Infectie van zebravis embryo's met intracellulaire bacteriële pathogenen

Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (61), e3781, doi:10.3791/3781 (2012).

Zebravis (Danio rerio) embryo's worden steeds meer gebruikt als model voor het bestuderen van de functie van de gewervelde aangeboren immuunsysteem in gastheer-pathogeen interacties ^1. De belangrijkste celtypes van het aangeboren immuunsysteem, macrofagen en neutrofielen, ontwikkelen tijdens de eerste dagen van de embryogenese voor de rijping van de lymfocyten die nodig zijn voor adaptieve immuunresponsen. Het gemak van het verkrijgen van een groot aantal embryo's, de toegankelijkheid als gevolg van externe ontwikkeling, de optische transparantie van de embryonale en larvale stadia, een breed scala aan genetische tools, uitgebreide mutant middelen en de collecties van transgene reporter lijnen, dragen allemaal bij aan de veelzijdigheid van de zebravis model. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. typhimurium) en Mycobacterium marinum kan intracellulair wonen in macrofagen en worden vaak gebruikt om gastheer-pathogeen interacties in de zebravis embryo's te bestuderen. De infectie processen beidebacteriële ziekteverwekkers zijn interessant om te vergelijken, omdat S. typhimurium-infectie is acuut en dodelijk binnen een dag, terwijl M. marinum infectie chronische en kan worden afgebeeld tot larvale stadium ^{2, 3.} De site van micro-injectie van bacteriën in het embryo (figuur 1) bepaalt of de infectie snel zal systemische worden of zal in eerste instantie blijven gelokaliseerd. Een snelle systemische infectie kan worden vastgesteld door micro-injectie van bacteriën direct in de bloedsomloop via de caudale ader op het achterste bloed eiland of via het kanaal van Cuvier, een ruime verspreiding kanaal op de dooierzak het aansluiten van het hart naar de stam vaatstelsel. Op 1 DPF, wordt bij het embryo in dit stadium phagocytically actieve macrofagen hebben, maar neutrofielen zijn nog niet gerijpt, injecteren in het bloed eiland de voorkeur. Voor injecties op 2-3 DPF, wanneer embryo's hebben ook functionele (myeloperoxidase-producerende) neutrofielen, ontwikkelde de Duct van Cuvier heeft de voorkeur als thij de plaats van injectie. Om gerichte migratie van myeloïde cellen naar lokale infecties te bestuderen, kunnen bacteriën worden geïnjecteerd in de staart spier, otic blaasje, of achterhersenen ventrikel ^4-6. Bovendien de notochorda, een structuur die lijkt zijn deuren myeloïde cellen erg gevoelig voor plaatselijke infectie ^7. Een interessant alternatief voor high-throughput toepassingen is de injectie van bacteriën in de dooier van embryo in de eerste uren na de bevruchting ^8. De combinatie van fluorescerende bacteriën en transgene zebravis lijnen met fluorescerende macrofagen of neutrofielen schept ideale omstandigheden voor een multi-color beeldvorming van gastheer-pathogeen interacties. Deze video artikel beschrijft gedetailleerde protocollen voor de intraveneuze en lokale infectie van de zebravis embryo's met S. typhimurium of M. marinum bacteriën en voor de daaropvolgende fluorescentie beeldvorming van de interactie met cellen van het aangeboren immuunsysteem.

1. Bereid injectienaalden

1. Bereid borosilicaatglas microcapillaire injectienaalden (Harvard Apparatus, 300038, 1 mm OD x 0,78 mm ID) met behulp van een micropipet trekker apparaat (Sutter Instruments Inc, Flaming / bruin p-97 met de volgende instellingen voor een langere tip: de luchtdruk 400; warmte-610, pull 40; snelheid van 50, 30 en de tijd met de volgende instellingen voor een kortere tip: de luchtdruk 500; warmte-510; pull 100; snelheid 200; tijd 60).
2. Breek de naald met een fijne pincet om een ​​tip opening met een diameter van 5-10 um te verkrijgen. Het is raadzaam om schuine punt van de naald opening in een hoek van 45 graden met een microgrinder (Narishige Inc, EG-400) om een ​​scherper tip opleveren. Dit zal aanprikken van de epidermale laag en dus resulteren in een meer reproduceerbare injecties met minder weefselschade dan met stompe naalden. Langere getipt naalden hebben de voorkeur voor de caudale ader (stap 5) en Duct van Cuvier (stap 6.1) injecties en kortere getipt naaldenvoorkeur voor andere injectie protocols (stappen 6,2 tot 6,6).

