Superare blocco nel encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) ceppi di topi resistenti dal trasferimento adottivo e uno stimolo antigenico

1. Preparazione CFA-emulsionato Antigen

1. Sciogliere cavia MBP (preparato secondo il metodo di Swanborg1 e conservate in forma liofilizzata a 4 ° C) in tampone fosfato (PBS) ad una concentrazione di 2 mg / mL. Se peptidi sintetizzati MBP (MBP _60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) ² vengono utilizzati, preparare un 2 mg / mL di soluzione. Redigere una quantità appropriata di soluzione antigene (0.1 mL per mouse per essere immunizzati) in una siringa di vetro con luer-lok.
2. Disegnare un volume di adiuvante completo di Freund H37Ra (0.1WT%) (CFA, Difco Laboratories) pari alla soluzione di antigene in un'altra siringa di vetro munito Luer-Lok.
3. Collegare i due siringhe di vetro con una valvola a tre vie. Miscelare la soluzione MBP con il CFA spingendo gli stantuffi e indietro. Mantenere il movimento fino a quando si forma un'emulsione.
4. Per testare se si forma un'emulsione, spingere tutta la miscela in una siringa. Staccare la siringa vuota, tirare tegli stantuffo un po 'e scaricare una goccia di residuo emulsione in un bicchiere di acqua a temperatura ambiente. Se la caduta di emulsione rimane intatto sulla superficie dell'acqua, si forma un'emulsione. Se la caduta di emulsione disperde, ricollegare le siringhe e continuare il movimento di miscelazione.
5. Utilizzare una siringa di plastica 1 mL per il processo di immunizzazione per garantire la fornitura di una dose precisa di antigene. Per trasferire l'emulsione antigene alla siringa plastica, estrarre ed inserire lo stantuffo della siringa vuota plastica nell'apertura della valvola a tre vie in cui è stato scollegato la siringa di vetro precedente come in 1,4.
6. Riempire la siringa di plastica al bordo premendo lo stantuffo della siringa di vetro. Inserire lo stantuffo della siringa di plastica e spingere indietro emulsione in eccesso fino a raggiungere il 1,2 mL segno sulla siringa di plastica. Questa manovra assicura che nessuna bolla d'aria intrappolata all'interno della siringa plastica.
7. Rimuovere la siringa plastica dalla valvola a tre vie. Atta# ch un ago calibro 26 alla siringa plastica. Premere lo stantuffo al contrassegno 1 mL modo che l'emulsione ora riempie il volume di vuoto dell'ago.

2. Immunizzazione dei topi donatori

Nota: topi femmina C57BL / 6 sono in genere iniettato con l'emulsione di antigene in quattro siti nei fianchi, secondo le modalità originariamente progettati dal gruppo di McFarlin a ³ presso i National Institutes of Health. Per un ricercatore esperto, una persona può svolgere il compito insieme. Per i principianti, l'aiuto può essere sollecitato in modo che una persona tiene il mouse e l'altra persona fa l'iniezione. In alternativa, il mouse può essere anestetizzati per l'iniezione.

1. Tenete il mouse saldamente la pelle del collo e trattenere la coda tra le dita ^° 4 ^° e 5 tali che il torace e l'addome sono facilmente accessibili.
2. Posizionare l'ago della siringa 1 ml di plastica in un sito nel torace leggermente sopra l'ascella destra (del mouso) e iniettare 0,05 ml di emulsione antigene sottocutanea. Un po 'di rigonfiamento biancastro CFA può essere visto attraverso la pelle pallida. Ripetere la stessa per il sito nel torace leggermente sopra l'ascella sinistra.
3. Rilasciare la coda e afferrare il piede destro (del mouse), girarla e tenerla tra il 4 ^° e 5 ^° dito. Individuare il sito appena sotto il caso costola nel fianco destro e iniettare 0,05 ml dell'emulsione antigene.
4. Rilasciare il piede destro, ruotare il mouse dall'altra parte e tenere premuto il piede sinistro (del mouse) tra il 4 ^° e 5 ^° dito. Individuare il sito appena sotto il caso costola nel fianco sinistro e iniettare 0,05 ml dell'emulsione antigene.
5. Cambiare un ago fresco dopo l'iniezione di 10 topi, o se l'ago diventa offuscato.

