Die Infektion von Zebrafisch-Embryos mit Intrazelluläre bakterielle Krankheitserreger

Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (61), e3781, doi:10.3791/3781 (2012).

Zebrafisch (Danio rerio) Embryonen werden zunehmend als ein Modell zur Untersuchung der Funktion des Wirbeltier angeborenen Immunsystems im Wirt-Pathogen-Interaktionen ¹ verwendet. Die wichtigsten Zelltypen des angeborenen Immunsystems, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, in den ersten Tagen der Embryogenese vor der Reifung von Lymphozyten, die für adaptive Immunantworten benötigt werden, zu entwickeln. Die Leichtigkeit, an eine große Zahl von Embryonen, deren Zugänglichkeit durch äußere Entwicklung, die optische Transparenz der Embryonal-und Larvenstadien, ein breites Spektrum an genetischen Werkzeugen, umfangreiche Ressourcen und Mutanten-Sammlungen von transgenen Reporter Linien, die alle auf die Vielseitigkeit des Zebrafisch hinzufügen Modell. Salmonella enterica Serovar Typhimurium (S. typhimurium) und Mycobacterium marinum kann intrazellulär wohnen in Makrophagen und werden häufig verwendet, um Wirt-Pathogen-Interaktionen in Zebrafisch-Embryos zu studieren. Die Infektion dieser beiden Prozessebakterielle Erreger sind interessant zu vergleichen, weil S. typhimurium Infektion akut und tödlich innerhalb eines Tages, während M. marinum Infektion chronisch und kann bis zum Larvenstadium ^{2, 3} abgebildet werden. Der Standort der Mikro-Injektion von Bakterien in den Embryo (Abbildung 1) legt fest, ob die Infektion rasch zu systemischen oder wird zunächst lokalisiert bleiben. Eine schnelle systemische Infektion kann gegründet werden durch Mikro-Injektion von Bakterien direkt in den Blutkreislauf über die Schwanzvene Blut an der hinteren Insel oder über den Kanal von Cuvier, eine weite Verbreitung Kanal auf dem Dottersack verbindet das Herz mit dem Stamm Gefäßsystem. Bei 1 dpf, wird, wenn Embryonen in diesem Stadium phagocytically aktiven Makrophagen haben aber Neutrophile sind noch nicht ausgereift, Einspritzen ins Blut Insel bevorzugt. Für Injektionen bei 2-3 dpf, wenn Embryonen auch funktionelle (Myeloperoxidase-produzierenden) Neutrophile, entwickelte der Kanal von Cuvier als t bevorzugter an der Injektionsstelle. Um gerichtete Wanderung von myeloischen Zellen gegenüber lokalen Infektionen zu studieren, können Bakterien in den Schwanz Muskel-, Ohr-Vesikel, oder Hinterhirn Ventrikel ^4-6 injiziert werden. Darüber hinaus ist die Chorda, eine Struktur, die normalerweise nicht zugänglich myeloischen Zellen erscheint, ist sehr anfällig für lokale Infektion ^7. Eine sinnvolle Alternative für Anwendungen mit hohem Durchsatz ist die Injektion von Bakterien in den Dotter von Embryonen innerhalb der ersten ⁸ Stunden nach der Befruchtung. Die Kombination fluoreszierende Bakterien und transgenen Linien mit fluoreszierender Zebrafisch Makrophagen oder Neutrophilen schafft ideale Voraussetzungen für Multi-Color-Imaging von Wirt-Pathogen-Interaktionen. Dieses Video Artikel wird detaillierte Protokolle für die intravenöse und lokale Infektion von Zebrafisch-Embryos mit S. beschreiben typhimurium oder M. marinum Bakterien und für die anschließende Fluoreszenz-Imaging von der Interaktion mit Zellen des angeborenen Immunsystems.

1. Bereiten Injektionsnadeln

1. Bereiten Borosilikatglas Mikrokapillare Injektionsnadeln (Harvard Apparatus, 300038, 1 mm AD x 0,78 mm ID) mit einer Mikropipette Abziehvorrichtung (Sutter Instruments Inc., Flaming / Braun P-97 mit den folgenden Einstellungen für einen längeren Tipp: Luftdruck 400; Wärme 610; Pull 40; Geschwindigkeit 50; Zeit 30 und mit den folgenden Einstellungen für einen kürzeren Tipp: Luftdruck 500; Wärme 510; Pull 100; Geschwindigkeit 200; Zeit 60).
2. Brechen Sie die Nadelspitze mit einer feinen Pinzette, eine Spitzenöffnung Durchmesser von 5-10 um zu erhalten. Es ist ratsam, Kegelrad die Nadelspitze Öffnung an einem 45 Grad Winkel mit einem microgrinder (Narishige Inc., EG-400), um eine schärfere Spitze zu ergeben. Dies erleichtert die Punktion der Epidermis und somit in reproduzierbarer Injektionen mit weniger Gewebeschäden als mit stumpfen Nadeln führen. Längere Nadeln bestückt sind für Schwanzvene (Schritt 5) und Duct von Cuvier (Schritt 6.1) Injektionen und kürzere Nadeln bestückten bevorzugtFür die anderen Injektionsprotokolle (Schritte von 6,2 bis 6,6) bevorzugt.

