min. Pellet resuspenderes i dyrkningsmedium. Gør en levedygtig cell tæller og justere koncentrationen til 4 x 10 ⁶ celler / ml. UseRPMI 1640 suppleret med 10% føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin, 1 mM MEM natriumpyruvat, 0,1 mM MEM ikke-essentielle aminosyrer, 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 10 mM Hepes-buffer og 5 x 10 ^-5 M 2-ME. Opvarme kulturen før resuspendering af cellerne.
10. Dyrkning af cellerne i 24-brønds dyrkningsplader med 2 ml volumen per brønd (endelig cellekoncentration 8 x 10 ⁶ celler / brønd). Tilsættes antigen til hver brønd ved en slutkoncentration på 100 ug / ml. Placer dyrkningspladerne på en 37 ° C inkubator med _5% CO2. Cellerne inkuberes i 5 dage.

4. Høst Dyrkede Lymfekirtelceller 5 dage efter initiering af kulturer

1. Blandes cellerne i hver brønd ved at pipettere op og ned med en Pasteur-glaspipette eller et lille volumen pipette. Høst af cellerne til et 50 ml centrifugerør.
2. Centrifugeres cellerne ved 1000 opm i 10 minutter. Resusgige cellepelleten i et lille volumen af ​​PBS.
3. Tæl celler og justere de levedygtige cellekoncentrationen til 2,5 x 10 ⁸ celler / ml med sterilt PBS. Trække cellerne i en sprøjte udstyret med en # 26 gauge nål.
4. Placere en varmelampe i buret i recipientmus for at dilatere halevenen.
5. Ved hjælp af en mus indehaver halen af ​​musen strækker sig gennem slidsen i holderen. Træk for at udvide halen. Finde venen.
6. Injicere 0,2 ml / mus af cellesuspensionen, svarende 5 x 10 ⁷ celler.

5. Antigenudfordring af recipientmusene 20 dage efter Cell overførsel og udvikling af sygdomssymptomer

1. Challenge recipientmus ikke viser tegn på sygdom med antigenet. Procedurerne er de samme som afsnit 2 om "Immunisering af donormus".
2. Observere udvikling af paralytisk sygdom 7 til 10 dage efter antigenisk udfordring.
   1. Sygdommen starter med svaghed i halen. Sygdommen er klassificeret som ennår halen bliver slap. Sygdom er klassificeret som 2, når musen er lammet i den ene bagben. Sygdom er kåret 3, når begge bagben er lammet og musen trækker begge bagben, når kravler fremad. Sygdom er kåret 4, når musen mister brugen af ​​begge forbens, at overlade musen helt immobile. Sygdom er kåret 5, når musen er døende, og kroppen krøller op. Død scores som sygdommen klasse 6 ^4.
3. MBP-specifikke EAE induceret i C57BL / 6 mus efter denne protokol er monofaset. Musene kan komme fra sygdom, men ikke har undergået spontane tilbagefald.

6. Repræsentative resultater

Mus, der modtog primet og in vitro-ekspanderede donor lymfeknudeceller ikke udvikler EAE sygdomssymptomer, som afspejler deres modstandsdygtighed over for sygdomsinduktion. Imidlertid svær sygdom udvikles efter antigen-challenge (tabel I), hvilket viser evnen hos antigenudfordringat vende resistensmekanismen. To særlige træk ved den antigene bemærkes udfordringen er de doser af antigen og kinetikken for udfordring for at inducere sygdom. Meget lav dosis af antigen er nødvendig som vist i tabel III. Overraskende kunne mus, der modtog donorceller et år tidligere stadig udvikle alvorlig sygdom ved udsættelse for antigen (tabel IV). Disse to observationer tyder stærkt inddragelse af "langlivede" T-celler i at opretholde EAE modstand. Denne protokol gælder for mange EAE resistente musestammer ^4.

Figur 1. Rutediagram det eksperimentelle design til induktion af EAE i ansete resistente musestammer.

Tabel I. Induktion af MBP-medieret EAE i C57BL / 6 mus. Adoptiv overførsel af primede og in vitro-ekspanderede donorceller ikke inducerer EAE i C57BL / 6 mus. Antigenudfordring efter celleoverførsel gjort musene modtagelige for sygdomsinduktion. Av., Gennemsnit. ND, ikke gjort.