3. Isolamento di cellule dei linfonodi per il Tissue Culture 7 a 10 giorni dopo l'immunizzazione

1. Sette a 10 giorni dopo la vaccinazione, sacrificare i topie rimuovere i linfonodi drenanti. Il metodo preferito di eutanasia è di CO ₂ per inalazione. Dopo il sacrificio, giaceva il mouse sul dorso su una tavola di dissezione con le gambe aperte e fissato alla scheda con perni. I topi sono bagnate con uno spruzzo di etanolo 70%.
2. Tagli una fenditura nella pelle longitudinalmente al centro dall'estremità inferiore dell'addome fino al mento con forbici sterili e pinze.
3. Tagliare la pelle dell'addome dalla zona inguinale del basso per ogni gamba. Peel indietro e definire con precisione la pelle, esponendo i linfonodi inguinali.
4. Tagliare la pelle lungo il arti anteriori (sinistra e destra) in modo che la pelle può essere sfogliato indietro e immobilizzato per esporre i linfonodi ascellari vicino alle ascelle.
5. Con due paia di pinze lavorano insieme, tirare via il tessuto connettivo di copertura e intorno ai linfonodi inguinali. Quando i tessuti connettivi vengono cancellati, mettete un paio di pinze sotto il linfonodo e tirare fuori dal corpo. Posizionare illinfonodi in un piatto 35 millimetri Petri riempita con PBS sterile.
6. Sganciare i tessuti connettivi che coprono i due linfonodi ascellari con due paia di pinze. Isolare i linfonodi e metterli nella scatola di Petri. Fare molta attenzione a non rompere i vasi sanguigni che attraversano l'area come sanguinamento fa identificare i linfonodi molto difficile.
7. Dopo che tutti i linfonodi sono raccolti, spostare la piastra di Petri di una cappa di biosicurezza. Break e provocare gli linfonodi distanza con le due coppie di pinze, macinazione uno contro l'altro. In alternativa, i linfonodi può essere rotto mediante l'estremità piatta dello stantuffo di una siringa di plastica 3 mL premendo contro i linfonodi sul fondo del piatto Petri.
8. Passare il nodo preso in giro sospensione linfa cellulare attraverso una rete di nylon per rimuovere le membrane e detriti.
9. Portare il nodo della sospensione delle cellule linfatiche a 50 ml con PBS sterile. Centrifugare a 1000 rpm per 10 minuti. Risospendere il pellet in terreno di coltura. Sei una valida cell contare e regolare la concentrazione di 4 x 10 ⁶ cellule / mL. UseRPMI 1640 integrato con 10% siero fetale di vitello, 2 mM L-glutammina, 1 MEM mM piruvato di sodio, 0,1 mM MEM amminoacidi non essenziali, 100 U / ml penicillina, 100 pg / ml streptomicina, 10 mM di tampone Hepes e 5 x 10 ^-5 M 2-ME. Pre-riscaldare la cultura prima di risospendere le cellule.
10. Coltivare le cellule in piastre da 24 pozzetti di coltura con 2 mL di volume per pozzetto (concentrazione finale della cella 8 x 10 ⁶ cellule / pozzetto). Aggiungere antigene a ciascun pozzetto ad una concentrazione finale di 100 pg / mL. Posizionare la piastra di coltura in un incubatore a 37 ° C con 5% di CO _2. Incubare le cellule per 5 giorni.