2. Bereiten S. typhimurium Inokulum

1. Platte aus S. typhimurium aus einer -80 ° C Glycerin-Stammkultur auf LB-Agarplatten (mit geeigneten Antibiotika für Fluoreszenz Expressionsvektoren auswählen) und Inkubation über Nacht bei 37 ° C
2. Haupt einzelnen Fluoreszenz positiven Kolonien und Resuspension sie auf die gewünschte Konzentration (siehe Protokolle 5 und 6) in steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS), gegebenenfalls mit 0,085% (v / v) Phenolrot (Sigma-Aldrich) zur Unterstützung der Visualisierung Einspritzvorgang. Direkt mit der frischen Suspension zur Injektion oder bereiten Glycerol Stocks. Um Glycerol Stocks vorzubereiten, drehen Sie den frisch gebackenen Injektion Lager mit der gewünschten Konzentration von Bakterien und konzentrieren sich die Aktie durch Resuspendieren des Pellets in der Hälfte des Ausgangsvolumens in sterilen 20% (v / v) Glycerin (Sigma-Aldrich) in PBS. Bewahren Sie das Glycerin Lager bei -80 ° C Verdünnen der Glycerin-Stammkultur 1:1 (v / v) vor der Injektion in sterilem PBS, die 0,17% gegebenenfalls Phenolrot.
3. Vortex die Bakteriensuspension gut zur Vermeidung von Klumpenbildung.
4. Laden Sie das Inokulum in die Mikrokapillare Nadel mit einem Microloader Spitze (Eppendorf, 5242956,003).
5. Aufgrund der relativ großen Größe von S. typhimurium Bakterien und ihre helle Ds-Rot-Fluoreszenz bei der Verwendung des pGMDs3 Expressionsvektor ³ (Stamm auf Anfrage erhältlich) lassen sich einzelne Bakterienzellen leicht mit einem Fluoreszenz-Stereomikroskop gezählt werden, um die Injektion Dosis einzustellen. Zu diesem Zweck injizieren 1 nL in einem Tropfen PBS auf einer Agarplatte, zähle die fluoreszierenden Bakterien, und berechnen Sie die Einspritzmenge, die erforderlich sind, um die gewünschte bakterielle Dosis (vorzugsweise halten das Injektionsvolumen zwischen 1-2 nL) erhalten wird. Injizieren Sie den Embryonen mit S. typhimurium über die ausgewählte Route (siehe Protokolle 5 und 6).

3. Vorbereiten

1. Halten Sie den M. marinum Stamm wächst auf Difco Middlebrook 7H10-Agar (BD und Unternehmen) mit 10% Ölsäure-Albumin-Dextrose-Katalase (OADC, BD und Unternehmen), 0,5% Glycerin, und mit geeigneten Antibiotika ergänzt, um für die Fluoreszenz-Expressionsvektoren wählen (Stämme verfügbar auf Anfrage ^9), so gibt es immer einen frischen Vorrat.
2. Wählen Sie eine Kolonie von M. marinum und resuspendieren es in Difco Middlebrook 7H9-Bouillon (BD und Unternehmen) mit 10% Albumin-Dextrose-Katalase (ADC, BD und Unternehmen) und 0,05% Tween 80 (Sigma-Aldrich) und den entsprechenden Antibiotika ergänzt. Prüfen, ob die optische Dichte (OD) bei 600 nm ist 0,2 - 0,3 und wachsen lassen statisch über Nacht bei 28,5 ° C. Die Generationszeit von M. marinum beträgt ca. 4-6 h, je nach der Belastung.
3. Messen der OD bei 600 nm wieder am Tag der Injektion. Eine OD600 von 1 entspricht etwa 10 ⁸ M. marinum / ml(Wobei diese je nach verwendetem Bakterienstamm variieren und so sollte auf einer Wachstumskurve für den jeweiligen Stamm basieren).
4. Ernten Sie die Bakterien, wenn sie in der logarithmischen Phase (lassen Sie sich nicht die OD600 überschreiten 1,00) durch Zentrifugation und Waschen sie dreimal in sterilem PBS sind.
5. Messen der OD 600 wieder der bakteriellen Suspension in PBS, Spin-down-und Resuspension der Bakterien auf die gewünschte Konzentration (siehe Protokolle 5 und 6) in PBS oder in 2% Polyvinylpyrrolidon (PVP40) in PBS (w / v), die Homogenität verbessert der Bakteriensuspension. Phenolrot (Sigma-Aldrich) kann auf eine Konzentration von 0,085% bis zur Visualisierung der Einspritzung zugesetzt werden. Direkt mit der frischen Suspension zur Injektion oder bereiten Glycerol Stocks. Zur Herstellung von Glycerin Aktien drehen Sie den frisch gebackenen Injektion Lager mit der gewünschten Konzentration von Bakterien und konzentrieren sich die Aktie durch Resuspendieren des Pellets in der Hälfte des Ausgangsvolumens in sterilen 20% Glycerin in PBS. Bewahren Sie die GlycErol Lager bei -80 ° C Verdünnen der Glycerin-Stammkultur 1:1 (v / v) in sterilem PBS, gegebenenfalls mit 4% PVP40 und / oder 0,17% Phenolrot.

