Superar la falta de respuesta en encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) cepas de ratones resistentes a través de transferencia adoptiva y la estimulación antigénica

1. Preparación CFA-antígeno emulsionado

1. Disolver cobaya MBP (preparado de acuerdo con el método de Swanborg1 y se almacena en forma liofilizada a 4 ° C) en solución tampón de fosfato (PBS) a una concentración de 2 mg / ml. Si sintetizados péptidos MBP (MBP _60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) ² se utilizan, preparar una solución de 2 mg / ml. Elaborar una cantidad apropiada de solución de antígeno (0,1 ml por ratón para ser vacunados) en una jeringa de vidrio con luer-lok.
2. Elaboración de un volumen de adyuvante completo de Freund H37Ra (0.1WT%) (CFA, Difco Laboratories) igual a la solución de antígeno en otra jeringa de vidrio equipado con Luer-lok.
3. Conecte los dos jeringas de vidrio con una llave de tres vías. Mezclar la solución con el Comité de Libertad Sindical MBP empujando los émbolos de ida y vuelta. Mantener el movimiento hasta que se forma una emulsión.
4. Para probar si se forma una emulsión, empujar toda la mezcla en una jeringa. Desconecte la jeringa vacía, tire tque el émbolo hacia atrás un poco y descargue una gota de la emulsión residual en un vaso de agua limpia a temperatura ambiente. Si la caída de emulsión permanece intacto en la superficie del agua, se forma una emulsión. Si la caída de la emulsión se dispersa, vuelva a conectar las jeringas y seguir el movimiento de mezcla.
5. Utilizar una jeringa de plástico de 1 ml para el proceso de inmunización para asegurar la entrega de una dosis exacta de antígeno. Para transferir la emulsión de antígeno a la jeringa de plástico, saque el émbolo e inserte la jeringa de plástico vacía en la apertura de llave de tres vías donde se desconecta la jeringa de vidrio anterior como en el punto 1.4.
6. Llenar la jeringa de plástico a la llanta, empujando el émbolo de la jeringa de vidrio. Insertar el émbolo de la jeringa de plástico hacia atrás y empujar hacia atrás el exceso de emulsión hasta alcanzar la marca de 1,2 ml en la jeringa de plástico. Esta maniobra asegura que ninguna burbuja de aire está atrapado dentro de la jeringa de plástico.
7. Retirar la jeringa de plástico de la llave de tres vías. Attach una aguja de calibre # 26 a la jeringa de plástico. Empuje el émbolo hasta la marca de 1 ml de modo que la emulsión ahora llena el volumen vacío de la aguja.

2. La inmunización de ratones donantes

Nota: Los ratones hembra C57BL / 6 se suele inyectar una emulsión de antígeno en cuatro sitios en los flancos, siguiendo los métodos diseñados originalmente por el grupo de McFarlin de ^tres de los Institutos Nacionales de Salud. Para un investigador experimentado, una persona puede realizar toda la tarea. Para los principiantes, la ayuda puede ser solicitada para que una persona tiene el ratón y la otra persona hace de la inyección. Por otra parte, el ratón puede ser anestesiados para la inyección.

1. Sostenga firmemente el ratón por la piel del cuello y contener la cola entre los dedos 4 ^º y 5 ^º de tal manera que el tórax y el abdomen son de fácil acceso.
2. Colocar la aguja de la jeringa de plástico 1 ml en un sitio en el tórax ligeramente por encima de la axila derecha (de la MOutilizar) e inyectar 0,05 ml de la emulsión de antígeno por vía subcutánea. Una protuberancia poco del blanquecino CFA puede ser visto a través de la piel pálida. Repetir lo mismo para el sitio en el tórax ligeramente por encima de la axila izquierda.
3. Suelte la cola y agarrar el pie derecho (del ratón), enciéndalo y sostenerlo entre el 4 ^º y 5 ^º dedos. Busque el sitio justo debajo de la caja torácica en el lado derecho e inyectar 0,05 ml de la emulsión de antígeno.
4. Suelte el pie derecho, gire el ratón hacia otro lado y mantener el pie izquierdo (del ratón) entre ^los días 4 y 5 ^º dedos. Localizar el sitio justo debajo de la costilla caso en el flanco izquierdo e inyectar 0,05 ml de la emulsión de antígeno.
5. Cambie a una aguja nueva después de la inyección de 10 ratones, o entorpecido si la aguja se hace.

