A infecção de embriões de zebrafish com patógenos bacterianos intracelulares

Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (61), e3781, doi:10.3791/3781 (2012).

Peixe-zebra (Danio rerio) embriões são cada vez mais utilizado como um modelo para estudar a função do sistema inato vertebrado imune no hospedeiro de organismos patogénicos interacções ^1. Os principais tipos de células do sistema imune inato, macrófagos e neutrófilos, desenvolver-se durante os primeiros dias de embriogénese antes da maturação dos linfócitos que são necessários para as respostas imunitária adaptativa. A facilidade de obtenção de um grande número de embriões, a sua acessibilidade devido ao desenvolvimento externo, a transparência óptica de estágios embrionários e larval, uma ampla gama de ferramentas genéticas, extensos recursos mutantes e coleções de linhas repórter transgênicos, tudo isto contribui para a versatilidade do peixe-zebra modelo. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) e Mycobacterium marinum pode residir intracelularmente em macrófagos e são frequentemente usados ​​para estudar interações patógeno-hospedeiro em embriões de peixe zebra. Os processos a infecção destas duaspatógenos bacterianos são interessantes para comparar porque S. infecção typhimurium é aguda e letal dentro de um dia, enquanto M. marinum infecção é crônica e pode ser trabalhada até o estágio larval ^{2, 3.} O local de micro-injecção de bactérias no embrião (Figura 1) determina se a infecção se tornar-se rapidamente sistémica ou será inicialmente permanecer localizada. Uma infecção sistémica rápida pode ser estabelecida por micro-injecção de bactérias directamente para a circulação do sangue através da veia caudal no ilha de sangue posterior ou através do duto de Cuvier, um canal de circulação de largura no saco vitelino de ligar o coração para a vasculatura do tronco. Em 1 dpf, quando embriões nesta fase têm macrófagos phagocytically ativos, mas neutrófilos ainda não amadureceram, injetando na ilha de sangue é o preferido. Para injeções em 2-3 dpf, quando os embriões também desenvolveram funcionais (mieloperoxidase produtora) neutrófilos, o ducto de Cuvier é preferido como tele no local da injecção. Para estudar a migração dirigida de células mielóides no sentido infecções locais, as bactérias podem ser injectado no músculo da cauda, ​​vesícula ótica, ou ventrículo rombencéfalo ^4-6. Além disso, o notocórdio, uma estrutura que parece ser normalmente inacessíveis às células mielóides, é altamente susceptíveis à infecção local ^7. Uma alternativa útil para aplicações de alto rendimento é a injeção de bactérias na gema de embriões nas primeiras horas após a fertilização ^8. Combinando as bactérias fluorescentes e linhas de zebrafish transgênicos fluorescentes com macrófagos ou neutrófilos cria condições ideais para multi-cor de imagem de sistema patógeno-hospedeiro interações. Este artigo irá descrever vídeo protocolos detalhados para a infecção por via intravenosa e local de embriões de zebrafish com S. typhimurium ou M. bactérias marinum e para imagens de fluorescência posterior da interação com células do sistema imune inato.

1. Prepare agulhas de injeção

1. Prepare vidro borosilicato agulhas de injeção microcapilar (Harvard Apparatus, 300038, 1 mm de diâmetro externo x 0,78 mm de diâmetro) utilizando um dispositivo puxador de micropipeta (Sutter Instruments Inc., Flaming / Brown p-97 com as seguintes configurações para uma maior dica: a pressão do ar 400; calor 610; puxar 40; velocidade 50; de tempo de 30 e com as seguintes configurações para um curto dica: a pressão do ar 500; calor 510; puxar 100; de velocidade em 200, o tempo de 60).
2. Quebre a ponta da agulha com uma pinça fina para obter um diâmetro de abertura da ponta de 5-10 mM. É aconselhável bisel a abertura da ponta de agulha a um ângulo de 45 graus com um microgrinder (Narishige Inc., EG-400) para se obter uma nítida ponta. Isto irá facilitar a perfuração da camada epidérmica e, portanto, resultar em mais injecções reprodutíveis com menos danos do tecido do que com agulhas rombas. Agulhas mais pontas são preferidos para a veia caudal (passo 5) e duto de Cuvier (passo 6.1) injecções e mais curtos agulhas pontaSão preferidos para os protocolos de injecção outros passos (6.2-6.6).