2. Bereid S. typhimurium Inoculum

1. Plaat uit S. typhimurium een -80 ° C glycerol op LB-agarplaten (met geschikte antibiotica selecteren voor fluorescentie expressievectoren) en incubeer overnacht bij 37 ° C.
2. Extra individuele fluorescerend positieve kolonies en in de gewenste concentratie (zie protocollen 5 en 6) in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) mengen, desgewenst met 0,085% (v / v) fenol rood (Sigma-Aldrich) voor weergave van de steun injectie proces. Direct gebruik maken van de verse suspensie voor de injectie of voor te bereiden glycerol voorraden. Om glycerol voorraden bereiden draaien beneden de verse injectie beelden met de gewenste concentratie van bacteriën en concentreren van de voorraad resuspenderen de pellet in half het uitgangsvolume in steriele 20% (v / v) glycerol (Sigma-Aldrich) in PBS. Bewaar de glycerol voorraad op -80 ° C. Verdun de glycerol 1:1 (v / v) voorafgaand aan injectie in steriele PBS, desgewenst met 0,17% fenol rood.
3. Vortex de bacteriesuspensie goed om te voorkomen dat klonteren.
4. Laad het inoculum in de microcapillaire naald met behulp van een microloader tip (Eppendorf, 5242956,003).
5. Vanwege de relatief groot S. typhimurium bacteriën en hun heldere Ds-rode fluorescentie bij gebruik van de pGMDs3 expressievector ³ (stam beschikbaar op aanvraag), kunnen individuele bacteriële cellen eenvoudig worden geteld met een fluorescentie stereomicroscoop met het oog op de injectie dosis in te stellen. Daartoe injecteren een nL een druppel PBS op agar platen, tellen de fluorescerende bacteriën en berekenen injectievolume die nodig is om de gewenste dosis bacteriële (bij voorkeur houden injectievolume tussen 1-2 nL) te verkrijgen. Spuit de embryo's met S. typhimurium via de geselecteerde route (zie protocollen 5 en 6).

3. Bereiden

1. Houd de M. marinum stam groeien op Difco Middlebrook 7H10 agar (BD en bedrijf) aangevuld met 10% oliezuur-albumine-dextrose-catalase (OADC BD en bedrijf), 0,5% glycerol en met geschikte antibiotica selecteren voor fluorescentie-expressievectoren (stammen beschikbaar op aanvraag ^9), zodat er altijd een verse voorraad.
2. Kies een kolonie van M. marinum en resuspendeer in Difco Middlebrook 7H9-bouillon (BD en bedrijf), aangevuld met 10% albumine-dextrose-catalase (ADC, BD en bedrijf) en 0,05% Tween 80 (Sigma-Aldrich) en de juiste antibiotica. Controleer of de optische dichtheid (OD) bij 600 nm bedraagt ​​0,2 - 0,3 en laten groeien statisch 's nachts bij 28,5 ° C. De generatietijd van M. marinum is ongeveer 4-6 uur, varieert naar gelang van de stam.
3. Meet de OD bij 600 nm weer op de dag van injecties. Een OD600 1 overeen met ongeveer 10 ⁸ M. marinum / ml(Dit kan variëren naargelang van het gebruikte bacteriestam en dient dus gebaseerd op groeicurve van de specifieke stam worden).
4. Oogst de bacteriën als ze in logaritmische fase (laat niet de OD600 hoger zijn dan 1,00) door centrifugeren en wassen ze drie keer in een steriele PBS.
5. Meet de OD600 weer van de bacteriële suspensie in PBS, draaien beneden en mengen van de bacteriën op de gewenste concentratie (zie protocollen 5 en 6) in PBS of 2% Polyvinylpyrrolidon (PVP40) in PBS (w / v), die een homogene verbetert van de bacteriële suspensie. Fenolrood (Sigma-Aldrich) worden toegevoegd tot een concentratie van 0,085% tot weergave van de injectie te vergemakkelijken. Direct gebruik maken van de verse suspensie voor de injectie of voor te bereiden glycerol voorraden. Ter voorbereiding glycerol voorraden draaien beneden de verse injectie beelden met de gewenste concentratie van bacteriën en concentreren van de voorraad resuspenderen de pellet in half het uitgangsvolume in steriele 20% glycerol in PBS. Bewaar de glycErol voorraad bij -80 ° C. Verdun de glycerol 1:1 (v / v) in steriele PBS, desgewenst met 4% PVP40 en / of 0,17% fenol rood.

