Overvinne manglende respons i Eksperimentelle Autoimmune encefalomyelitt (EAE) Resistente musestammer av adoptivforeldre Transfer og antigen Challenge

1. Forbereder CFA-emulgert Antigen

1. Løs marsvin MBP (utarbeidet etter den metoden for Swanborg1 og lagret i lyofilisert skjema ved 4 ° C) i fosfatbuffer løsning (PBS) i en konsentrasjon på 2 mg / ml. Hvis syntetiserte MBP peptider (MBP _60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) ² benyttes, utarbeide en 2 mg / ml. Tegn opp en passende mengde antigen løsning (0,1 ml per mus som skal vaksineres) i et glass sprøyte med Luer-Lok.
2. Tegn opp et volum på komplett Freund s adjuvans H37Ra (0.1WT%) (CFA, Difco Laboratories) lik antigenet løsningen inn i en annen glassprøyte utstyrt med Luer-Lok.
3. Koble de to glass sprøyter med en tre-veis stoppekran. Bland MBP løsningen med CFA ved å skyve stempler frem og tilbake. Hold bevegelse til en emulsjon dannes.
4. For å teste om en emulsjon dannes, skyver alt av røren i en sprøyte. Koble den tomme sprøyten, trekk than stempelet litt tilbake og lade en dråpe av gjenværende emulsjon i et beger av rent vann ved romtemperatur. Dersom emulsjonen dråpe forblir intakt på overflaten av vannet, er en emulsjon dannet. Hvis emulsjon dråpe disperses, koble til sprøyter og fortsette miksing bevegelse.
5. Bruk en 1 ml plast sprøyte for immunisering prosessen for å sikre levering av en nøyaktig dose av antigen. Slik overfører antigenet emulsjon til plastsprøyte, trekk ut stempelet og sett den tomme plastsprøyte inn i åpningen på tre-veis kran der foregående glassprøyte ble frakoblet som i 1.4.
6. Fyll plastsprøyte til randen ved å skyve stempelet på glassprøyte. Sett stempelet på plastsprøyte tilbake og skyve tilbake overskytende emulsjon til å nå 1,2 ml merket på plastsprøyte. Denne manøveren forsikrer at ingen luftboble er fanget inne i plastsprøyte.
7. Fjern plasten sprøyten fra tre-veis stoppekran. Attach en 26 gauge kanyle til plastsprøyte. Skyv stempelet til 1 ml merket slik at emulsjonen nå fyller tomrommet volumet av nålen.

2. Immunisering av Donor Mus

Merk: Kvinnelige C57BL / 6 mus er vanligvis injisert med antigen emulsjon i fire steder i flankene, etter de metoder opprinnelig designet av McFarlin gruppe ³ ved National Institutes of Health. For en erfaren etterforsker, kan en person utføre hele oppgaven. For nybegynnere kan hjelpen være ønsket, slik at en person holder musen og den andre personen gjør injeksjonen. Alternativt kan du bruke musen være bedøvet for injeksjon.

1. Hold musen godt i nakken huden og holder tilbake halen mellom ^4. og 5 ^th fingre slik at brystkasse og buk er lett tilgjengelig.
2. Plasser sprøytespissen på den 1 ml plastsprøyte på et område i brystkassen litt over høyre armhulen (av mobruk) og injisere 0,05 mL av antigen emulsjon subkutant. En liten bule av hvitaktig CFA kan sees gjennom den bleke huden. Gjenta det samme for området i thorax litt over venstre armhulen.
3. Slipp halen og ta tak i den høyre foten (av musen), snu den og holder den mellom den ^{4. og} 5. fingre. Finn området rett nedenfor ribbein saken i høyre flanke og injisere 0,05 mL av antigen emulsjon.
4. Slipp den høyre foten, snu musen den andre veien og hold venstre fot (av musen) mellom ^4. og ^5. fingre. Finn området rett nedenfor ribbein saken i venstre flanke og injisere 0,05 mL av antigen emulsjon.
5. Bytt til en frisk nålen etter injeksjon av 10 mus, eller hvis nålen blir sløvet.