3. Aislamiento de células de nódulos linfáticos de Cultivo de Tejidos de 7 a 10 días después de la inmunización

1. Siete a 10 días después de la inmunización, el sacrificio de los ratonesy extraer los ganglios linfáticos de drenaje. El método preferido de la eutanasia es por inhalación de CO _2. Después del sacrificio, coloque el cursor sobre su espalda en una tabla de disección con las extremidades estiradas y se fija a la placa con alfileres. Los ratones se humedecen con una pulverización de 70% de etanol.
2. Cortar una hendidura en la piel longitudinalmente en el centro desde el extremo inferior del abdomen hasta la barbilla con tijeras y pinzas estériles.
3. Cortar la piel del abdomen de la zona de la ingle hasta cada pierna. Despegue y precisar la piel, la exposición de los ganglios linfáticos inguinales.
4. Cortar la piel a lo largo de la patas delanteras (izquierda y derecha) para que la piel se puede pelar la espalda y clavado hacia abajo para mostrar los ganglios linfáticos de la axila cerca de las axilas.
5. Con dos pares de pinzas que trabajan juntos, alejarse de los tejidos conectivos que cubren y alrededor de los ganglios linfáticos inguinales. Cuando los tejidos conectivos se borran, coloque un par de pinzas en el ganglio linfático y se alejan del cuerpo. Coloque elganglios linfáticos en un plato de Petri de 35 mm lleno de PBS estéril.
6. Extraiga los tejidos conectivos que cubren los dos ganglios linfáticos axilares con dos pares de pinzas. Aislar los ganglios linfáticos y colocarlos en la placa de Petri. Tenga mucho cuidado de no romper los vasos sanguíneos que cruzan la zona como el sangrado facilita la identificación de los ganglios linfáticos muy difícil.
7. Después de todos los ganglios linfáticos se recogen, mover la placa de Petri con una campana de seguridad biológica. Romper y se burlan de los ganglios linfáticos aparte con los dos pares de pinzas, moler uno contra el otro. Alternativamente, los ganglios linfáticos puede ser roto mediante el extremo plano del émbolo de una jeringa de plástico de 3 ml presionando contra los ganglios linfáticos en la parte inferior de la placa de Petri.
8. Pase el nodo linfático bromeó suspensión celular a través de una malla de nylon para eliminar las membranas y escombros.
9. Completar el ganglio linfático suspensión de células a 50 ml con PBS estéril. Centrifugar a 1000 rpm durante 10 minutos. Resuspender el precipitado en medio de cultivo. ¿Es viable cell contar y ajustar la concentración de 4 x 10 ⁶ células / ml. UseRPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal de ternero, 2 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato sódico MEM, 0,1 mM MEM no esenciales aminoácidos, 100 penicilina U / ml, estreptomicina 100 mg / ml, 10 mM de tampón Hepes y x 5 10 ^-5 M 2-ME. Pre-caliente la cultura antes de resuspender las células.
10. Cultivar las células en placas de cultivo de 24 pocillos con un volumen de 2 ml por pocillo (concentración final de células 8 x 10 ⁶ células / pocillo). Añadir antígeno a cada pocillo a una concentración final de 100 g / mL. Coloque la placa de cultivo en una incubadora a 37 ° C con 5% de CO _2. Se incuban las células durante 5 días.