4. Bereiten Zebrafischembryonen für Injektionszwecke

1. Richten Sie Zebrafisch Brutpaare und sammeln Embryonen als in einem anderen Video Artikel ¹⁰ gezeigt. Halten Embryonen in einer Petrischale mit Ei Wasser (60 ug / ml Meersalz.; Ca. 60 Embryonen / Schale) gefüllt und inkubieren bei 28,5 ° C.
2. Falls erforderlich, fügen 0,003% N-phenylthioharnstoff (PTU, Sigma-Aldrich) in das Ei Wasser, wenn die Embryonen etwa 12 hpf sind Melanisierung verhindern.
3. Rund 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF), dechorionate die Embryonen mit einer feinen Pinzette (Fine Science Tools Inc., Dumont Nr. 5 Pinzetten - Inox Biologie.
4. Halten Sie die Embryonen in einer Petrischale mit Ei und Wasser mit einer Schicht von 1% Agarose auf der Unterseite Embryonen aus Festhalten an der Kunststoffoberfläche verhindern gefüllt.
5. Betäuben die Embryonen mit 200 ug / ml gepufferte 3-Aminobenzoesäure (Tricaine, Sigma-Aldrich) ca. 10 min vor Injektionen.

5. Die intravenöse Injektion von Bakterien in One-Tage alten Embryonen

1. Verfahrensstadium die Embryonen bei 28 HPF ^11, indem Sie für die konsequente Durchblutung, Anfang der Pigmentierung im Auge, einen geraden Schwanz, und das Herz wird gerade ventral zum Auge positioniert.
2. Betäuben die Embryonen, siehe Schritt 4.5.
3. Legen Sie die Nadel mit der bakteriellen Inokulums mit einem Microloader Spitze.
4. Montieren Sie den geladenen Nadel auf einem Mikromanipulator (Sutter Instrument, MM-33) mit einem Stand (World Precision Instruments, M10L magnetischen Standfuß) und positionieren Sie es unter einem Stereomikroskop (Leica M50, Achromat 1x 0,15 NA Objektiv, Durchlicht-Basis TL ST). Stellen Sie die Einspritzzeit bis 0,2 s und die Entschädigung Druck bis 15 hPa (Eppendorf, FemtoJet). Einstellen der Einspritzdruck zwischen 700 und 900 hPa, um die korrekte Injektionsvolumen für die Nadel zu erhaltenverwendet. Stellen Sie die Tropfengröße, um die gewünschte Durchmesser mit Hilfe eines Maßstab auf einem Objektträger oder in der okularen anzeigen lassen. Für die Bestimmung der Größe Drop lassen sich in Mineralöl auf einem Objektträger injiziert werden, oder die Größe kann durch Injektion in die Luft, die den Tropfen hängt an der Nadelspitze verlässt geschätzt werden. Der Radius eines Tropfens 1 nl beträgt 0,062 mm (V = 4/3 π r ^3).
5. Stellen Sie die Mikromanipulator mit dem geladenen Nadel in die richtige Position vor dem Einspritzen (dh ungefähr in einem 45 ° Winkel in Bezug auf die Injektion Plattenoberfläche) und nur bewegt werden, hin und her zu injizieren.
6. Die narkotisierten Embryonen werden auf eine flache 1% igen Injektion Platte und überschüssiges Wasser entfernt Ei pipettiert, so dass die Oberflächenspannung, die Embryonen in Position zu halten während der Injektionen. Verwenden Sie eine Schleife Haar-Werkzeug (Abbildung 2) antreten, die Embryonen. Richten Sie die Injektion Platte von Hand während Injektionen, um die Embryonen in die bevorzugte Position zu bringen für inserting der Nadel, dh mit ihren Schwänzen weisenden der Nadelspitze.
7. Legen Sie die Nadelspitze direkt über die Schwanzvene der Nähe des urogenitalen Öffnung (Abbildung 1A), durchbohren die Periderm mit der Nadelspitze und spritzen Sie die gewünschte Dosis von Bakterien, verwenden wir ca. 250 KBE von S. typhimurium Wildtyp (wt)-Stamm SL1027, mit dem DS-RED Expressionsvektor pGMDs3, und ca. 120 KBE M. marinum Belastung Mma20. Die injizierte Bakteriensuspension wird der Blutstrom durch die Schwanzvene zum Herzen hin zu folgen. Ãœberwachen, ob die Injektion vollständig durch Prüfen einer erweiterten Volumens des Gefäßsystems direkt nach dem Puls ² durchgeführt. Für Dosis-Wirkungs-Experimenten kann 2-3 aufeinander folgenden Injektionen ohne Extraktion der Nadel durchgeführt werden.
8. Überprüfen Sie regelmäßig, dass das Injektionsvolumen der gleiche bleibt während des Experiments. Um ein Steuerelement für die Konsistenz der Injektionen während des ganzen Experiments liefern, injizieren einen drop von Bakterien direkt in ein steriles PBS Drop auf das Bakterienwachstum Medium nach etwa jeder ^30. Embryo Injektion. Platten aus diesem Tropfen und zählen die Bakterienkolonien nach der Inkubation, um die Kolonie bildenden Einheiten (KBE) in dem Injektionsvolumen zu bestimmen.
9. Verwenden Sie einen Fluoreszenz-Stereomikroskop (Protokoll 7), einzelne fluoreszierende S. beobachten typhimurium-Zellen im Blutkreislauf direkt nach der Injektion, und entsorgen Embryonen, die nicht ordnungsgemäß injiziert. Einzelne fluoreszierende M. marinum Bakterien können nicht von Stereo-Fluoreszenzmikroskopie direkt nach Injektionen beobachtet werden, aber fluoreszierende Aggregate von infizierten Zellen sichtbar sein soll um 2 Tage nach der Infektion (dpi) und größer werden mit der Zeit.

