Övervinna svarsbenägenhet i experimentell autoimmun encefalomyelit (EAE) Resistenta musstammar genom adoptiv överföring och Antigen Challenge

1. Framställning CFA-emulgerad antigen

1. Lös marsvins-MBP (framställd enligt metoden av Swanborg1 och lagras i lyofiliserad form vid 4 ° C) i fosfatbuffertlösning (PBS) vid en koncentration av 2 mg / ml. Om syntetiserade MBP-peptider (MBP _60-80, SHHAARTTHYGSLPQKSQR) ² används, förbereda en 2 mg / ml lösning. Upprätta en lämplig mängd antigen-lösning (0,1 ml per mus som skall immuniseras) i en glasspruta med luer-lok.
2. Upprätta en volym av fullständigt Freunds adjuvans H37Ra (0,1 vikt%) (CFA, Difco Laboratories) är lika med antigenet lösningen i ett glas spruta försedd med luer-lok.
3. Anslut de två glas sprutor med en trevägskran. Blanda nämnda MBP lösning med CFA genom att skjuta kolvarna fram och tillbaka. Hålla rörelse tills en emulsion bildas.
4. För att testa om en emulsion bildas, tryck allt av blandningen i en spruta. Koppla den tomma sprutan, dra tHan kolven tillbaka lite och tömma en droppe av den återstående lösningen i en bägare med rent vatten vid rumstemperatur. Om emulsionen droppe förblir intakt på ytan av vattnet, är en emulsion bildas. Om emulsionen droppe sprider, anslut sprutorna och fortsätta blandningen rörelse.
5. Använda en 1 ml plastspruta för immunisering för att säkerställa leverans av en exakt dos av antigen. För att överföra det antigen emulsionen till plastspruta, dra ut kolven och sätt den tomma plastspruta i öppningen trevägskran där den tidigare glassprutan kopplades bort som i 1,4.
6. Fylla plastspruta till fälgen genom att trycka in kolven i glasspruta. Sätt kolven i plastspruta rygg och pressa tillbaka överskottet emulsion till att nå 1,2 ml märket på plastspruta. Denna manöver säkerställer att inga luftbubblor fångas inuti plastspruta.
7. Ta bort plasten sprutan från trevägskran. Attach en # 26 gauge till plastspruta. Tryck in kolven till 1 ml-strecket, så att emulsionen nu fyller hålrumsvolym nålen.

2. Immunisering av donerade möss

Obs: Kvinnliga C57BL / 6 möss vanligtvis injiceras med antigen emulsion i fyra platser i flankerna, enligt de metoder som ursprungligen designats av McFarlin grupp ³ vid National Institutes of Health. För en erfaren utredare, kan en person utföra hela uppgiften. För nybörjare kan få hjälp inhämtas så att en person håller musen och den andra personen gör injektionen. Alternativt kan musen bedövas för injektion.

1. Håll musen fast i nacken huden och motverkar svansen mellan den ^4: e och ^{5: e} fingrarna så att bröstkorgen och buken är lätt åtkomliga.
2. Placera nålen på 1 ml plastspruta på en plats i bröstkorgen något över höger armhåla (av moanvändning) och injicera 0,05 ml av antigenet emulsionen subkutant. En liten utbuktning av vitaktig CFA kan ses genom den bleka huden. Upprepa samma sak för plats i bröstkorgen något över vänster armhåla.
3. Släpp svansen och ta tag i höger fot (av mus), vrid den och hålla den mellan den 4: ^e och 5 fingrar ^talen. Lokalisera stället strax nedanför ribban fallet i den högra flanken och injicera 0,05 ml av antigenet emulsionen.
4. Släpp höger fot, vrid musen åt andra hållet och håll vänster fot (av musen) mellan den 4: ^e och 5 fingrar ^talen. Lokalisera stället strax nedanför ribban fallet i den vänstra flanken och injicera 0,05 ml av antigenet emulsionen.
5. Byt till en ny nålen efter injektion av 10 möss, eller om nålen blir avtrubbade.