4. Raccolta coltivate cellule dei linfonodi 5 giorni dopo l'inizio delle Culture

1. Mescolare le cellule in ciascun pozzetto pipettando su e giù con una pipetta Pasteur di vetro o una pipetta piccolo volume. Raccogliere le cellule ad una provetta da centrifuga da 50 mL.
2. Centrifugare le cellule a 1000 rpm per 10 minuti. Resuspend il pellet di cellule in un piccolo volume di PBS.
3. Contare le cellule e regolare la concentrazione di cellule vitali di 2,5 x 10 ⁸ cellule / ml con PBS sterile. Disegnare le cellule in una siringa con un ago # 26 gauge.
4. Posizionare una lampada di calore sopra la gabbia dei topi riceventi per dilatare la vena della coda.
5. Utilizzando un supporto per mouse, estendere la coda del topo attraverso la fessura nel supporto. Tirare per estendere la coda. Individuare la vena.
6. Iniettare 0,2 ml / topo della sospensione cellulare, pari a 5 x 10 ⁷ cellule.

5. Stimolo antigenico di topi riceventi 20 giorni cellulare vaglia postale e lo sviluppo dei sintomi della malattia

1. Sfida topi riceventi non mostra segni di malattia con l'antigene. Le procedure sono le stesse in sezione 2 "immunizzazione di topi donatori".
2. Osservare lo sviluppo di malattia paralitica da 7 a 10 giorni dopo uno stimolo antigenico.
   1. Malattia inizia con la debolezza nella coda. La malattia è classificato come 1quando la coda diventa flaccida. La malattia è classificata come 2 quando il mouse è paralizzato in un arto posteriore. La malattia è classificato 3 quando entrambi gli arti posteriori sono paralizzate e il mouse trascina entrambi gli arti posteriori durante la scansione in avanti. La malattia è classificato 4 quando il mouse perde uso di entrambe le arti anteriori, lasciando il mouse completamente immobile. La malattia è classificato 5 quando il mouse è moribonda e il corpo si raggomitola. La morte è valutata come la malattia di grado 6 ^4.
3. MBP-specifica EAE indotta in topi C57BL / 6 in seguito questo protocollo è monofasica. I topi possono recuperare dalla malattia, ma non subiscono ricadute spontanee.

6. Risultati rappresentativi

I topi che hanno ricevuto innescato ed espanse in vitro cellule linfatiche donatore nodo non ha sviluppato sintomi della malattia EAE, riflettendo la loro resistenza a induzione della malattia. Tuttavia, malattia grave sviluppato dopo stimolo antigenico (Tabella I), dimostrando la capacità della stimolazione antigenicainvertire il meccanismo di resistenza. Due le caratteristiche particolari della sfida antigenica nota sono le dosi di antigene e la cinetica della sfida di indurre la malattia. Dosi molto basse di antigene è necessario, come mostrato nella Tabella III. Sorprendentemente, i topi che avevano ricevuto cellule del donatore di un anno prima potrebbe ancora sviluppare una grave malattia quando provocati con l'antigene (Tabella IV). Queste due osservazioni suggeriscono il coinvolgimento di "lunga durata" cellule T nel mantenimento della resistenza EAE. Questo protocollo è applicabile a molti ceppi di topi EAE resistenti ^4.

Figura 1. Diagramma di flusso del disegno sperimentale per l'induzione di EAE in fama ceppi di topi resistenti.

Tabella I. Induzione di MBP-mediata EAE in topi C57BL / 6. Trasferimento adottivo di EAE e innescato espanse in vitro cellule donatrici non ha indotto in topi C57BL / 6. Stimolo antigenico vaglia postale cella reso i topi suscettibili di induzione della malattia. Av., Media. ND, non ha fatto.

Tabella II. Specificità di stimolazione antigenica. Topi riceventi sono stati stimolati con l'antigene adescamento così come altri antigeni irrilevanti. Solo l'antigene adescamento indotta malattia grave. OVA: ovalbumina pollo. Av., Media.