6. Alternative Infektionswege

1. Duct von Cuvier Injektion: Line-Up narkotisierten Embryonen (2-3 dpf) auf einer ebenen 1% Agarose-Platte als Injektion für Schwanzvene Injektionen (siehe 5.6). Richten Sie die spritzenIonen-Platte von Hand während Injektionen, um die Embryonen in die bevorzugte Position zu bringen für das Einsetzen der Nadel, also schräg unter einem Winkel von 45 °, so dass der Kanal von Cuvier von der Nadelspitze von der dorsalen Seite des Embryos angefahren werden kann (Abbildung 1B) . Legen Sie die Nadel in den Ausgangspunkt des Kanals von Cuvier nur dorsal der Stelle, wo der Kanal beginnt die Erweiterung über den Dottersack und injizieren 100-200 Bakterien (1-3 NL). Die Injektion ist korrekt, wenn das Volumen innerhalb des Kanals erweitert direkt nach dem Puls und der Dottersack ist nicht gerissen. Wie für Schwanzvene Injektionen (siehe 5.7), können mehrere Injektionen nacheinander ohne Extraktion der Nadel durchgeführt werden.
2. Hinterhirn Ventrikel Injektion: Line-Up narkotisierten Embryonen (32 HPF) auf einer ebenen 1% igen Injektion Platte derart, dass die Embryonen mit ihren dorsalen Seite in Richtung der Nadelspitze positioniert sind. Legen Sie die Nadel in die Ventrikel Hinterhirn von einer anterioren Position, ohne den neuroepithelium (1C) und injizieren 20-100 Bakterien (0,5-1 NL). Um das Verfahren zu praktizieren, verwenden Sie ein Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Texas-Red Dextran), wie in einem anderen Video Artikel ¹³ gezeigt.
3. Rute Muskel-Injektion: Position narkotisierten Embryonen (1-2 DPF) für Schwanzvene Injektionen (siehe 5.6). Stellen Sie die Mikromanipulator mit dem geladenen Nadel in einem Winkel von etwa 65 ° mit Bezug auf den Injektionsstrom Plattenoberfläche. Injizieren einer Bakteriensuspension (0.5-1 nL) mit 20 bis 50 cfu in den Muskel oberhalb des urogenitalen Öffnung (1D), ohne dass Schäden an der Chorda oder Blutgefäße.
4. Otic Vesikel Injektion: Position narkotisierten Embryonen (2-3 DPF) für Schwanzvene Injektionen (siehe 5.6). Stellen Sie die Mikromanipulator mit dem geladenen Nadel in einem Winkel von etwa 65 ° mit Bezug auf den Injektionsstrom Plattenoberfläche. Spritzen Sie ca. 20 Bakterien (0,5 nL) in das Ohr Vesikel (1E) mit niedrigen Drückenure auf lokale Gewebe Bruch zu vermeiden.
5. Chorda Injektion: Line-Up narkotisierten Embryonen (1-2 dpf) auf einer ebenen 1% igen Injektion Platte derart, dass die Embryonen mit ihrem Schweif zeigt weg von der Spitze der Kanüle positioniert sind. Führen Sie die Nadel durch den Schweif Muskelgewebe in die Chorda (1F) und spritzen ca. 20-50 Bakterien (maximal 0,5 NL). Achten Sie darauf, nicht zu viel Volumen zu injizieren, um Ruptur der Chorda zu vermeiden.
6. Eigelb Injektion: Position Eier, die Embryonen im 16-1000 Zell-Stadium auf einem 1% Agarose Einspritzen Platte mit rechteckigen oder V-förmige Kanäle mit einem Kanal Form ¹² oder verfügbar gemacht http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . Pierce die Nadel durch die Chorion in die Mitte des Eigelbs (1G) und Injizieren von 20 bis 40 Bakterien (1-2 nL). Die Verwendung von 2% PVP40 Trägerlösung für die Bakteriensuspension (siehe Schritt 3.5)ist wichtig, frühzeitig bakterielle Ausbreitung in den Embryo zu verhindern.

7. Stereo-Imaging der Infektion

1. Betäuben die infizierten Embryonen in einem 1% igen geschichteten Petrischale mit Wasser, das Ei Tricaine (siehe 4.5) abgedeckt.
2. Ausrichten der Embryonen in der richtigen Position zum Abbilden unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop mit einem Haar-Schleife Werkzeug (2). Bevor der Schwimmblase hat aufgeblasen (1-5 dpf), werden die Embryonen flach auf ihren Seiten ermöglicht Seitenansicht Bildgebung.
3. Wenn eine andere Position als die seitliche Sicht erforderlich, montiert auf die Embryonen in 1,5% Methylcellulose. Manipulieren Sie den Embryo in die gewünschte Position mit einem Haar-Schleife-Werkzeug (Abbildung 2).
4. Zurück zu den Embryonen Ei Wasser nach der Bebilderung.