2. Prepare S. typhimurium inóculo

1. Placa para S. typhimurium a partir de um estoque de glicerol -80 ° C em placas de agar LB (com os antibióticos apropriados para seleccionar para vectores de expressão de fluorescência) e incubar durante a noite a 37 ° C.
2. Escolha individuais colónias fluorescentemente positivos e ressuspender-los para a concentração desejada (ver protocolos 5 e 6) em estéril tamponada com fosfato salino (PBS), opcionalmente contendo 0,085% (v / v) de fenol vermelho (Sigma-Aldrich) para ajudar a visualização do processo de injeção. Usar diretamente a suspensão fresco para a injeção ou preparar ações glicerol. Para preparar unidades de glicerol, girar para baixo o estoque de injecção feita recentemente, com a concentração desejada de bactérias e concentrar o material por ressuspender o pellet em metade do volume, a partir de estéril de 20% de glicerol (v / v) (Sigma-Aldrich) em PBS. Armazenar o estoque de glicerol a -80 ° C. Diluir o glicerol estoque 1:1 (v / v) antes da injecção em PBS estéril, opcionalmente contendo 0,17% de vermelho de fenol.
3. Vortex da suspensão bacteriana bem para evitar aglomeração.
4. Carregar o inoculo para dentro da agulha microcapilar usando uma ponta microloader (Eppendorf, 5.242.956,003).
5. Devido ao tamanho relativamente grande de S. bactérias typhimurium e sua fluorescência Ds-vermelho brilhante, quando usando o vetor de expressão pGMDs3 ³ (cepa disponíveis mediante solicitação), individuais células bacterianas podem ser facilmente contou com um estereomicroscópio de fluorescência, a fim de definir a dose da injeção. Para este fim, injectar 1 nL em uma gota de PBS numa placa de ágar, contar as bactérias fluorescentes, e calcular o volume de injecção que é necessário para obter a dose desejada bacteriana (de preferência manter o volume de injecção entre 1-2 nL). Injetar os embriões com S. typhimurium por via seleccionada (ver protocolos 5 e 6).

3. Preparar

1. Mantenha o M. marinum estirpe cresce em agar Difco 7H10 Middlebrook (BD e companhia) suplementado com 10% de ácido oleico-albumina-dextrose-catalase (OADC, BD e companhia), glicerol 0,5%, e com os antibióticos apropriados para seleccionar para vectores de expressão de fluorescência (estirpes disponíveis mediante solicitação ^9), por isso há sempre um estoque fresco.
2. Escolha uma colônia de M. marinum e ressuspender em Difco Middlebrook 7H9 caldo (BD e companhia) suplementado com 10% de albumina-dextrose-catalase (ADC, BD e companhia) e 0,05% de Tween 80 (Sigma-Aldrich) e os antibióticos apropriados. Verificar que a densidade óptica (DO) a 600 nm é de 0,2 - 0,3 e deixar crescer durante a noite à estaticamente 28,5 ° C. O tempo de geração de M. marinum é de aproximadamente 4-6 horas, variando de acordo com a tensão.
3. Medir a OD a 600 nm novamente no dia da injecção. Um OD600 de 1 corresponde a cerca de 10 ⁸ M. marinum / mL(Este pode variar de acordo com a estirpe bacteriana utilizada e, portanto, devem basear-se numa curva de crescimento para a estirpe em particular).
4. Colher as bactérias quando estão em fase logarítmica (não deixe a OD600 exceder 1,00) por centrifugação e lavagem por três vezes em PBS estéril.
5. Medir a OD600 novamente da suspensão bacteriana em PBS, girar para baixo, e ressuspender as bactérias para a concentração desejada (ver protocolos 5 e 6) em PBS ou em Polivinilpirrolidona 2% (PVP40) em PBS (w / v), o que melhora a homogeneidade da suspensão bacteriana. Vermelho de fenol (Sigma-Aldrich) pode ser adicionado a uma concentração de 0,085% para ajudar a visualização do processo de injecção. Usar diretamente a suspensão fresco para a injeção ou preparar ações glicerol. Para preparar unidades de glicerol girar para baixo o estoque de injecção feita recentemente, com a concentração desejada de bactérias e concentrar o material por ressuspender o pellet em metade do volume de partida em glicerol a 20% em PBS estéril. Guarde o Glycerol estoque a -80 ° C. Diluir o glicerol estoque 1:1 (v / v) em PBS estéril, opcionalmente contendo 4% de PVP40 e / ou 0,17% de vermelho de fenol.