4. Bereid zebravis embryo's voor injecties

1. Stel zebravis broedparen en het verzamelen van embryo's, zoals aangegeven in een andere video artikel ^10. Houd embryo's in een petrischaal gevuld met ei water (60 ug / ml Zee zouten;. Ca. 60 embryo's / gerecht) en incuberen bij 28,5 ° C.
2. Desgewenst voegt 0,003% N-Phenylthiourea (PTU, Sigma-Aldrich) om het ei water wanneer de embryo's ongeveer 12 HPF aan melanisatie voorkomen.
3. Rond 24 uur na de bevruchting (HPF), dechorionate de embryo's met een fijne pincet (Fine Science Tools Inc, Dumont # 5 Pincetten - Inox Biology.
4. Bewaar de embryo's in een Petri schaal gevuld met eieren water en een laag van 1% agarose op de bodem van embryo's te hechten aan het kunststof oppervlak.
5. Verdoof de embryo's met 200 ug / ml gebufferd 3-Aminobenzoëzuur (tricaïne, Sigma-Aldrich) ongeveer 10 minuten voor injectie.

5. Intraveneuze injectie van bacteriën in One-dagen oude embryo's

1. Fase van de embryo's op 28 hpf ¹¹ door te controleren op consequente de bloedsomloop, het begin van pigmentatie in het oog, een rechte staart, en het hart wordt alleen ventraal geplaatst voor het oog.
2. Verdoof de embryo's, zie stap 4.5.
3. Plaats de naald met de bacteriële inoculum met een microloader tip.
4. Monteer de geladen naald op een micromanipulator (Sutter Instrument, MM-33) aangesloten op een standaard (World precisie-instrumenten, M10L magnetische voet) en plaats het onder een stereo-microscoop (Leica M50, achromaat 1x objectieve 0,15 NA, doorvallend licht-basis TL ST). Stel de injectie tijd tot 0,2 s en de vergoeding druk tot 15 hPa (Eppendorf, Femtojet). Stel de inspuitdruk tussen de 700 en 900 hPa tot de juiste injectievolume voor de naald te verkrijgengebruikt. Stel de druppelgrootte van de gewenste diameter met behulp van een schaal bar op een microscoopglaasje of het oculair passen. Voor maat bepalen de daling kan worden geïnjecteerd in minerale olie op een microscoopglaasje, of de grootte kan worden geschat door het injecteren in de lucht, die de druppel opknoping op de punt van de naald verlaat. De straal van een druppel van een nL is 0,062 mm (V = 4/3 π r ^3).
5. Stel de micromanipulator de geladen naald in de juiste positie voor het injecteren (bijvoorbeeld ongeveer een hoek van 45 ° ten opzichte van de injectie plaatoppervlak) en alleen bewegen heen en weer te injecteren.
6. De narcose embryo's worden gepipetteerd op een vlakke 1% agarose injecteren plaat en overtollige ei water wordt verwijderd, zodat de oppervlaktespanning van de embryo's zijn plaats te houden tijdens de injecties. Gebruik een haar loop gereedschap (figuur 2) dusdanig dat de embryo's. Richt de injectie plaat met de hand tijdens injecties om de embryo's te plaatsen in de gewenste positie voor inserting van de naald, dat wil zeggen met de staart de richting van de naald.
7. Plaats de naald direct boven de staart ader dicht bij de urogenitale opening (Figuur 1A), doorboren de periderm met de naald en injecteer de gewenste dosis van bacteriën, we gebruiken ca. 250 cfu S. typhimurium wild type (wt) stam SL1027, met de DS-RED expressievector pGMDs3, en ca. 120 kve van M. marinum stam Mma20. De geïnjecteerde bacteriesuspensie volgt de bloedstroom door de caudale ader naar het hart. Controleren als de injectie juist door het controleren van een groeiende volume van het vasculaire systeem direct na de puls ^2. Voor dosis-respons experimenten, kan 2-3 opeenvolgende injecties worden uitgevoerd zonder dat het extraheren van de naald.
8. Vaak dat de injectie volume blijft hetzelfde te controleren tijdens het experiment. Om een ​​controle voor de consistentie van de injecties in de hele experiment, injecteren een drop van bacteriën direct in een steriele PBS druppel op de groei van bacteriën medium na ongeveer om de 30 ^e embryo injectie. Plaat dit druppel en tellen kolonies na incubatie de kolonievormende eenheden (kve) te bepalen in de injectie volume.
9. Gebruik een fluorescentie stereomicroscoop (protocol 7) aan de individuele fluorescerende S. acht te nemen typhimurium cellen circuleren in de bloedbaan direct na de injectie, en gooi embryo's die niet goed worden geïnjecteerd. Individuele fluorescerende M. marinum bacteriën kunnen niet worden waargenomen door stereo fluorescentiemicroscopie direct na de injecties, maar fluorescerende aggregaten van geïnfecteerde cellen zichtbaar moet zijn door 2 dagen na infectie (dpi) en groter worden in de tijd.