Tabel II. Specificitet af antigenisk udfordring. Recipientmus blev udfordret med inducerende antigen såvel som andre irrelevante antigener. Kun inducerende antigen inducerede alvorlige sygdomme. OVA: kyllingeovalbumin. Av., Gennemsnit.

Tabel III. Udfordrende antigen doser kræves for sygdomsinduktion. Forskellige koncentrationer af MBP anvendes til at udfordre recipientmus blev testet. Av., Gennemsnit.

Tabel IV. Kinetik af antigenisk udfordring. Modtager mus blev udfordret på forskellige tidspunkt indlæg vedtageive celleoverførsel. Av., Gennemsnit.

Undersøgelser af EAE i mus ofte benytte neuroantigens, basisk myelinprotein (MBP), proteolipidprotein (PLP) eller myelin oligodendrocyt protein (MOG). Tidligere undersøgelser anvendes oftest MBP. PLP stimulerer stærke og konsekvente svar fra SJL mus. For nylig, MOG er almindeligt anvendte neuroantigen fordi B6 mus er følsomme for sygdomsinduktion med dette antigen. Mange af genet målrettede musestammer er på B6 genetisk baggrund. Interessant B6 mus er modtagelige for EAE-induktion med MOG men er resistente over for sygdomsinduktion med MBP.

Meget af den tidligere indsats i at belyse de mekanismer EAE centreret om induktion mekanismer af sygdom virkningerne af cytokin produktion og inddrivelse medieret af regulatoriske T-celler ^5-7. Hvor anerkendte EAE resistente mus kan nedbryde induktionen af ​​sygdommen, på den anden side var ikke blevet bredt undersøgt. Dette kan skyldes vanskeligheden ved at kvantificere unresponsiveness. Arnon ⁸ i 1981 først viste, at behandling B6 mus med cyclophosphamid gjort disse mus er modtagelige for EAE induceret med MBP. Andre viste, at behandling med anti-y-interferon også med held induceret sygdom B6 og Balb / c-mus ^9,10. Det bør bemærkes, at disse undersøgelser alle påtænkes ikke-antigenspecifikke markører. På den anden side fokuserer protokollen beskrevet her på et andet aspekt af EAE modstand. Her er det kun specifikt antigen anvendes i udfordringen kan overvinde EAE passivitet og tillader induktion af sygdommen. Denne protokol omfatter både EAE modstand fase med adoptiv overføring af primede donor-T-celler og modtagelighed fase med antigenisk udfordring (tabel I). Eksperimenter kan være udformet til at undersøge de iboende faktorer, som opretholder EAE resistens såvel som faktorer, der vende denne non-responsivitet. Indledningsvis blev det vist, at EAE resistente mus var i stand til at montere autoimmune responser, når immuniseretmed MBP ^4. Senere blev det påvist, at encephalitogene T-celler fandtes i disse mus ^2. Nogle nylige undersøgelser ^11,12 viste, at behandling af B10.S mus med anti-CD25-antistoffer før immunisering af musene med proteolipid protein (PLP) omdannet musene fra resistente over for modtagelige, hvilket indebærer rolle regulatoriske T-celler (tregs) i opretholdelse EAE modstand. Dette er imidlertid ikke tilfældet, når C57BL / 6 mus behandlet på lignende måde og er immuniseret med MBP ^13. De fleste af musene stadig ikke reagerer. Således kan EAE modstand være multi-faktoriel. Det postuleres, at i tilfælde af C57BL / 6 mus responderede på MBP har thymisk udvælgelse udgår fleste MBP-reaktive T-celler, således at frekvensen af ​​MBP-reaktive T-celler i periferien er meget lave. Denne under-tærskel lav frekvens ville gøre musene ikke er i stand til at reagere på immunisering med MBP. Udfordringen dosis gennem ukendte mekanismer, er i stand til at overvinde frekvens spørgsmål og mount en autoimmun respons. Yderligere undersøgelser af de mulige mekanismer omfatter rolle af IL-6 ¹² under antigenisk udfordring i at påvirke følsomheden af encephalitogene til inhibering af tregs.