8. Konfokale Bildgebung der Infektion

1. Geben Sie einen Tropfen Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (Lonza Inc., 1,5% (w / v) in Ei-Wasser) auf dem Glasboden einesWillco-Schale (Willco Wells, GWSt-5040), wenn ein invertiertes konfokalen Mikroskop verwendet wird, oder auf einem einzigen Hohlraum Vertiefung Schieber (Agar Scientific, L4090), wenn eine aufrechte konfokalen Mikroskop verwendet wird.
2. Setzen Sie den narkotisierten Embryo in die Agarose Drop mit begrenzten Ei Wasser und zu manipulieren, den Embryo in die richtige Position mit einem Haar-Schleife-Werkzeug (Abbildung 2). Bei Verwendung eines inversen Mikroskops ist es wichtig, dass des Embryos region of interest flach gegen den Glasboden des abbildenden Gericht ist. Einem aufrechten Mikroskop kann in Kombination mit Eintauchen in Wasser oder Ferngespräche trocken Ziele eingesetzt werden und der Embryo sollte so positioniert, dass die Region von Interesse, da in der Nähe der objektiv wie möglich ist.
3. Lassen Sie die Agarose erstarren und tauchen Agarose Tropfen in Wasser, das Ei Tricaine (siehe 4.5). Wenn einem aufrechten Mikroskop verwendet wird, legen Sie ein Deckglas auf der Oberseite der Depression Hohlraum (nicht erlauben Luftblasen zu bilden).
4. Sequenziell erwerben Grippeorescence und Ãœbertragung Bildern.
5. Entfernen Sie vorsichtig die Agarose aus dem Embryo mit feinen Pinzetten und platzieren Sie den Embryo wieder in Ei Wasser, wenn es für weitere Experimente erforderlich ist.

9. Repräsentative Ergebnisse

Die Injektion von Salmonella typhimurium oder Mycobacterium marinum Bakterien in das Blut Insel Embryonen 1 dpf führt zur schnellen Phagozytose durch Makrophagen. Die MPEG1-Gen wurde vor kurzem als treuer Marker embryonaler Makrophagen identifiziert worden, kolokalisierendes mit dem gut etablierten Makrophagen-Marker CSF1R (FMS) und nicht überlappend mit neutrophilen Marker wie MPX (MPO) und Lyz ^{4, 14.} Für die Live-Darstellung von Bakterien Phagozytose wir transgenen Linien eingesetzt, in dem der MPEG1-Promotor treibt fluoreszierende Protein-Expression in Makrophagen ^14. Diese transgenen Linien entweder die MPEG1-Promoter fdirekt mit dem GFP-Gen verwendet, oder von einem Zwei-Komponenten-System, wo die MPEG1-Promotor steuert die Expression des Hefe Gal4-Transkriptionsfaktor, ein zweites Transgen mit dem Gal4-Erkennungssequenz (FH, stromaufwärts aktivierenden Sequenz), fusioniert an das Gen aktiviert Kaede. Wenn das Blut Insel Injektion (Protokoll 5; Abbildung 1A) korrekt durchgeführt wird, werden die Bakterien sofort über den Blutkreislauf fließen und verbreitete sich in den Embryo. Die Verbreitung des relativ groß und hell fluoreszierende Ds-Red markierten S. typhimurium Bakterien können direkt mit einem Stereo-Fluoreszenzmikroskop (3A) und konfokale Abbildung bei 2 hpi zeigt, dass viele Bakterien durch Fluoreszenz Makrophagen (3B-C) phagozytiert abgebildet werden. Die Injektion von weniger als 25 KBE von Wildtyp-S typhimurium Bakterien in einer letalen Infektion führen, während eine ähnliche Dosis von Bakterien eines avirulenten sZug, wie Ra, kann durch die embryonalen Immunsystems ³ gelöscht werden. Injektionsvorrichtung Dosis von 250 cfu wurde verwendet, um transkriptioneller Antworten auf S zu berechnen typhimurium-Infektion im Zebrafisch und demonstrierten die Induktion einer starken pro-inflammatorischen Genexpression bereich ^15. Im Gegensatz dazu die intravenöse Injektion von M. marinum Bakterien nicht entlocken eine starke pro-inflammatorischen Reaktion, führt aber zu einer persistierenden Infektion, wo infizierte Makrophagen bilden dichte Aggregate, die als Anfangsstadium der Granulome, die das Kennzeichen der Tuberkulose sind ² berücksichtigt werden. Konfokale Abbildung eines solchen Granulom-ähnliche Aggregat in der Tg (MPEG1: EGFP) gl22 Linie ¹⁴ dpi bei 5 zeigt das intrazelluläre Wachstum von mCherry-markierten M. marinum Bakterien im Inneren der grün fluoreszierenden Makrophagen (Abbildung 3D-E).

Otihre Infektionswege sind für verschiedene Zwecke nützlich. Bakterien können in die Herzkammer Rautenhirn bei 32 HPF (1C), die eine Kammer frei von Makrophagen injiziert werden. Injektion von 20-100 mCherry-markierten M. marinum Bakterien in dieser Kammer führt zur schnellen Infiltration von Makrophagen, die die Bakterien (4A) phagozytieren. Eine andere Methode, um die gerichtete Wanderung von Zellen des angeborenen Immunsystems zu studieren ist die Injektion von Bakterien in den Schwanz Muskel (Abbildung 1D). Allerdings Schwanz Muskel Injektionen auch das Gewebe schädigen, dass von selbst löst einige Attraktion von Leukozyten. Eine solche Verletzung Reaktion sorgfältig vermieden werden, wenn Einspritzen einer kleinen Menge (0,5-1 nL) in die Ohr-Vesikel (1E) werden. I114 Linie ^16, Injektion von etwa 20 cfu von S.: Wie hier mit der Tg (EGFP MPX) gezeigt typhimurium in das Ohr Vesikel führt zu der Attraktion von Neutrophilen bei 3 HPI ( (4E) beobachtet. Die Chorda, die sich als resistent gegen die Infiltration von Leukozyten erscheint, ist eine permissive Fach für das Wachstum von M. marinum Mutanten, die stark gedämpft sind, wenn in anderen Geweben ⁷ injiziert; (4F). Schließlich frühen Injektion von M. marinum in den Dotter von Embryonen stellt eine alternative Methode, um eine systemische Infektion zu erreichen. Wir führen diese in der Regel um die 16 Injektionen Zell-Stadium (Abb. 1G), aber bakterielle Injektionen in das Eigelb kann auch in späteren Phasen durchgeführt werden (bis zum 1000-Zell-Stadium), oder früher (1 bis 8-Zell-Stadium) für Co-Injektionen mit Morpholinos ^8. Nach Eigelb mit einer Dosis von 20-40 KBE, M. marinum Bakterien über mehrere Tage in die embryonalen Gewebe und Form Granulom-ähnliche Aggregate ähnlich wie bei der konventionellen beobachtet verbreitenintravenöse Injektion Methode ^8; (4G). Der Dotter Injektion Methode ist nicht geeignet für S. typhimurium-Infektion, weil ihr rasantes Wachstum im Eigelb bewirkt, dass frühe Letalität. Der Dotter Infektion Methode für M. marinum Infektion wird für Anwendungen mit hohem Durchsatz nützlich, da es kann automatisiert mit Hilfe eines Roboters ⁸ Injektion werden.