Tabella III. Sfida dosi di antigene necessaria per l'induzione della malattia. Varie concentrazioni di MBP utilizzati per sfidare topi riceventi sono stati testati. Av., Media.

Tabella IV. Cinetica di uno stimolo antigenico. Topi riceventi sono stati stimolati a livello post vari punto di tempo adottareive cell trasferimento. Av., Media.

Studi di EAE nei topi utilizzano spesso le neuroantigens e proteina basica della mielina (MBP), proteine ​​proteolipidica (PLP) o di proteine ​​della mielina degli oligodendrociti (MOG). Studi precedenti in gran parte utilizzato MBP. PLP stimola risposte forti e coerenti dai topi SJL. Più di recente, MOG è la neuroantigen comunemente usato B6, perché i topi sono suscettibili di induzione della malattia con questo antigene. Molti ceppi mirati geni di topo sono su sfondo genetico B6. È interessante notare, B6 topi sono suscettibili di EAE induzione con MOG, ma sono resistenti alla induzione della malattia con il MBP.

Gran parte degli sforzi precedente spiegazione dei meccanismi di EAE centrate sui meccanismi di induzione della malattia, gli effetti di produzione di citochine e il recupero mediata da cellule T regolatorie ^5-7. Come fama topi EAE resistenti può sovvertire la induzione della malattia, invece, non era stata ampiamente studiata. Ciò può essere dovuto alla difficoltà di quantificare unresponsiveness. Arnon ⁸ nel 1981, prima ha mostrato che il trattamento con ciclofosfamide B6 topi resi sensibili a questi topi EAE indotta con MBP. Altri hanno dimostrato che il trattamento con anti-gamma interferone successo anche indotta malattia in B6 e topi BALB / c ^9,10. Va notato che tutti questi studi mirati non-antigene marcatori specifici. D'altra parte, il protocollo descritto qui si concentra su un diverso aspetto della resistenza EAE. Qui solo antigene specifico utilizzato nella sfida in grado di superare EAE mancanza di risposta e permette l'induzione della malattia. Questo protocollo comprende sia la fase di EAE resistenza con trasferimento adottivo di cellule T innescate donatore e la fase di predisposizione con stimolo antigenico (Tabella I). Gli esperimenti possono essere progettati per studiare i fattori intrinseci che mantengono la resistenza EAE così come fattori che invertire questa assenza di reazione. Inizialmente, è stato dimostrato che topi EAE resistenti sono stati in grado di montare risposte autoimmuni quando immunizzaticon MBP ^4. Successivamente, è stato dimostrato che cellule T encefalitogeniche esisteva in questi topi ^2. Alcuni studi recenti hanno dimostrato che ^11,12 trattamento di topi B10.S con anticorpi anti-CD25 prima immunizzazione dei topi a proteina proteolipidica (PLP) convertito i topi da resistenti sensibili, implicando il ruolo delle cellule T regolatorie (Tregs) in mantenimento resistenza EAE. Tuttavia, questo non è il caso quando topi C57BL / 6 sono trattate in modo simile e immunizzato con MBP ^13. La maggior parte dei topi restare insensibili. Così, la resistenza EAE può essere multi-fattoriale. Si ipotizza che, in caso di topi C57BL / 6 rispondono a MBP, la selezione del timo ha soppresso la maggior parte delle cellule T MBP-reattive tali che le frequenze di MBP-reattive cellule T nel periferia sono molto basse. Questo al di sotto della soglia bassa frequenza renderebbe i topi non in grado di rispondere alle immunizzazione con MBP. La dose sfida, attraverso meccanismi sconosciuti, è in grado di superare il problema frequenza e mount una risposta autoimmune. Ulteriori indagini dei possibili meccanismi che comprendono il ruolo di IL-6 ¹² durante la stimolazione antigenica nell'influenzare la suscettibilità di encefalitogenico all'inibizione da Tregs.