4. La recolección cultivadas células de nódulos linfáticos 5 días después del inicio de las Culturas

1. Mezclar las células en cada pocillo pipeteando arriba y hacia abajo con una pipeta Pasteur de vidrio o una pipeta pequeño volumen. Recoger las células a un tubo de centrífuga de 50 ml.
2. Centrifugar las células a 1000 rpm durante 10 minutos. Resuspenden el sedimento celular en un pequeño volumen de PBS.
3. Contar las células y ajustar la concentración de células viables a 2,5 x 10 ⁸ células / ml con PBS estéril. Dibujar las células en una jeringa provista de una aguja de calibre # 26.
4. Coloque una lámpara de calor sobre la jaula de los ratones receptores para ayudar a dilatar la vena de la cola.
5. El uso de un soporte de ratón, extender la cola del ratón a través de la hendidura en el soporte. Tire para extender la cola. Localice la vena.
6. Inyectar 0,2 ml / ratón de la suspensión celular, igualando 5 x 10 ⁷ células.

5. Antigénica desafío de los ratones receptores de la célula 20 días después de la transferencia y el desarrollo de los síntomas de la enfermedad

1. Los ratones receptores Challenge que no presentan signos de la enfermedad con el antígeno. Los procedimientos son los mismos que en el apartado 2 sobre "La inmunización de ratones donantes".
2. Observar el desarrollo de la enfermedad paralítica 7 a 10 días después del desafío antigénico.
   1. Enfermedad comienza con debilidad en la cola. La enfermedad se clasifica como unacuando la cola se vuelve flácido. La enfermedad se clasifica como 2 cuando el ratón está paralizado en una pata trasera. La enfermedad se clasifica 3 cuando ambos miembros posteriores están paralizadas y el ratón arrastra los dos miembros posteriores al rastrear hacia adelante. La enfermedad se clasifica 4 cuando el ratón pierde uso de ambas extremidades anteriores, dejando el ratón totalmente inmóvil. La enfermedad se clasifica 5 cuando el ratón está moribundo y el cuerpo se curva hacia arriba. La muerte se califica como enfermedad de grado 6 ^4.
3. MBP-específica EAE inducida en ratones C57BL / 6 después de este protocolo es monofásica. Los ratones pueden recuperarse de la enfermedad, pero no someterse a las recaídas espontáneas.

6. Los resultados representativos

Los ratones que recibieron cebado e in vitro-expandidas células de los ganglios linfáticos de los donantes no desarrollaron síntomas de EAE enfermedades, reflejando su resistencia a la inducción de la enfermedad. Sin embargo, la enfermedad grave desarrollado después del desafío antigénico (Tabla I), demostrando la capacidad de la estimulación antigénicaen revertir el mecanismo de resistencia. Dos características especiales de la estimulación antigénica señalar son las dosis de antígeno y la cinética de reto para provocar la enfermedad. Dosis muy baja de antígeno que se necesita, como se muestra en la Tabla III. Sorprendentemente, los ratones que recibieron células de donantes del año anterior puede todavía desarrollar una enfermedad grave cuando fueron estimulados con el antígeno (Tabla IV). Estas dos observaciones sugieren fuertemente la participación de "larga vida" las células T en el mantenimiento de la resistencia a la EAE. Este protocolo es aplicable a muchas cepas de ratones resistentes a la EAE ^4.

Figura 1. Diagrama de flujo del diseño experimental para la inducción de la EAE en prestigiosas cepas de ratones resistentes.

Tabla I. La inducción de MBP-mediada por la EAE en ratones C57BL / 6. La transferencia adoptiva de la EAE preparada y en las células del donante in vitro, la ampliación no inducir en ratones C57BL / 6. Desafío antigénico después de la transferencia de células prestados los ratones susceptibles a la inducción de la enfermedad. Av.., Promedio. ND, no hacer.

Tabla II. La especificidad de una estimulación antigénica. Los ratones receptores fueron desafiados con el antígeno de cebado, así como otros antígenos irrelevantes. Sólo el antígeno cebado inducido enfermedad grave. OVA: ovoalbúmina de pollo. Av.., Promedio.