4. Prepare-se embriões de zebrafish para Injectáveis

1. Configure casais zebrafish e coletar embriões, como mostrado em outro artigo de vídeo ^10. Manter embriões numa placa de Petri preenchido com ovo água (60 sais mcg / ml do mar;. Ca 60 embriões / prato) e incubar a 28,5 ° C.
2. Se necessário, adicionar 0,003% de N-Phenylthiourea (PTU, Sigma-Aldrich) à água de ovos, quando os embriões são aproximadamente 12 hpf para evitar melanização.
3. Em torno de 24 horas após a fecundação (hpf), dechorionate os embriões com pinças boa (boa Ciência Ferramentas Inc., Dumont # 5 Fórceps - Biologia Inox.
4. Manter os embriões numa placa de Petri cheio com água de ovo e com uma camada de agarose a 1% na parte inferior para impedir embriões se colem à superfície plástica.
5. Anestesiar os embriões com 200 ug / mL tamponada 3-Aminobenzóico (tricaina, Sigma-Aldrich) de aproximadamente 10 min antes de injectáveis.

5. Injeção intravenosa de bactérias em embriões de um dia de idade

1. Estágio dos embriões aos 28 hpf ^11, marcando para a circulação sanguínea consistente, a partir de pigmentação nos olhos, uma cauda reta, eo coração sendo posicionado apenas ventralmente ao olho.
2. Anestesiar os embriões, consulte o passo 4.5.
3. Carregar a agulha com o inoculo bacteriano utilizando uma ponta microloader.
4. Montar a agulha carregada em um micromanipulador (Instrumento Sutter, MM-33) ligado a um suporte (instrumentos de precisão do mundo, suporte magnético M10L) e posicioná-la sob um microscópio estéreo (Leica M50, Acromática 1x objetivo 0,15 NA, base de luz transmitida TL ST). Ajuste o tempo de injecção para 0,2 s e da pressão de compensação a 15 hPa (Eppendorf, FemtoJet). Ajustar a pressão de injecção entre 700 e 900 hPa para se obter o volume de injecção correcta para a agulhausado. Ajustar o tamanho de gota para coincidir com o diâmetro desejado com a ajuda de uma barra de escala numa lâmina de microscópio ou na ocular. Para a determinação do tamanho da gota pode ser injectado em óleo mineral sobre uma lâmina de microscópio, ou o tamanho pode ser estimada por injecção para o ar, o que deixa a gota suspensa sobre a ponta da agulha. O raio de uma gota de 1 nL é 0,062 milímetro (V = 4/3 π r ^3).
5. Ajuste o micromanipulador com a agulha carregada para a posição correcta antes da injecção (isto é, aproximadamente num ângulo de 45 ° em relação à superfície da chapa de injecção) e apenas movê-lo para trás e para injectar.
6. Os embriões anestesiados são pipetados sobre uma chapa plana de agarose a 1% da injecção e água ovo excesso é removido, permitindo que a tensão superficial para segurar os embriões no lugar durante injectáveis. Usar uma ferramenta de lacete de cabelo (Figura 2) para alinhar os embriões. Orientar a placa de injecção à mão durante injecções para colocar os embriões para a posição preferida para inserting a agulha isto é, com as caudas apontando para a ponta da agulha.
7. Coloque a ponta da agulha directamente acima da veia caudal perto da abertura urogenital (Figura 1A), perfurar a periderme com a ponta da agulha e injectar a dose desejada de bactérias; usamos ca. 250 ufc de S. typhimurium de tipo selvagem (wt) estirpe SL1027, que contém a expressão Ds-RED vector pGMDs3, e ca. 120 ufc de M. marinum tensão Mma20. A suspensão bacteriana injetado seguirá o fluxo de sangue através da veia caudal para o coração. Monitorar se a injecção foi efectuada correctamente pela verificação de um volume de expansão do sistema vascular directamente após o pulso ^2. Para experiências de dose-resposta, 2-3 injecções consecutivas pode ser realizada sem extrair a agulha.
8. Freqüentemente verificar que o volume de injeção permanece o mesmo durante o experimento. Para fornecer um controle para a consistência das injeções durante todo o experimento, injetar uma drop de bactérias directamente em uma gota de PBS estéril em meio de crescimento bacteriano após cerca de injecção em embriões cada 30 ^th. Placa para fora este gota e contar as colónias de bactérias após incubação para determinar as unidades formadoras de colónias (CFU) no volume de injecção.
9. Use uma lupa de fluorescência (protocolo 7) para observar indivíduo fluorescente S. typhimurium células que circulam na corrente sanguínea directamente após a injecção, e descartar os embriões que não são adequadamente injectados. Individual fluorescente M. bactérias marinum não pode ser observada por microscopia de fluorescência estéreo directamente após injecções, mas agregados fluorescentes de células infectadas deve ser visível por 2 dias após a infecção (dpi) e crescer ao longo do tempo.