Abbildung 1. Übersicht von Einspritzverfahren zum Herstellen einer systemischen oder lokalen Infektionen im Zebrabärbling verwendet. (AB) Intravenöse Injektionen zur Herstellung einer schnellen systemischen Infektion in die Schwanzvene am hinteren Blut Insel 1 dpf (A) oder in den Ductus Cuvier bei durchgeführt 2-3 dpf (B). (CE) lokale Injektionen für die Untersuchung von Makrophagen und Neutrophilen-Chemotaxis in der Rautenhirn Ventrikel 1 dpf (C) durchgeführt, Der Schwanz Muskel bei 1-2 DPF (D) oder das Ohr Vesikel bei 2-3 DPF (E). (F) Injektionen, um eine Infektion scheinbar unzugänglich Phagozyten zu schaffen sind in der Chorda bei 1-2 DPF durchgeführt. (G) Injektionen, um einen frühen systemischen Infektion mit langsam wachsenden Bakterien wie M. erstellen marinum kann in den Dotter am 16-1000 Zell-Stadium durchgeführt werden. Alle Bilder wurden mit einem Leica M165C, PlanApo 1.0x mit einem Leica DFC420 Kamera (Leica 0,8 x 10446307) übernommen.

Abbildung 2. Haar-Schleife-Tool. Ein Stück menschliches Haar ist wie eine Schleife in die Öffnung einer Pasteurpipette eingelegt und fixiert mit Sekundenkleber oder mit Tipp-Ex. Dies gewährleistet einen komfortablen Werkzeug für die Manipulation leicht zerbrechlich Zebrafischembryonen.

Abbildung 3. Intravenöse Injektionen vonrot fluoreszierenden Salmonella typhimurium und Mycobacterium marinum. Ds-Red-markierten S. typhimurium SL1027 Bakterien (AC) und mCherry-markierten M. GL24; Tg (UAS-E1b: Kaede): marinum Mma20 Bakterien (DE) wurden in das Blut Insel Tg (Gal4-VP16 MPEG1) injiziert s1999t (AC) oder Tg (MPEG1: EGFP) gl22 (DE) Zebrafischembryonen bei 28 hpf. (A) Stereo-Fluoreszenz-und Hellfeld-Overlay-Bild zeigt die Verbreitung von S. typhimurium in der Blutzirkulation bei 2 HPI (Leica MZ16FA Mikroskop mit Kamera Leica DFC420C). (BC) Konfokale Z-Stapel-Projektionen zeigen rote S. typhimurium Bakterien durch Makrophagen grün bei 2 HPI (Leica TCS SPE, HCX APO Objektiv 40x 0,8 NA) phagozytiert. Bakterien, die noch extrazellulären kann auch beobachtet werden. (D) Konfokale Z-Stapel-Projektion zeigt eine Granulom-ähnliche Aggregat mit M. marinum Mma20-infizierten und nicht infizierten Makrophagen bei 5 dpi (Leica TCS SPE, HCX APO 40x0,8 NA). Makrophagen in grün und Bakterien in rot. (E) Konfokale Z-Stapel-Projektion eines einzelnen Makrophagen (grün) mit intrazellulären M. marinum Bakterien (rot). Das Gebiet, in D durch ein weißes Rechteck dargestellt wurde mit einer höheren Vergrößerung Objektiv (Leica TCS SPE, HCX PL APO 63x NA 1,2) abgebildet. Scalebars: 20 um.