3. Isolering av lymfeknute Cells for Tissue Culture 7 til 10 dager etter immunisering

1. Syv til 10 dager etter vaksinering, ofre museneog fjerne drenering lymfeknuter. Den foretrukne metoden for aktiv dødshjelp er ved CO ₂ innånding. Etter offer, lå musen på ryggen på en disseksjon bord med lemmene strukket ut og festet til styret med pinner. Musene er fuktet med en spray av 70% etanol.
2. Skjær et snitt i huden lengderetningen i midten fra den nedre enden av magen opp til haken med steril saks og pinsetter.
3. Klipp magen hud fra området av lysken ned til hver etappe. Skrell tilbake og peke ut huden, utsette det inguinale lymfeknuter.
4. Skjær skinnet langs forbein (venstre og høyre), slik at huden kan skrelles tilbake og låste ned for å avsløre axillaris lymfeknuter i nærheten armhulene.
5. Med to par tang som arbeider sammen, dra vekk bindevev dekker og rundt inguinal lymfeknuter. Når bindevev er fjernet, plasserer en pinsett under lymfeknute og trekk vekk fra kroppen. Plasserlymfeknuter i et 35 mm petriskål fylt med steril PBS.
6. Trekk bort bindevev som dekker de to axillaris lymfeknuter med to par tang. Isoler lymfeknuter og plassere dem i petriskål. Vær veldig forsiktig for ikke å bryte blodårene som krysser området som blødning gjør identifisere lymfeknuter svært vanskelig.
7. Etter at alle lymfeknutene er samlet inn, flytte petriskål til en biosikkerhet hette. Break og erte lymfeknutene hverandre med de to parene av tang, sliping mot hverandre. Alternativt kan lymfeknutene deles opp ved hjelp av den flate enden av stempelet av en 3 ml plastsprøyte trykke mot lymfeknutene på bunnen av petriskål.
8. Før ertet lymfeknute cellesuspensjon gjennom en nylon mesh for å fjerne membraner og rusk.
9. Sminke lymfeknute cellesuspensjonen til 50 ml med steril PBS. Sentrifuger ved 1000 rpm i 10 minutter. Resuspender kulen i kulturen medium. Gjør et levedyktig cell telle og justere konsentrasjonen til 4 x 10 ⁶ celler / ml. UseRPMI 1640 supplert med 10% kalvefoster serum, 2 mm L-glutamin, 1 mm MEM natrium pyruvat, 0,1 mm MEM ikke-essensielle aminosyrer, 100 U / ml penicillin, 100 mikrogram / ml streptomycin, 10 mM Hepes buffer og 5 x 10 ^-5 M 2-ME. Forvarm kulturen før resuspending cellene.
10. Kultur cellene i 24-og kultur plater med 2 ml volum per brønn (endelig cellekonsentrasjonen 8 x 10 ⁶ celler / brønn). Legg antigen til hver brønn ved en endelig konsentrasjon på 100 mikrogram / ml. Plasser kulturen plate i en 37 ° C inkubator med 5% CO _2. Inkuber cellene i 5 dager.

4. Høsting Kulturperler lymfeknute Cells 5 dager etter oppstart av kulturer

1. Bland cellene i hver brønn ved pipettering opp og ned med en Pasteur glass pipette eller en liten volum pipette. Høste cellene til en 50 ml sentrifugerør.
2. Sentrifuger cellene ved 1000 rpm i 10 minutter. ResusPend cellen pellet inn i et lite volum av PBS.
3. Telle celler og justere levedyktig cellekonsentrasjonen til 2,5 x 10 ⁸ celler / ml med sterilt PBS. Tegn cellene i en sprøyte utstyrt med en 26 gauge nål.
4. Plasser en varmelampe over buret til mottaker mus å hjelpe strekke halen blodåre.
5. Bruke en mus holder, forlenge halen av musa gjennom sprekken i holderen. Trekk å forlenge halen. Finn venen.
6. Injiser 0,2 ml / mus av cellesuspensjon, tilsvarende 5 x 10 ⁷ celler.

5. Antigene utfordring Mottaker Mus 20 dager Post Cell Transfer og utvikling av sykdom Symptomer

1. Challenge mottakerlandene mus ikke viser tegn på sykdom med antigenet. Prosedyrene er de samme som § 2 om "Immunisering av donor Mus".
2. Observer utvikling av paralytisk sykdom 7 til 10 dager etter antigen utfordring.
   1. Sykdom begynner med svakhet i halen. Sykdom er gradert som ennår halen blir slapp. Sykdom er gradert som 2 når musen er lammet i en hind lem. Sykdom er gradert 3 når begge baklemmene er lammet og musen drar begge baklemmene når krypende frem. Sykdom er gradert 4 når musen mister bruken av begge forbein la muspekeren helt immobile. Sykdom er gradert 5 når musen er døende og kroppen krøller seg. Døden er scoret som sykdom grad 6 ^4.
3. MBP-spesifikke EAE indusert i C57BL / 6 mus etter denne protokollen er monofasisk. Musene kan komme seg fra sykdommen, men ikke gjennomgår spontane tilbakefall.

6. Representative Resultater

Mus som fikk primet og in vitro-utvidede donor lymfeknute cellene ikke utvikler EAE sykdomssymptomer, noe som reflekterer deres motstand mot sykdom induksjon. Men, alvorlig sykdom utviklet etter antigene utfordring (tabell I), demonstrere evne til antigen utfordringeni å snu motstanden mekanisme. To spesielle funksjoner i antigene utfordringen bemerket er de doser av antigen og kinetikken utfordring å indusere sykdom. Svært lav dose av antigen er nødvendig som vist i tabell III. Overraskende, kunne musene som fikk donor cellene et år tidligere fremdeles utvikle alvorlig sykdom når utfordret med antigen (Tabell IV). Disse to observasjonene sterkeste involvering av "langlivede" T-cellene i å opprettholde EAE motstand. Denne protokollen gjelder for mange EAE resistente musestammer ^4.