6. Rotas alternativas de infecção

1. Duto de injeção de Cuvier: linha de embriões anestesiados (2-3 dpf) em uma placa plana de agarose 1% injetando como para injectáveis ​​veia caudal (ver 5.6). Oriente a injetarplaca de iões à mão durante injecções para colocar os embriões para a posição preferida para a inserção da agulha, ou seja, na diagonal sob um ângulo de 45 ° de modo que o duto de Cuvier pode ser aproximado por a ponta da agulha a partir do lado dorsal do embrião (Figura 1B) . Insira a agulha no ponto de partida do ducto de Cuvier apenas dorsal para o local onde o canal começa a ampliar mais o saco vitelino e injetar 100-200 bactérias (NL 1-3). A injecção é correcta, se o volume no interior da conduta expande directamente após o pulso e do saco vitelino não é rompida. Como para injecções veia caudal (ver 5.7), várias injecções consecutivas pode ser realizada sem extrair a agulha.
2. Injecção rombencéfalo ventrículo: linha de embriões anestesiados (32 HPF) sobre uma superfície plana da placa de agarose 1% injecção de tal modo que os embriões são posicionados com o seu lado dorsal para a ponta da agulha. Insira a agulha para o ventrículo rombencéfalo a partir de uma posição anterior, sem tocar no neuroepithelium (Figura 1C) e injectar 20-100 bactérias (0,5-1 nL). Para praticar o processo, utilizar um corante fluorescente (tais como Texas Red-Dextrano) como mostrado em outro artigo de vídeo ^13.
3. Injeção cauda muscular: os embriões posição anestesiados (1-2 dpf) como para injectáveis ​​veia caudal (ver 5.6). Ajustar o micromanipulador com a agulha carregada para um ângulo de aproximadamente 65 ° em relação à superfície da chapa de injecção. Injectar uma suspensão bacteriana (0,5-1 nL) contendo 20-50 ufc no músculo acima da abertura urogenital (Figura 1D), sem causar danos ao notocórdio ou vasos sanguíneos.
4. Injeção vesícula ótica: os embriões posição anestesiados (2-3 dpf) como para injectáveis ​​veia caudal (ver 5.6). Ajustar o micromanipulador com a agulha carregada para um ângulo de aproximadamente 65 ° em relação à superfície da chapa de injecção. Injectar a cerca de 20 bactérias (0,5 nL) na vesícula ótica (Figura 1E) com prensa de baixoure para evitar a ruptura do tecido local.
5. Notocórdio de injecção: linha de cima embriões anestesiados (1-2 dpf) sobre uma chapa plana de agarose 1% injecção de tal modo que os embriões são posicionados com a sua cauda apontando para fora a partir da ponta da agulha. Inserir a agulha através do tecido muscular cauda para o notocórdio (Figura 1F) e injectar cerca de 20-50 bactérias (máximo 0,5 nL). Tome cuidado para não injetar muito volume para evitar a ruptura da notocorda.
6. Injeção de gema: os ovos de posição com embriões no estágio de célula-16-1000 em uma placa de agarose 1% com injeção de canais retangulares ou em forma de V feitas com um molde canal ¹² ou online em http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . Pierce a agulha através da cório para o centro da gema (Figura 1G) e injectar bactérias 20-40 (1-2 nL). A utilização de 2% de solução transportadora PVP40 para a suspensão bacteriana (ver passo 3.5)é importante para impedir a propagação bacteriana precoce no embrião.

7. Imagem estéreo da Infecção

1. Anestesiar os embriões infectados em uma camada de agarose 1% placa de Petri cobertas com água contendo ovos tricaina (ver 4.5).
2. Alinhar os embriões na posição correcta para a imagem latente sob um microscópio estéreo de fluorescência com uma ferramenta de lacete de cabelo (Figura 2). Antes da bexiga natatória inflacionou (1-5 dpf), os embriões serão deitado em seus lados permitindo imagem vista lateral.
3. Se uma posição diferente do que o ponto de vista lateral é necessário, montar os embriões em metil-celulose 1,5%. Manipular o embrião para a posição desejada com uma ferramenta de lacete de cabelo (Figura 2).
4. Retornar os embriões para a água depois de ovo de imagem.