Abbildung 4. Alternative Wege zur Infektion von Zebrafisch-Embryonen. (A) mCherry-markierten M. marinum Mma20 Bakterien wurden in das Hinterhirn Ventrikel bei 32 HPF injiziert. Fluoreszenz und Transmission Overlay-Bild zeigt mCherry-markierten Bakterien durch Makrophagen bei 5 HPI (Leica TCS SPE, HCX PL FLUO TAR 40.0x 0,7 NA) phagozytiert. (B) S. Typhimurium wurde in den Schwanz Muskel bei 1 dpf injiziert. Anziehung von myeloischen Zellen gegenüber der Injektionsstelle (weißer Kreis) wird auf 3 HPI von f gezeigtluorescent in situ Hybridisierung ^4, (C), während im nicht-injizierten Embryonen gibt es normalerweise keine myeloiden Zellen in diesem morphologischen Seite. Obwohl die Embryonen nicht enthalten reifen Neutrophilen in dieser Phase können zwei Populationen von myeloischen Zellen unterschieden werden, ein Ausdruck des Makrophagen-Marker mfap4 (rot) und ein Ausdruck der neutrophilen Marker MPX (grün) (Leica TCS SPE, HC PL FLUOTAR 10,0 x 0,3 NA). Die Fluoreszenz der Bakterien nach dem In-situ-Hybridisierungsverfahren verloren. (D) Ds-Red-markierten S. i114 Zebrafisch bei 2 DPF: typhimurium Bakterien wurden in das Ohr Vesikel von Tg (EGFP MPX) injiziert. Stereo-Fluoreszenz und Hellfeld-Overlay-Bilder zeigen, dass mpx: EGFP markiert Neutrophilen Zellen des infizierten Ohr Vesikel (gestrichelte Ellipse) bei 3 hpi angezogen werden, (E) während Steuerung Injektion von PBS in die Vesikel Ohr von Tg (MPX: EGFP ) i114 Zebrafisch zeigt keine Attraktion von Neutrophilen zu den nicht infizierten Ohr vesicle (gestrichelte Ellipse) (Leica MZ16FA mit Leica DFC420C Kamera). (F) mCherry-markierten M. marinum Bakterien des abgeschwächten E11 eccCb1 :: tn mutierten Stamm ¹⁷ wurden in der Chorda bei 1 dpf injiziert. Die Proliferation innerhalb der Chorda wurde bei 5 dpi (Leica MZ16FA Mikroskop mit Kamera DC500) abgebildet. (G) mCherry-markierten M. Linie, die GFP exprimiert in den Endothelzellen der Blut-und Lymphgefäße: marinum E11 Bakterien wurden in den Dotter von 16-Zell-Stadium Zebrafischembryonen der Tg (EGFP fli1a) injiziert. Die Bildung von Granulom-ähnliche Aggregate aus infizierten Zellen im Heckbereich befindet sich in 5 dpi beobachtet (Leica MZ16FA Mikroskop mit Kamera Leica DFC420C; Bild von ^8).

Die Infektion Methoden in diesem Artikel beschrieben werden häufig verwendet, um die Funktion des Host angeborenen Immunität Gene oder bakteriellen Virulenz-Gene ^{1 studierst.} Die intravenöse Injektion Mikro-Methoden (Protokolle 5 und 6.1) werden am häufigsten für solche Untersuchungen eingesetzt. Die Schwanzvene Blut an der hinteren Insel ist die bequemste Lage für die intravenöse Injektion von 1-Tage alten Embryonen. Da die Schwanzvene wird es schwieriger, in späteren Phasen durchdringen, bevorzugen wir den Kanal von Cuvier als intravenöse Injektion Standort für Embryonen bei 2-3 dpf. In allen Fällen ist es entscheidend, um die Embryonen mit gleichbleibender Anzahl von Bakterien, die durch Plattieren Injektion Inokula für cfu Zählung überprüft werden sollte zu injizieren. Die folgenden Aspekte zu berücksichtigen, um reproduzierbare Injektionen zu erreichen. Erstens ist es wichtig, hochwertige Glas-Mikrokapillare Injektionsnadeln haben. Wenn die Nadelspitze zu groß ist, wird die Injektion einen Reifenschaden Loch groß genug für Blutungen auftreten, erstellen unddie injizierten Bakterien austreten wird der Blutkreislauf. Zweitens muss Bakterien direkt in den Blutkreislauf injiziert werden. Wenn die Nadelspitze ist nicht im Inneren der Vene oder wenn Injektionsflüssigkeit Spreads in den Dottersack Verlängerung, muss der Embryo aus dem Experiment verworfen werden. Drittens, mit PVP40 als Träger zum Einspritzen M. marinum wird verhindert, dass die Bakterien vor dem Versinken in der Glas-Nadel zu unterstützen. PVP40 verbessert die Homogenität der Suspension, was zu mehr reproduzierbare Inokula während der gesamten Dauer der Injektionen. PVP40 kann auch verwendet werden für S. typhimurium Injektionen, aber hier ist es weniger wichtig, weil die größere Größe und helle Fluoreszenz der Bakterien ermöglicht eine visuelle Kontrolle über die Injektion Inokulum während der Experimente. Zum Üben der Injektionen empfehlen wir die Verwendung von Phenol roten Farbstoff (1% v / v) oder 1 um fluoreszierende Kugeln in verschiedenen Farben erhältlich (Invitrogen). Sobald die Technik beherrscht wird, dauert es etwa 30 minutES zu injizieren 50-100 Embryonen, einschließlich der Zeit zum Ausrichten der Embryonen auf Agarose-Platten und das Einstellen der bakteriellen Injektionsvolumen erforderlich.