Tabla III. Dosis de antígeno Challenge necesaria para la inducción enfermedad. Varias concentraciones de MBP se utilizan para desafiar a los ratones receptores fueron probados. Av.., Promedio.

Tabla IV. Cinética de la estimulación antigénica. Los ratones receptores fueron impugnadas en el puesto de varios punto de momento, adoptarive la transferencia de células. Av.., Promedio.

Los estudios de la EAE en ratones a menudo utilizan los neuroantigens, la proteína básica de mielina (MBP), proteína proteolipídica (PLP) o las proteínas de mielina de oligodendrocitos (MOG). Estudios anteriores utilizan sobre todo MBP. PLP estimula respuestas fuertes y consistentes de los ratones SJL. Más recientemente, MOG es el neuroantigen común usado porque ratones B6 son susceptibles a la inducción de la enfermedad con este antígeno. Muchas de las cepas de ratón de genes específicos están en el fondo B6 genética. Interesantemente, los ratones B6 son susceptibles a la EAE inducción con MOG pero son resistentes a la inducción de la enfermedad con MBP.

Gran parte del esfuerzo anterior en elucidar los mecanismos de la EAE se centraron en los mecanismos de inducción de la enfermedad, los efectos de la producción de citocinas y la mediada por la recuperación de las células T reguladoras ^7.5. Cómo reputadas ratones resistentes EAE puede subvertir la inducción de la enfermedad, por otro lado, no había sido ampliamente investigada. Esto puede ser debido a la dificultad de cuantificar unresponsiveness. Arnon ⁸ en 1981 mostró por primera vez que el tratamiento de ratones B6 con ciclofosfamida prestados estos ratones susceptibles a la EAE inducida con MBP. Otros demostraron que el tratamiento con anticuerpos anti-interferón gamma también con éxito indujo la enfermedad en B6 y ratones Balb / c ^9,10. Cabe señalar que todos estos estudios dirigidos antígeno no-marcadores específicos. Por otro lado, el protocolo descrito aquí se centra en un aspecto diferente de la resistencia a la EAE. Aquí sólo antígeno específico utilizado en el desafío puede superar la falta de respuesta EAE y permite la inducción de la enfermedad. Este protocolo incluye tanto la fase de la EAE con resistencia transferencia adoptiva de células T del donante imprimadas y la fase de susceptibilidad con desafío antigénico (Tabla I). Los experimentos pueden ser diseñados para estudiar los factores intrínsecos que mantienen la resistencia a la EAE, así como los factores que revertir esta falta de respuesta. Inicialmente, se demostró que EAE ratones resistentes fueron capaces de montar las respuestas autoinmunes cuando inmunizadoscon MBP ^4. Posteriormente, se demostró que las células T encefalitógenas existido en estos ratones ^2. Algunos estudios recientes ^11,12 demostraron que el tratamiento de ratones B10.S con anticuerpos anti-CD25 antes de la inmunización de los ratones con la proteína proteolipídica (PLP) convierte a los ratones de resistentes a susceptibles, lo que implica la función de células T reguladoras (Tregs) en mantener la resistencia de EAE. Sin embargo, este no es el caso cuando los ratones C57BL / 6 están igualmente tratado y inmunizados con MBP ^13. La mayoría de los ratones permanecer insensible. Por lo tanto, la resistencia a la EAE puede ser multi-factorial. Se postula que, en el caso de ratones C57BL / 6 que respondieron a MBP, la selección tímica ha eliminado la mayoría de MBP-reactivas células T tales que las frecuencias de las células T MBP-reactivas en la periferia son muy bajos. Esta frecuencia por debajo del umbral de baja haría que los ratones no son capaces de responder a la inmunización con MBP. La dosis de reto, a través de mecanismos desconocidos, es capaz de superar el problema de frecuencia y muente una respuesta autoinmune. Otras investigaciones de los posibles mecanismos que incluyen el papel de la IL-6 ¹² durante el desafío antigénico en que afecta a la susceptibilidad de encefalitogénico a la inhibición de células T reguladoras.