8. Imagem confocal da Infecção

1. Colocar uma gota de baixo ponto de fusão de agarose (Lonza Inc., 1,5% (w / v) em água ovo) sobre o fundo de vidro de umWillCo-cápsula (WillCo Wells, GWSt-5040), se um microscópio invertido confocal é usado, ou sobre uma lâmina única cavidade depressão (Agar Scientific, L4090) se um microscópio confocal vertical é utilizado.
2. Coloque o embrião anestesiados na gota de agarose com uma quantidade limitada de água ovo e manipular o embrião em posição com uma ferramenta de lacete de cabelo (Figura 2). Quando se utiliza um microscópio invertido, é importante que a região de interesse do embrião é plana contra o fundo do prato de vidro de imagem. Um microscópio vertical pode ser usado em combinação com imersão em água ou objectivos de longa distância secos eo embrião deve ser posicionada de tal modo que a região de interesse é o mais próximo do objectivo quanto possível.
3. Deixe o agarose solidificar e submergir a queda de agarose em água contendo ovos tricaina (ver 4.5). Se um microscópio vertical é utilizado, colocar uma lamela de vidro na superfície da cavidade da depressão (não permitir que as bolhas de ar para formar).
4. Seqüencialmente adquirir gripeorescence e imagens de transmissão.
5. Retire cuidadosamente a agarose a partir do embrião com pinças finas e coloque o embrião de volta à água ovo se for necessário para novos experimentos.

9. Os resultados representativos

Injeção de Salmonella typhimurium ou bactéria Mycobacterium marinum para a ilha de sangue de embriões em 1 resultados dpf na fagocitose por macrófagos rápida. O gene MPEG1 foi recentemente identificado como um marcador fiel de macrófagos embrionárias, colocalizing com a bem estabelecida macrófagos marcador csf1r (SFM) e não sobreposição com marcadores de neutrófilos tais como MPX (MPO) e Lyz ^{4, 14.} Para imagens ao vivo de fagocitose bacteriana foi utilizado linhas transgénicas em que o promotor MPEG1 dirige a expressão da proteína fluorescente em macrófagos ^14. Essas linhagens transgênicas quer ter o f promotor mpeg1usado directamente para o gene GFP, ou empregar um sistema de dois componentes em que o promotor MPEG1 dirige a expressão do factor de transcrição de levedura Gal4 que activa um transgene em segundo lugar com a sequência de reconhecimento Gal4 (UAS, a montante activação sequência) fundida com o gene Kaede. Quando a injecção ilha de sangue (5 protocolo; Figura 1A) é realizada correctamente, as bactérias irão imediatamente fluir através da circulação sanguínea e espalhados por todo o embrião. Divulgação da relativamente grande e brilhante fluorescente Ds-RED S. marcado typhimurium bactérias podem ser visualizados directamente com um microscópio estéreo de fluorescência (Figura 3A), e imagem confocal menos 2 mostra HPi que muitas bactérias são fagocitados por macrófagos fluorescentes (Figura 3B-C). A injeção de tão pouco quanto 25 ufc de tipo selvagem S. bactérias typhimurium irá resultar em uma infecção letal, ao passo que uma dose semelhante de bactérias de uma s avirulentostrem, como Ra, pode ser autorizada pela ³ sistema imunológico embrionário. Uma dose de injecção de 250 ufc foi utilizada para determinar as respostas transcricionais a S. typhimurium infecção no embrião do peixe-zebra e demonstraram a indução de uma resposta forte expressão pró-inflamatória gene ^15. Em contraste, a injecção intravenosa de a M. marinum bactérias não provocam uma resposta pró-inflamatória forte, mas leva a uma infecção persistente, onde os macrófagos infectados formar agregados apertados que são considerados como os estágios iniciais de granulomas, que são a marca registrada da tuberculose ^2. Imagem confocal de tal agregar um granuloma-como na Tg (mpeg1: EGFP) gl22 linha ¹⁴ a 5 dpi mostra o crescimento intracelular de mCherry marcado M. bactérias marinum dentro dos macrófagos verdes fluorescentes (Figura 3D-E).

Otseus vias de infecção são úteis para fins diferentes. As bactérias podem ser injectado no ventrículo rombencéfalo a 32 HPF (Figura 1C), que é um compartimento desprovido de macrófagos. Injeção de 20-100 mCherry marcado M. bactérias marinum para dentro desse compartimento leva à infiltração rápida por macrófagos que fagocitam as bactérias (Figura 4A). Outro método para estudar a migração dirigida de células imunes inatas é a injecção de bactérias no músculo cauda (Figura 1D). No entanto, as injecções musculares cauda também causar danos nos tecidos que, por si só provoca alguma atração de leucócitos. Tal resposta ferimento pode ser evitado quando cuidadosamente injectando um volume pequeno (0,5-1 nL) para a vesícula ótica (Figura 1E). Como mostrado aqui, usando o Tg (MPX: EGFP) i114 linha ^16, a injecção de cerca de 20 ufc de S. typhimurium na vesícula ótica leva à atração de neutrófilos em 3 hpi ( (Figura 4E). O notocórdio, que parece ser resistente a infiltração de leucócitos, é um compartimento permissivo para o crescimento de M. mutantes marinum que são fortemente atenuada quando injectado em outros tecidos ^7; (Figura 4F). Finalmente injecção, no início de M. marinum na gema de embriões fornece um método alternativo para conseguir uma infecção sistémica. Em geral, efectuar estas injecções em torno do estágio de célula 16 (Figura 1G), mas injecções bacterianas na gema pode também ser realizada em fases posteriores (até ao estádio de célula 1000), ou anterior (1 a 8 fase celular) para o co-injecções com morpholinos ^8. Após a injecção de gema de uma dose de 20-40 ufc, M. bactérias marinum espalhar ao longo de vários dias para os tecidos embrionários e granuloma-like formar agregados semelhantes aos observados sobre a convencionalmétodo de injecção intravenosa ^8; (Figura 4G). O método de injecção de gema não é adequado para S. infecção typhimurium, porque o seu rápido crescimento na gema provoca letalidade precoce. O método de infecção gema para M. infecção marinum será útil para aplicações de alto rendimento, uma vez que pode ser automatizado usando um robô injecção ^8.