6. Alternatieve Routes van infectie

1. Duct van Cuvier injectie: line-up onder narcose embryo's (2-3 DPF) op een vlakke 1% agarose injecteren plaat als voor caudaal ader injecties (zie 5.6). Plaats de te injecterenion-plaat met de hand tijdens de injecties om de embryo's te plaatsen in de gewenste positie voor het inbrengen van de naald, dat wil zeggen schuin onder een hoek van 45 °, zodat het kanaal van Cuvier kan worden benaderd door de naald van de dorsale zijde van het embryo (Figuur 1B) . Steek de naald in het beginpunt van het kanaal van Cuvier alleen dorsale naar de locatie waar het kanaal begint verbreding over de dooierzak en injecteer 100-200 bacteriën (1-3 NL). De injectie is correct als het volume in het kanaal vergroot direct na de puls en de dooierzak is niet gescheurd. Wat caudaal ader injecties (zie 5.7), kunnen meerdere opeenvolgende injecties worden uitgevoerd zonder dat het extraheren van de naald.
2. Achterhersenen ventrikel injectie: line-up onder narcose embryo's (32 HPF) op een vlakke 1% agarose injecteren plaat zodanig dat de embryo's worden geplaatst met hun rug-zijde naar de punt van de naald. Steek de naald in de achterhersenen ventrikel van een voorste positie zonder het aanraken van de neuroepithelium (figuur 1C) en injecteer 20-100 bacteriën (0,5-1 NL). Om de procedure oefenen Gebruik een fluorescerende kleurstof (bijvoorbeeld Texas-rood Dextran) volgens een video artikel ^13.
3. Staart spier injecteren: positie onder narcose embryo's (1-2 DPF) als voor caudaal ader injecties (zie 5.6). Stel de micromanipulator de geladen naald een hoek van ongeveer 65 ° ten opzichte van de injectie plaatoppervlak. Injecteer een bacteriële suspensie (0,5-1 nL) met 20 tot 50 kve in de spier boven de urogenitale opening (figuur 1D) zonder schade aan de notochorda of bloedvaten.
4. Otic blaasje injectie: positie onder narcose embryo's (2-3 DPF) als voor caudaal ader injecties (zie 5.6). Stel de micromanipulator de geladen naald een hoek van ongeveer 65 ° ten opzichte van de injectie plaatoppervlak. Injecteer ongeveer 20 bacteriën (0,5 nL) in de otic blaasje (figuur 1E) met een lage drukure aan de lokale weefsel scheuren te voorkomen.
5. Notochorda injectie: line-up onder narcose embryo's (1-2 DPF) op een vlakke 1% agarose injecteren plaat zodanig dat de embryo's worden geplaatst met hun staart te wijzen uit de buurt van de naald komt. Steek de naald door de staart van spierweefsel in de notochorda (Figuur 1F) en spuit ongeveer 20-50 bacteriën (maximaal 0,5 NL). Zorg ervoor dat u te veel volume te injecteren om breuk van het notochorda te voorkomen.
6. Yolk injectie: positie eieren met embryo's in het 16-1000 cel stadium op een 1% agarose injecteren plaat met rechthoekige of V-vormige kanalen die met een kanaal mal ¹² of online http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt5 / 5.1.html . Pierce de naald door het chorion in het midden van de dooier (figuur 1G) en injecteer 20-40 bacteriën (1-2 nL). Het gebruik van 2% PVP40 drager oplossing voor de bacteriële suspensie (zie stap 3.5)is belangrijk om vroeg bacteriële verspreiding te voorkomen dat in het embryo.