Figur 1. Flow diagram av den eksperimentelle design for induksjon av EAE i velrenommerte resistente musestammer.

Tabell jeg. Induksjon av MBP-mediert EAE i C57BL / 6 mus. Adoptiv overføring av primet og in vitro-utvidede donor cellene induserte ikke EAE i C57Bl / 6 mus. Antigene utfordring innlegg celle overføring gjengitt musene mottagelige for sykdom induksjon. Av., Gjennomsnitt. ND, ikke gjort.

Tabell II. Spesifisitet av antigen utfordring. Mottaker mus ble utfordret med grunning antigenet samt andre irrelevante antigener. Bare grunning antigenet indusert alvorlig sykdom. OVA: kylling ovalbumin. Av., Gjennomsnitt.

Tabell III. Challenge antigen doser kreves for sykdom induksjon. Ulike konsentrasjoner av MBP som brukes til å utfordre mottakerens mus ble testet. Av., Gjennomsnitt.

Tabell IV. Kinetics av antigen utfordring. Mottaker mus ble utfordret på ulike tidspunkt innlegg vedtaive celle overføring. Av., Gjennomsnitt.

Studier av EAE hos mus utnytter ofte de neuroantigens og myelin basic protein (MBP), proteolipid protein (PLP) eller myelin oligodendrocyte protein (Mog). Tidligere studier meste brukt MBP. PLP stimulerer sterke og konsistente svar fra SJL mus. Flere nylig, er Mog felles neuroantigen brukt fordi B6 mus er mottakelige for sykdom induksjon med dette antigenet. Mange av genet målrettede musestammer er på B6 genetisk bakgrunn. Interessant, B6 mus er utsatt for EAE induksjon med Mog men er motstandsdyktig mot sykdom induksjon med MBP.

Mye av den tidligere innsats i å forklare mekanismene for EAE sentrert på induksjon mekanismer for sykdom, effekt av cytokin produksjon og utvinning mediert av regulatoriske T-celler ^5-7. Hvor kjent EAE resistente mus kan undergrave induksjon av sykdommen, derimot, hadde ikke vært mye undersøkt. Dette kan skyldes vanskelighetene med å kvantifisere unresponsiveness. Arnon ⁸ i 1981 første viste at behandling B6 mus med cyklofosfamid gjengitt disse musene mottakelige for EAE indusert med MBP. Andre viste at behandling med anti-gamma-interferon også lykkes indusert sykdom i B6 og BALB / c mus ^9,10. Det bør bemerkes at disse studiene all målrettet ikke-antigen spesifikke markører. På den annen side, fokuserer protokollen beskrevet her på et annet aspekt av EAE motstand. Her bare spesifikt antigen som brukes i den utfordringen kan overvinne EAE å fungere bedre og gir induksjon av sykdom. Denne protokollen omfatter både EAE motstand fasen med adoptivfamilien overføring av primet donor T-celler og mottakelighet fasen med antigene utfordring (Tabell I). Eksperimenter kan utformes for å studere de vesentlige faktorer som opprettholder EAE motstand samt faktorer som reverserer denne manglende respons. Opprinnelig ble det vist at EAE resistente mus klarte å montere autoimmune reaksjoner når vaksineresmed MBP ^fire. Senere ble det vist at encephalitogenic T-celler eksisterte i disse musene ^2. Noen nyere studier ^11,12 viste at behandling av B10.S mus med anti-CD25-antistoffer før immunisering av mus til proteolipid protein (PLP) konvertert musene fra motstandsdyktig mot utsatt, noe som tyder rollen av regulatoriske T-celler (Tregs) i opprettholde EAE motstand. Men dette er ikke tilfelle når C57BL / 6 mus er tilsvarende behandlet og vaksinert med MBP ^13. De fleste mus fortsatt ikke svarer. Dermed kan EAE motstand være multi-faktoriell. Det er postulert at i tilfelle av C57BL / 6 mus reagerer på MBP, har thymic utvalg slettet de fleste MBP-reaktivt T-celler slik at frekvensene av MBP-reaktive T-celler i periferien er svært lave. Dette under-terskelen lav frekvens ville gjengi musene ikke i stand til å svare på immunisering med MBP. Utfordringen dose, gjennom ukjente mekanismer, er i stand til å overvinne den frekvensen problemet og mount en autoimmun reaksjon. Videre undersøkelser av mulige mekanismer vil inkludere rollen IL-6 ¹² under antigene utfordring i å påvirke mottakelighet for encephalitogenic til hemming av Tregs.