Figura 1. Resumo dos métodos de injecção utilizados para o estabelecimento de infecções sistémicas ou locais em embriões de peixe-zebra. (AB) injecções intravenosas para o estabelecimento de uma infecção sistémica rápida são realizadas na veia caudal no ilha de sangue posterior em 1 dpf (A) ou dentro da conduta de Cuvier em 2-3 dpf (B). (EC) injecções locais para estudar macrófago e quimiotaxia de neutrófilos são realizados dentro do ventrículo rombencéfalo menos 1 dpf (C), O músculo da cauda em 1-2 dpf (D) ou a vesícula ótica em 2-3 dpf (E). (F) As injecções para criar uma infecção aparentemente inacessível a fagócitos são realizados dentro do notocórdio de 1-2 dpf. (G) injecções para criar uma infecção precoce sistémica com bactérias que crescem lentamente, tais como M. marinum pode ser realizada na gema na fase celular 16-1000. Todas as imagens foram tiradas com uma Leica M165C, PLANAPO 1.0x conectado a uma câmera Leica DFC420 (Leica 10446307 0.8x).

Figura 2. Ferramenta laço do cabelo. Um pedaço de cabelo humano é inserido como um lacete na abertura de uma pipeta de Pasteur e fixada no seu lugar com super cola ou com Tipp-Ex. Isso fornece uma ferramenta conveniente para manipulando os embriões do zebrafish frágeis.

Figura 3. Injeções intravenosas deSalmonella typhimurium vermelho fluorescente e Mycobacterium marinum. Ds-RED-rotulado S. typhimurium SL1027 bactérias (AC) e mCherry marcado M. marinum Mma20 bactérias (DE) foram injetados na ilha sangue de Tg (mpeg1: Gal4-VP16) GL24; Tg (UAS-E1b: Kaede) s1999t (AC) ou Tg (mpeg1: EGFP) embriões gl22 (DE) zebrafish a 28 hpf. (A) imagem de sobreposição Stereo-fluorescência e de campo brilhante mostrando disseminação de S. typhimurium na circulação sanguínea em 2 hpi (Leica microscópio Leica DFC420C MZ16FA com câmera). (BC) confocal z-stack projeções mostram vermelho S. typhimurium bactérias fagocitadas por macrófagos verdes a 2 hpi (Leica TCS SPE, HCX objetivo APO 40x 0,8 NA). Bactérias que são ainda extracelular também pode ser observada. (D) Confocal projeção z pilha mostrando um agregado granuloma-como contendo M. macrófagos marinum Mma20-infectados e não infectados com 5 dpi (Leica TCS SPE, HCX APO 40x0,8 NA). Macrófagos em verde e bactérias em vermelho. (E) Confocal projeção z pilha de um macrófago individual (verde) com M. intracelular bactérias marinum (vermelho). A área descrita no D pelo retângulo branco foi fotografada com um objetivo maior ampliação (Leica TCS SPE, HCX PL APO 63x 1,2 NA). Scalebars: 20 uM.