7. Stereobeeld van de infectie

1. Verdoof de besmette embryo's in een 1% agarose gelaagde petrischaal bedekt is met ei water met tricaïne (zie 4.5).
2. Lijn de embryo's in de juiste positie voor beeldvorming onder een fluorescentie stereomicroscoop met een haar loop gereedschap (figuur 2). Voordat de zwemblaas heeft opgeblazen (1-5 DPF), zullen de embryo's plat liggen op hun kant zodat zijdelingse beeldvorming.
3. Als een andere positie dan de laterale vereist, monteren embryo's 1,5% methylcellulose. Manipuleer het embryo in de gewenste positie met een haar loop gereedschap (figuur 2).
4. Zet de embryo's tot ei water na beeldvorming.

8. Confocale beelden van de infectie

1. Breng een druppel laag smeltpunt agarose (Lonza Inc 1,5% (w / v) in water ei) op ​​het glas bodem van eenWillco-schaal (Willco Wells, GWSt-5040) als een omgekeerde confocale microscoop wordt gebruikt, of op een enkele holte depressie dia (Agar Scientific, L4090) als een rechte confocale microscoop wordt gebruikt.
2. Plaats de narcose embryo in de agarose druppel met beperkte hoeveelheid ei water en manipuleren het embryo in de juiste positie met een haar loop gereedschap (figuur 2). Bij gebruik van een omgekeerde microscoop is het belangrijk dat de embryo's dat van belang is tegen het raam onder de beeldvormende schotel. Een staande microscoop kunnen worden gebruikt in combinatie met water onderdompeling of interlokale droge doelstellingen en de embryo worden geplaatst dat het gebied van belang zo dicht bij de doelstelling mogelijk.
3. Laat de agarose stollen en dompel de agarose daling van de ei-water met tricaïne (zie 4.5). Als een opstaande microscoop wordt plaatst een glazen dekglas boven de verdieping holte (niet mogelijk luchtbellen te vormen).
4. Sequentieel te verwerven grieporescence en transmissie beelden.
5. Verwijder voorzichtig de agarose van het embryo met fijne pincet en terug te plaatsen van het embryo in het ei water als het nodig is voor verdere experimenten.

9. Representatieve resultaten

Injectie van Salmonella typhimurium of Mycobacterium marinum bacteriën in het bloed eiland van embryo's op 1 DPF resultaten in de snelle fagocytose door macrofagen. De mpeg1 gen is onlangs geïdentificeerd als een trouwe marker van embryonale macrofagen, colocalizing met de gevestigde macrofaag marker csf1r (FMS) en niet overlapt met neutrofielen merkers zoals MPX (MPO) en Lyz ^{4, 14.} Voor live beeldvorming van bacteriële fagocytose gebruikten we transgene lijnen waarin de mpeg1 promotor fluorescerend eiwit expressie rijdt in macrofagen ^14. Deze transgene lijnen hetzij de mpeg1 promotor fdirect gebruikt om het GFP-gen, of gebruik van een twee-componentensysteem waarbij de mpeg1 promoter drijft expressie van het gist Gal4 transcriptiefactor een tweede transgen de Gal4 herkenningssequentie (UAS stroomopwaarts activeren sequentie) gefuseerd aan het Kaede gen activeert. Wanneer het bloed eiland injectie (protocol 5; figuur 1A) correct is uitgevoerd, zal de bacteriën meteen stromen door de bloedsomloop en verspreid over het hele embryo. Verspreiding van de relatief grote en fel tl-DS-RED label S. typhimurium bacteriën kunnen direct worden afgebeeld met een stereo fluorescentiemicroscoop (figuur 3A) en confocale beelden van 2 hpi blijkt dat veel bacteriën gefagocyteerd door fluorescentie macrofagen (Figuur 3B-C). De injectie van slechts 25 cfu van wildtype S. typhimurium bacteriën resulteert in een dodelijke infectie, terwijl eenzelfde dosis van bacteriën van de avirulenttrein, zoals RA, kunnen worden gewist door de embryonale immuunsysteem ^3. Een injectie dosis van 250 cfu werd gebruikt om transcriptie te reageren met S. typhimurium-infectie in de zebravis embryo en aangetoond dat de inductie van een sterke pro-inflammatoire genexpressie respons ^15. Daarentegen intraveneuze injectie van M. marinum bacteriën niet roepen een sterk pro-inflammatoire respons, maar leidt tot een persisterende infectie, waar geïnfecteerde macrofagen vormen strakke aggregaten die worden beschouwd als de eerste stadia van granulomen, die het kenmerk van tuberculose ^2. Confocale beelden van een dergelijke granuloma-achtige aggregaat in de Tg (MPEG1: EGFP) gl22 lijn ¹⁴ bij 5 dpi toont de intracellulaire groei van mCherry-gelabeld M. marinum bacteriën in het groen fluorescent macrofagen (figuur 3D-E).