3. Isolering av lymfkörtelceller för vävnadsodling 7 till 10 dagar efter immunisering

1. Sju till 10 dagar efter immunisering, offra mössenoch avlägsna de dränerande lymfkörtlarna. Den föredragna metoden för eutanasi är genom COa ₂ inhalering. Efter offer, lägg musen på rygg på en dissektion bräde med benen utsträckta och förankras i styrelsen med stift. Mössen väts med en spray av 70% etanol.
2. Skära en skåra i huden längdriktning i mitten av den nedre änden av buken upp till hakan med en steril sax och tång.
3. Skära buken huden från det område av skrevet ned till varje ben. Skala bort och hålla fast i huden, vilket exponerar de inguinala lymfnoder.
4. Skära in i huden längs frambenen (vänster och höger) så att huden kan skalas tillbaka och fästs ner till exponera lymfkörtlar nära armhålorna.
5. Med två par pincetter som arbetar tillsammans, dra bort den bindväv som täcker och runt de inguinala lymfnoder. När den bindväv rensas genom att placera en pincett under lymfkörtel och dras bort från kroppen. Placeralymfkörtlar i en 35 mm petriskål fylld med steril PBS.
6. Dra bort bindväv som täcker de två noderna armhålan lymfkörtlar med hjälp av två par pincett. Isolera lymfkörtlarna och placera dem i en petriskål. Var mycket noga med att inte bryta blodkärlen passerar området som blödningen blir att identifiera lymfkörtlarna mycket svårt.
7. Efter alla lymfkörtlarna samlas, flytta petriskål till en biosäkerhet huva. Sönder och retas lymfkörtlarna isär med de två paren av tång, slipning mot varandra. Alternativt kan de lymfkörtlar brytas upp genom att använda den plana änden av kolven av en 3 ml plastspruta pressar mot de lymfkörtlar på botten av en petriskål.
8. Passera retade lymfan suspension nod cellen genom ett nylonnät för att ta bort membran och skräp.
9. Fyll lymfan suspension noden cellen 50 ml med steril PBS. Centrifugera vid 1000 rpm under 10 min. Återsuspendera pelleten i odlingsmedium. Gör en livskraftig cell räkna och justera koncentrationen till 4 x 10 ⁶ celler / ml. UseRPMI 1640 kompletterat med 10% fetalt kalvserum, 2 mM L-glutamin, 1 mM MEM natriumpyruvat, 0,1 mM MEM icke-essentiella aminosyror, 100 U / ml penicillin, 100 pg / ml streptomycin, 10 mM Hepes-buffert och 5 x 10 ^-5 M 2-ME. Pre-varma kulturen innan det omblandas cellerna.
10. Odla cellerna i 24-brunnars odlingsplattor med 2 ml volym per brunn (slutlig cellkoncentration 8 x 10 ⁶ celler / brunn). Tillsätt antigen till varje brunn vid en slutlig koncentration av 100 pg / ml. Placera odlingsplatta i en 37 ° C inkubator med _5% CO2. Inkubera cellerna i 5 dagar.

4. Skörd Odlade lymfkörtelceller 5 dagar efter påbörjad kulturer

1. Blanda cellerna i varje brunn genom att pipettera upp och ned med en Pasteur-pipett av glas eller en liten volym pipett. Skörda cellerna till en 50 ml centrifugrör.
2. Centrifugera cellerna vid 1000 rpm under 10 min. Resuspend cellpelleten i en liten volym PBS.
3. Räkna celler och justera den viabla cellkoncentrationen till 2,5 x 10 ⁸ celler / ml med steril PBS. Dra cellerna in i en spruta utrustad med en # 26 gauge nål.
4. Placera en värmelampa över buren av recipientmöss att hjälpa dilatera svansvenen.
5. Användning av en mus hållare, sträcker svansen hos mus genom slitsen i hållaren. Dra för att förlänga svansen. Leta reda på venen.
6. Injicera 0,2 ml / mus av cellsuspensionen, motsvarande 5 x 10 ^7-celler.

5. Antigen Challenge of recipientmöss 20 dagar efter cellöverföring och utveckling av sjukdomssymptom

1. Utmana recipientmöss visar inga tecken på sjukdom med antigenet. De förfaranden som är desamma som avsnitt 2 om "Immunisering av donatormöss".
2. Observera utvecklingen av paralytisk sjukdom 7 till 10 dagar efter antigenprovokation.
   1. Sjukdomen börjar med svaghet i svansen. Sjukdom graderades som 1När svansen blir slapp. Sjukdom bedöms som 2 när musen är förlamad i en bakbenet. Sjukdomen är graderad 3 när båda bakbenen är förlamade och musen drar båda bakbenen när de kryper fram. Sjukdomen är graderad 4 när musen förlorar användning av båda frambenen, lämnar musen helt orörliga. Sjukdomen är graderad 5 när musen är döende och kroppen lockar upp. Döden klassas som sjukdom årskurs 6 ^4.
3. MBP-specifika EAE inducerades i C57BL / 6 möss efter detta protokoll är monofasisk. Mössen kan återhämta sig från sjukdomen, men inte genomgår spontana återfall.

6. Representativa resultat

Möss som fick primas och in vitro-expanderade nod donator lymfceller inte utvecklar EAE sjukdomssymptom, vilket speglar deras motståndskraft mot sjukdomar induktion. Emellertid svår sjukdom utvecklades efter antigena utmaningen (Tabell I), vilket visar förmågan hos den antigena utmaningenvända motståndet mekanismen. Två särdrag noteras antigena utmaningen är de doser av antigen och kinetiken för utmaningen att inducera sjukdom. Mycket låg dos av antigen i förväg, såsom visas i tabell III. Överraskande kunde möss som fick givarceller för ett år sedan utvecklas fortfarande svår sjukdom när de utmanas med antigenet (tabell IV). Dessa två observationer tyder starkt engagemang "långlivade" T-celler för att upprätthålla EAE motstånd. Detta protokoll är tillämpligt på många EAE resistenta musstammar ^4.