Figura 4. Vias alternativas para a infecção de embriões de peixe zebra. (A) mCherry-rotulado M. marinum Mma20 bactérias foram injetados no ventrículo rombencéfalo a 32 hpf. Fluorescência e transmissão de imagem de sobreposição mostra bactérias mCherry-rotulados fagocitados por macrófagos em 5 hpi (Leica TCS SPE, HCX PL FLUO TAR 40.0x 0,7 NA). (B) S. typhimurium foi injectada no músculo da cauda a 1 dpf. Atracção de células mielóides para o local de injecção (branco círculo) é mostrado em 3 hpi por fluorescent hibridação in situ ^4, (C), enquanto que em embriões não injectada normalmente não há células mielóides neste local morfológica. Embora os embriões não contêm neutrófilos maduros, nesta fase, duas populações de células mielóides podem ser distinguidos, uma expressando o macrófago marcador mfap4 (vermelho) e uma expressando o marcador de neutrófilos MPX (verde) (Leica TCS SPE, HC PL FLUOTAR 10.0x 0,3 NA). Fluorescência das bactérias é perdido após o processo de hibridação in situ. (D) Ds-RED-rotulado S. bactérias typhimurium foram injetados na vesícula ótica de Tg (mpx: EGFP) i114 zebrafish em 2 dpf. Imagens de sobreposição estéreo-fluorescência e de campo brilhante mostram que MPX: células EGFP rotulados neutrófilos são atraídos para a vesícula infectada ótica (elipse pontilhada) a 3 hpi, (E), enquanto que a injecção de controlo de PBS para a vesícula ótica de Tg (MPX: EGFP ) i114 zebrafish não mostra atração de neutrófilos para o ve não infectado óticasicle (elipse pontilhada) (Leica MZ16FA com câmera Leica DFC420C). (F) mCherry marcado com M. bactérias marinum do E11 atenuada eccCb1 :: tn cepa mutante ¹⁷ foram injetados na notocorda a 1 dpf. Proliferação dentro da notocorda foi fotografada em 5 dpi (microscópio Leica DC500 MZ16FA com câmera). (G) mCherry marcado com M. bactérias marinum E11 foram injectados na gema de 16 células de embriões em fase peixe-zebra da Tg (fli1a: EGFP) linha que expressa a GFP em células endoteliais dos vasos sanguíneos e linfáticos. Formação de granulomas-like agregados de células infectadas na região da cauda é observada a 5 ppp (Leica microscópio MZ16FA com Leica câmara DFC420C; imagem a partir de ^8).

Os métodos de infecção descritas neste artigo são frequentemente usados ​​para estudar a função dos genes hospedeiros inatas imunidade ou genes de virulência bacterianos ^1. Os micro-injecção intravenosa métodos (protocolos 5 e 6.1) são usados ​​com mais freqüência para tais estudos. A veia caudal no ilha de sangue posterior é o local mais conveniente para injecção intravenosa de um dia de idade embriões. Como a veia caudal torna-se mais difícil de penetrar em fases posteriores, preferimos o ducto de Cuvier como local da injeção intravenosa de embriões em 2-3 dpf. Em todos os casos é fundamental para injetar os embriões com números consistentes de bactérias, que devem ser verificados por inóculos injeção de revestimento para a contagem de ufc. Os seguintes aspectos devem ser considerados para alcançar injeções reprodutíveis. Em primeiro lugar, é essencial ter vidro de alta qualidade agulhas de injecção microcapilar. Se a ponta da agulha é muito grande, a injecção irá criar um orifício de punção grande o suficiente para que ocorra o sangramento eas bactérias injectadas fluirá para fora da circulação sanguínea. Em segundo lugar, as bactérias devem ser injectado directamente para a circulação sanguínea. Se a ponta da agulha não está dentro da veia ou se espalha injecção de fluido para a extensão saco vitelino, o embrião deve ser descartada a partir da experiência. Em terceiro lugar, usando PVP40 como um portador para injectar M. marinum irá ajudar a prevenir as bactérias de afundar-se na agulha de vidro. PVP40 melhora a homogeneidade da suspensão, resultando em inóculos mais reprodutível durante toda a duração de injecções. PVP40 pode também ser utilizado para S. injecções typhimurium, mas aqui, é menos importante, porque o tamanho maior e fluorescência brilhante das bactérias permite um controlo visual sobre o inoculo de injecção durante as experiências. Para praticar as injecções recomenda-se a utilização de fenol corante vermelho (1% v / v) ou 1 mícron esferas fluorescentes disponíveis em cores diferentes (Invitrogen). Uma vez que a técnica é dominada, leva cerca de 30 minutes para injectar 50-100 embriões, incluindo o tempo necessário para alinhar os embriões em placas de agarose e ajustando o volume de injecção bacteriana.