Othaar besmettingsroutes zijn bruikbaar voor verschillende doeleinden. Bacteriën worden geïnjecteerd achterhersenen ventrikel op 32 hpf (figuur 1c), waarin een compartiment zonder macrofagen. Injectie van 20-100 mCherry gelabelde M. marinum bacteriën in dit compartiment tot een snelle penetratie door macrofagen die de bacteriën (Figuur 4A) fagocyteren. Een andere methode om de gerichte verplaatsing van aangeboren immuunsysteem cellen te bestuderen is injectie van bacteriën in de staart spier (figuur 1D). Echter, de staart spier injecties ook leiden tot beschadiging van het weefsel dat door zelf een aantal aantrekking van leukocyten uitlokt. Zo'n verwonding reactie kan vermeden worden wanneer zorgvuldig het injecteren van een kleine hoeveelheid (0,5-1 nL) in de otic blaasje (figuur 1E). Zoals hier getoond met behulp van de Tg (MPX: EGFP) i114 lijn ^16, injectie van ongeveer 20 cfu van S. typhimurium in de otic blaasje leidt tot de aantrekking van neutrofielen op 3 hpi ( (figuur 4E). De notochorda, die lijkt te zijn tegen infiltratie van leukocyten, een facultatieve compartiment voor de groei van M. marinum mutanten die sterk verzwakt bij injectie in andere weefsels ⁷ (figuur 4F). Tenslotte eerste injectie M. marinum in de dooier van embryo's biedt een alternatieve methode om een systemische infectie te bereiken. Wij over het algemeen deze injecties uit te voeren rond de 16 cellig stadium (figuur 1G), maar bacteriële injecties in de dooier kan ook worden uitgevoerd in een later stadium (tot de 1000 cellen stadium), of eerder (1 tot stadium van 8 cellen) voor co-injecties met morpholinos ^8. Na de dooier injectie van een dosis van 20-40 kve, M. marinum bacteriën verspreid over meerdere dagen in de embryonale weefsels en vorm granuloom-achtige aggregaten vergelijkbaar met die waargenomen bij de conventioneleintraveneuze injectie methode ^8; (figuur 4G). De dooier injectie methode niet geschikt voor S. Typhimurium infectie, omdat de snelle groei in de dooier veroorzaakt begin van de letaliteit. De dooier infectie methode voor M. marinum infectie zal nuttig zijn voor high-throughput-toepassingen omdat het kan worden geautomatiseerd met behulp van een injectie robot ^8.

Figuur 1. Overzicht van de injectie methoden die worden gebruikt voor het vaststellen van systemische of lokale infecties in de zebravis embryo's. (AB) Intraveneuze injecties voor de oprichting van een snelle systemische infectie worden uitgevoerd in de caudale ader op het achterste bloed eiland op een DPF (A) of in het kanaal van Cuvier op 2-3 DPF (B). (CE) Lokale injecties voor het bestuderen van macrofagen en neutrofielen chemotaxis worden uitgevoerd in de achterhersenen ventrikel op een DPF (C), De staart spier bij 1-2 DPF (D) of de otic blaasje op 2-3 DPF (E). (F) injecties om een ​​infectie schijnbaar ontoegankelijk voor fagocyten maakt, worden uitgevoerd in de notochorda bij 1-2 dpf. (G) injecties om een vroege systemische infectie te maken met langzaam groeiende bacteriën zoals M. marinum kan worden uitgevoerd in de dooier de 16-1000 cellig stadium. Alle beelden zijn gemaakt met een Leica M165C, PLANAPO 1,0 x aangesloten op een Leica DFC420 camera (Leica 10446307 0,8 x).