Figur 1. Flödesschema för den experimentella utformningen för induktion av EAE hos ansedda resistenta musstammar.

Tabell I. Induktion av MBP-medierad EAE i C57BL / 6 möss. Adoptiv överföring av primade och in vitro-expanderade givarceller inte inducerar EAE hos C57BL / 6 möss. Antigen utmaning inlägg cellöverföring gjorde mössen är mottagliga för sjukdomen induktion. Av., Genomsnitt. ND, inte gjort.

Tabell II. Specificitet av antigena utmaningen. Mottagande möss provocerades med den primande antigenet såväl som andra irrelevanta antigener. Endast den primande antigen inducerade svår sjukdom. OVA: kycklingovalbumin. Av., Genomsnitt.

Tabell III. Challenge antigendoser krävs för sjukdom induktion. Olika koncentrationer av MBP används för att utmana mottagande möss testades. Av., Genomsnitt.

Tabell IV. Kinetik för antigena utmaningen. Mottagande möss utmanades vid olika tidpunkt efter att antaive cellöverföring. Av., Genomsnitt.

Studier på EAE i möss utnyttjar ofta neuroantigens, myelinbasiskt protein (MBP), proteolipidprotein (PLP) eller myelin oligodendrocyte protein (MOG). Tidigare studier används främst MBP. PLP stimulerar starka och konsekventa svar från SJL möss. Mer nyligen har MOG den gemensamma neuroantigen används eftersom B6-möss är känsliga för sjukdomsinduktion med detta antigen. Många av de gener riktade musstammar är på B6 genetisk bakgrund. Intressant nog B6-möss är känsliga för EAE-induktion med MOG men är resistenta mot sjukdomsinduktion med MBP.

Mycket av den tidigare försök att belysa mekanismerna hos EAE centrerade på induktionen mekanismer sjukdom, effekter av cytokinproduktionen och återhämtning som medieras av regulatoriska T-celler ^5-7. Hur erkända EAE resistenta möss kan bryta ned induktionen av sjukdomen, å andra sidan, inte hade undersökts i stor utsträckning. Detta kan bero på svårigheten att kvantifiera unresponsiveness. Arnon ⁸ i 1981 först visade att behandling B6-möss med cyklofosfamid gjorde dessa möss mottagliga för EAE inducerade med MBP. Andra har visat att behandling med anti-gamma-interferon även framgångsrikt inducerad sjukdom i B6 och Balb / c-möss ^9,10. Det bör noteras att dessa studier alla riktade icke-antigenspecifika markörer. Å andra sidan fokuserar protokollet som beskrivs här på en annan aspekt av EAE motstånd. Här bara specifika antigen som används i utmaningen kan övervinna EAE okänslighet och tillåter induktion av sjukdom. Detta protokoll omfattar både EAE motstånd fasen med adoptiv överföring av celler primade donator-T-och känsligheten fasen med antigena utmaningen (Tabell I). Experiment kan utformas för att studera de inneboende faktorer som upprätthåller EAE motståndet, liksom faktorer som vända denna bristande respons. Inledningsvis visade det sig att EAE resistenta möss kunde montera autoimmuna reaktioner vid immuniseringmed MBP ^4. Senare har det visats att encefalitogena T-celler fanns i dessa möss ^2. Några färska studier ^11,12 visade att behandling av B10.S möss med anti-CD25 antikroppar innan immunisering av möss att proteolipidprotein (PLP) omvandlas mössen från resistenta mot mottagliga, vilket roll regulatoriska T-celler (tregs) i bibehållande EAE motstånd. Emellertid är detta inte fallet när C57BL / 6 möss liknande behandlas och immuniserades med MBP ^13. De flesta av mössen fortfarande svarar inte. Således kan EAE motståndet vara multi-faktoriell. Det postuleras att, i fallet med C57BL / 6 möss som svarade mot MBP, som tymisk selektion bort de flesta MBP-reaktiva T-celler så att frekvenserna hos MBP-reaktiva T-celler i periferin är mycket låga. Detta ligger under gränsvärdena lågfrekventa skulle göra mössen som inte kan svara på immunisering med MBP. Den exponeringsdos, genom okända mekanismer, kan övervinna frekvensfrågan och mount en autoimmun respons. Ytterligare undersökningar av möjliga mekanismer skulle omfatta rollen av IL-6 ¹² under antigen utmaning påverkar känslighet encefalitogena för hämning av tregs.