Während die intravenöse Injektionen in das Blut Insel (Protokoll 5) oder in den Kanal von Cuvier (Protokoll 6.1) am häufigsten verwendet werden, haben die alternativen Routen von Infektionen in diesem Video Artikel beschrieben bewährt, Makrophagen und Neutrophilen-Chemotaxis zu studieren (Protokolle 6.2, 6.3 und 6.4), um das Wachstum von abgeschwächten Bakterienstämmen (Protokoll 6.5) zu studieren, und um das Zebrafisch-Infektion Modell für Anwendungen mit hohem Durchsatz (Protokoll 6.6) ^8.4 anzupassen. Die Mikroinjektion beschriebenen Verfahren können auch zur Injektion von Viren ^{18, 19,} Pilzsporen ^{14, 20} oder Protozoen-Parasiten (Maria Forlenza, persönliche Mitteilung) aufgebracht werden. Eine sinnvolle Ergänzung zu den Injektions-Verfahren in diesem Artikel beschriebenen Video ist ein erst kürzlich beschriebenen Verfahren für die subkutane Injektion von Bakterien in zebrafish Embryonen ^21. Dieses Verfahren angewendet wurde, um die Phagozytose von Bakterien durch Neutrophile, die effizient verschlingen Bakterien auf Gewebeoberflächen wurden gefunden, aber zu studieren, im Gegensatz zu Makrophagen, waren praktisch nicht Bakterien nach der Injektion phagozytieren in das Blut oder in mit Flüssigkeit gefüllten Körperhöhlen. Für subkutane Injektionen Embryonen positioniert sind ähnlich wie bei den Schwanz Muskel Injektionen in diesem Video-Artikel beschrieben, aber die Nadel direkt unter die Haut eingesetzt, um die Bakterien über einen Somiten zu injizieren.

Es ist wichtig zu beachten, dass der Mikroinjektion im wesentlichen eine künstliche Infektionsweg. Allerdings sind frühe Embryonen sehr robust gegen äußere Exposition gegenüber bakteriellen Erregern. In der Tat sind Eintauchen Assays, in denen die Embryonen in einer Bakteriensuspension getaucht werden, nicht reproduzierbar in der Hand ^22. Während einige Embryonen können sich infizieren beim Eintauchen, haben wir eine große Variation in der Mortalitätsraten und in der ausdrücklichen beobachtetion von entzündlichen Marker-Gene zwischen einzelnen Embryonen in solchen Assays. Die Mikro-Injektion Methoden in diesem Artikel beschriebenen erreichen reproduzierbare Infektionen und sind besonders nützlich, um bakterielle Interaktionen mit Host-Zellen des angeborenen Immunsystems zu untersuchen. Ein effizienter Ansatz für die bakterielle Infektion in einzelnen Embryonen zu quantifizieren ist, die Fluoreszenz-Bilder von infizierten Embryonen mit maßgeschneiderten, dedizierten Pixel Quantifizierung Software ^{17, 23} zu analysieren. Dieser Ansatz hat sich gezeigt, eine gute Korrelation mit den Ergebnissen der Keimzahlen nach dem Ausplattieren der infizierten Embryonen. In ähnlicher Weise haben relative Veränderungen in Leukozyten-Zahlen pro Embryo durch digitale Bildanalyse in transgenen Leukozyten-Fluorophor Reporter Linien quantifiziert worden; dieser Ansatz anwendbar wäre, um die Quantifizierung der Host leukopoietische Reaktion auf eine Infektion ^24.

Die Funktion des angeborenen Immunsystems Host-Gene lassen sich effizient in vivo untersucht werden, durch die Kombination der beschriebenen Modelle Infektionmit Morpholino Knockdown. Morpholinos sind synthetische Antisense-Oligonukleotide, die spezifische RNAs ausgerichtet und zur Verringerung der Expression der Genprodukte, wenn sie in 1-Zellen-Stadium Zebrafisch-Embryonen injiziert wie in anderen Video Artikel in dieser Zeitschrift ^{10, 25} gezeigt. In Morpholino Knockdown Studien ist es von großer Bedeutung, dass alle Embryos zu vergleichenden Gruppen richtig inszeniert vor der bakteriellen Injektionen. Dies ist besonders wichtig, da Embryonen eine sich entwickelnde Immunsystem, die zunehmend im Laufe der Zeit wird zuständigen haben.

Es gibt verschiedene transgene Reporter Linien derzeit zur Verfügung stehen die wichtigsten angeborenen Immunsystems Teilmengen, Makrophagen und neutrophilen Granulozyten, in Zebrafisch-Embryos zu unterscheiden. Der MPX und Lyz Promotoren wurden verwendet, um neutrophile Reporter Linien ^{16, 26, 27} erzeugen, und die CSF1R (FMS) und MPEG1-Promotoren wurden verwendet, um zu produzieren Makrophagen-Reporter ^{14, 28.} Während CSF1r (fms) zusätzlich in Xanthophoren ausgedrückt, MPEG1 Expression ausschließlich in Makrophagen. Wie in diesem Video-Beitrag gezeigt, sind die neu entwickelten MPEG1 Reporter Linien sehr nützlich für bildgebende bakterielle Phagozytose durch Makrophagen.

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Autoren möchten Chao Cui danken, Etage de Kort, Esther Stoop und Ralph Carvalho für Bilder in Abbildung 4, Ulrike Nehrdich und Davy de Witt für Fische Pflege, Labor und andere Mitglieder für hilfreiche Diskussionen. Diese Arbeit wird durch die Smart-Mix des niederländischen Wirtschaftsministeriums und des Ministeriums für Bildung, Kultur und Wissenschaft, der Europäischen Kommission 7. Rahmenprogramm Projekt ZF-Health (HEALTH-F4-2010-242048), das Europäische Marie-Curie unterstützt Initial Training Network FishForPharma (PITN-GA-2011-289209), und von der australischen NHMRC (637.394). Das australische Institut für Regenerative Medizin wird durch Zuschüsse der Regierung des Bundesstaats Victoria und der australischen Regierung unterstützt.

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