Figuur 2. Hair loop tool. Een stuk van de menselijke haar is ingevoegd als een lus in de opening van een Pasteur pipet en vastgezet met super lijm of met Tipp-Ex. Dit is een handige tool voor het voorzichtig manipuleren van kwetsbare zebravis embryo's.

Figuur 3. Intraveneuze injecties vanrode fluorescerende Salmonella typhimurium en Mycobacterium marinum. Ds-RED-label S. typhimurium SL1027 bacteriën (AC) en mCherry-gelabeld M. marinum Mma20 bacteriën (DE) werden geïnjecteerd in het bloed eiland Tg (MPEG1: Gal4-VP16) gl24; Tg (UAS-E1B: Kaede) s1999t (AC) of Tg (MPEG1: EGFP) gl22 (DE) zebravis embryo's op 28 HPF. (A) Stereo-fluorescentie en bright-field overlay-afbeelding met de verspreiding van de S. typhimurium in de bloedsomloop op 2 hpi (Leica MZ16FA microscoop met Leica DFC420C camera). (BC) Confocale z-stack projecties met rode S. typhimurium bacterie gefagocyteerd door groene macrofagen op 2 hpi (Leica TCS SPE, HCX APO objectief 40x 0.8 NA). Bacteriën die nog extracellulaire kan ook worden waargenomen. (D) Confocale z-stack projectie toont een granuloom-achtige aggregaat met een M. marinum Mma20-besmette en niet-geïnfecteerde macrofagen op 5 dpi (Leica TCS SPE, HCX APO 40x0.8 NA). Macrofagen in het groen en bacteriën in het rood. (E) Confocale z-stack projectie van een individuele macrofagen (groen) met intracellulaire M. marinum bacteriën (rood). Het gebied afgebeeld in D van de witte rechthoek werd afgebeeld met een hogere vergroting doelstelling (Leica TCS SPE, HCX PL APO 63x 1.2 NA). Scalebars: 20 urn.

Figuur 4. Alternatieve routes voor infectie van zebravis embryo's. (A) mCherry-gelabeld M. marinum Mma20 bacteriën werden geïnjecteerd in de achterhersenen ventrikel op 32 hpf. Fluorescentie en transmissie overlay-afbeelding met mCherry-gemerkte bacteriën gefagocyteerd door macrofagen op 5 hpi (Leica TCS SPE, HCX PL FLUO TAR 40.0x 0.7 NA). (B) S. typhimurium werd geïnjecteerd in de staart spier op 1 dpf. Aantrekkingskracht van myeloïde cellen voor de plaats van injectie (witte cirkel) wordt op 3 hpi door fluorescent in situ hybridisatie ⁴ (C) dat in niet-geïnjecteerde embryo in de regel geen myeloïde cellen op deze morfologische site. Hoewel de embryo's niet volwassen neutrofielen bevatten in dit stadium kan twee populaties van myeloïde cellen worden onderscheiden, een uiting van de macrofaag marker mfap4 (rood) en een uiting van de neutrofielen marker MPX (groen) (Leica TCS SPE, HC PL Fluotar 10,0 x 0.3 NA). Fluorescentie van de bacteriën verdwijnt na de in situ hybridisatie procedure. (D) Ds-RED-label S. typhimurium bacteriën werden geïnjecteerd in de otic blaasje van Tg (MPX: EGFP) i114 zebravis op 2 dpf. Stereo-fluorescentie en bright-field overlay beelden laten zien dat MPX: EGFP gelabelde neutrofielen cellen worden aangetrokken tot de geïnfecteerde otic blaasje (gestippelde ellips) op 3 hpi, (E) Overwegende dat de controle injectie van PBS in de otic blaasje van Tg (MPX: EGFP ) i114 zebravis heeft aantrekkingskracht van neutrofielen niet laten zien aan de niet-geïnfecteerde otic vesicle (gestippelde ellips) (Leica MZ16FA met Leica DFC420C camera). (F) mCherry-gelabeld M. marinum bacteriën van de verzwakte E11 eccCb1 :: tn mutante stam ^{17 worden} geïnjecteerd notochorda op een dpf. Verspreiding in de notochorda wordt belicht op 5 dpi (Leica MZ16FA microscoop DC500 camera). (G) mCherry-gelabeld M. marinum E11 bacteriën werden geïnjecteerd in de dooier van het 16-cellig stadium zebravis embryo's van Tg (fli1a: EGFP) lijn die GFP tot uitdrukking in endotheelcellen van de bloed-en lymfevaten. Vorming van granuloma-achtige aggregaten van geïnfecteerde cellen in de staart regio wordt waargenomen bij het ​​5 dpi (Leica MZ16FA microscoop met Leica DFC420C camera, beeld uit ^8).