Enquanto injeções intravenosas para a ilha de sangue (protocolo 5) ou no ducto de Cuvier (protocolo 6.1) são os mais usados, as vias alternativas de infecção descritos neste artigo de vídeo têm se mostrado úteis para estudar a quimiotaxia de macrófagos e neutrófilos (protocolos 6.2, 6.3 , e 6,4), para estudar o crescimento de estirpes bacterianas atenuadas (protocolo 6,5), e para adaptar o modelo de infecção do peixe-zebra para aplicações de alto rendimento (protocolo 6,6) ^4-8. As micro-injecção descritos métodos também podem ser aplicados para injecções de vírus ^{18, 19,} esporos de fungos ^{14, 20} ou parasitas protozoários (Maria Forlenza, comunicação pessoal). Uma adição útil para os procedimentos de injecção descritos neste artigo de vídeo é um procedimento recentemente descrito para a injecção subcutânea de bactérias em zebrembriões afish ^21. Este procedimento foi aplicado para estudar a fagocitose de bactérias por neutrófilos, que foram encontrados para as bactérias de forma eficiente engolfam em superfícies de tecido, mas, em contraste com os macrófagos, eram virtualmente incapaz de fagocitam bactérias mediante injecção no sangue ou em cavidades cheias de fluido do corpo. Para embriões injecções subcutâneas são posicionados semelhante como para as injecções de cauda musculares descritos neste artigo de vídeo, mas a agulha é inserida debaixo da pele para injectar as bactérias durante um somito.

É importante considerar que a micro-injecção é essencialmente uma rota artificial de infecção. No entanto, os embriões precoces são altamente resistentes à exposição externa para agentes patogénicos bacterianos. De facto, os ensaios de imersão, em que os embriões são banhadas numa suspensão bacteriana, não são reprodutíveis nas nossas mãos ^22. Enquanto alguns embriões podem ser infectados após imersão, temos observado uma grande variação nas taxas de mortalidade e na expressaião de genes marcadores inflamatórios entre os embriões individuais em tais ensaios. Os métodos de micro-injecção descritos neste artigo atingir infecções reprodutíveis e são particularmente úteis para estudar as interacções bacterianas com hospedeiras inatos células imunes. Uma abordagem eficiente para quantificar a infecção bacteriana em embriões individuais é analisar as imagens fluorescentes de embriões infectados com custom-made software de quantificação, dedicado pixels ^{17, 23.} Esta abordagem tem sido demonstrado que se correlacionam bem com os resultados das contagens de UFC após o plaqueamento de embriões infectados. Da mesma forma, mudanças relativas no número de leucócitos por embrião foram quantificados pela análise de imagem digital em transgênicos leucócitos linhas repórter fluoróforo; esta abordagem seria aplicável para quantificar a resposta do hospedeiro à infecção leukopoietic ^24.

A função do hospedeiro inatos genes imunes podem ser investigadas eficientemente in vivo através da combinação dos modelos de infecção descritascom knockdown morfolino. Morpholinos são oligonucleótidos anti-sentido sintéticos que têm como alvo RNAs específicos e reduzir a expressão dos produtos dos genes quando injectado 1 de células de embriões peixe-zebra fase, como mostrado na outros artigos de vídeo nesta revista ^{10, 25.} Em estudos knockdown morfolino, é de grande importância que todos os grupos de embriões a serem comparadas são testados correctamente antes de injecções bacterianas. Isto é especialmente importante porque os embriões têm um desenvolvimento do sistema imunitário que se torna cada vez mais competente ao longo do tempo.

Existem várias linhas transgénicas repórter actualmente disponíveis para distinguir os principais inatos subconjuntos imunes, macrófagos e neutrófilos, em embriões de peixe-zebra. A MPX e promotores LYZ têm sido usados ​​para gerar as linhas de repórter de neutrófilos ^{16, 26, 27,} eo csf1r (SFM) e MPEG1 promotores foram usados ​​para produzir repórteres de macrófagos ^{14, 28.} Enquanto csf1r (FMS) é adicionalmente expressa em xanthophores, mpeg1 expressão é exclusivamente nos macrófagos. Como mostrado neste artigo de vídeo, os recentemente desenvolvidos mpeg1 linhas repórter são altamente úteis para a fagocitose de imagem bacteriana por macrófagos.

Os autores não têm nada a revelar.

Os autores gostariam de agradecer Cui Chao, Andar de Kort, Stoop Esther e Ralph Carvalho de imagens na Figura 4, Nehrdich Ulrike e de Davy Witt para cuidado dos peixes, e os membros do laboratório para outras discussões úteis. Este trabalho é apoiado pelo Programa Mix inteligente do Ministério neerlandês dos Assuntos Económicos e do Ministério da Educação, Cultura e Ciência, a Comissão Europeia sétimo projeto quadro ZF-SAÚDE (SAÚDE-F4-2010-242048), o Europeu Marie-Curie Formação inicial Rede FishForPharma (PITN-GA-2011-289209), e pelo NHMRC australiano (637.394). O australiano Medicina Regenerativa Institute é suportado por concessões do Governo do Estado de Victoria e do governo australiano.

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