De infectie methoden beschreven in dit artikel worden vaak gebruikt om de functie van gastheer aangeboren immuniteit genen of bacteriële virulentie genen ^een te bestuderen. De intraveneuze micro-injectie methoden (protocollen 5 en 6.1) worden het meest gebruikt voor dergelijke studies. De caudale ader op het achterste bloed eiland is de meest geschikte locatie voor intraveneuze injectie van 1-dagen oude embryo's. Omdat de caudale ader wordt het moeilijker om door te dringen in een later stadium, geven wij de voorkeur het kanaal van Cuvier als intraveneuze injectie site voor embryo's op 2-3 dpf. In alle gevallen is het van cruciaal belang voor de embryo's te injecteren met een constante aantallen bacteriën, die moeten door platen injectie inocula worden gecontroleerd op kve tellen. De volgende aspecten moet worden beschouwd als reproduceerbare injecties te bereiken. Ten eerste is het essentieel om een ​​hoge kwaliteit glas microcapillaire injectienaalden. Als de naald te groot is, zal de injectie een lekke band gat groot genoeg te maken voor bloeden voor te komen ende geïnjecteerde bacteriën stromen van de bloedsomloop. Ten tweede moet bacteriën rechtstreeks geïnjecteerd worden in de bloedsomloop. Als de naald zich niet in de ader of als injectievloeistof spreads in de dooierzak uitbreiding moet het embryo weggegooid worden van het experiment. Ten derde, met behulp van PVP40 als een drager voor het injecteren van M. marinum zal helpen bij het ​​voorkomen van de bacteriën uit zinken in het glas naald. PVP40 verbetert de homogeniteit van de schorsing, wat resulteert in beter reproduceerbaar inocula tijdens de gehele duur van de injecties. PVP40 kunnen ook worden gebruikt voor S. typhimurium injecties, maar hier is minder belangrijk omdat de grotere en lichte fluorescentie van de bacteriën kan een visuele controle op de injectieplaats inoculum bij experimenten. Voor het oefenen van de injecties adviseren wij het gebruik van fenol rode kleurstof (1% v / v) of 1 micrometer fluorescerende bollen in verschillende kleuren verkrijgbaar (Invitrogen). Zodra de techniek onder de knie, duurt het ongeveer 30 minutes tot 50-100 embryo injecteren, zoals de tijd nodig voor het uitlijnen van de embryo's agarose platen en aanpassing van de bacteriële injectievolume.

Terwijl de intraveneuze injecties in het bloed eiland (protocol 5) of in het kanaal van Cuvier (protocol 6.1) worden het meest gebruikt, zijn de alternatieve routes van de infectie wordt beschreven in deze video artikel nuttig gebleken om macrofagen en neutrofielen chemotaxis te bestuderen (protocollen 6.2, 6.3 en 6.4), de groei van verzwakte bacteriestammen (protocol 6.5) te bestuderen en het zebravis infectiemodel voor high-throughput toepassingen (protocol 6.6) ^4-8 passen. De beschreven micro-injectie werkwijzen kunnen ook worden toegepast voor injecties virussen ^{18, 19,} schimmelsporen ^{14, 20} of ziekteverwekkers (Maria Forlenza, persoonlijke communicatie). Een nuttige aanvulling op de injectie procedures beschreven in deze video artikel is een recent beschreven procedure voor subcutane injectie van bacteriën in zebrafish embryo ^21. Deze procedure werd toegepast fagocytose door neutrofielen bacteriën, die efficiënt overspoelen bacteriën op weefseloppervlakken maar bestuderen, in tegenstelling tot macrofagen, vrijwel geen bacteriën fagocyteren bij injectie in het bloed of in fluïdum gevulde lichaamsholtes. Voor subcutane injecties embryo's worden geplaatst vergelijkbaar als bij de staart spier injecties beschreven in deze video artikel, maar de naald wordt ingebracht net onder de huid om de bacteriën te injecteren via een somiet.

Het is belangrijk om te oordelen dat micro-injectie in wezen een kunstmatige route van infectie. Echter, vroege embryo zijn bestand tegen externe blootstelling aan bacteriële pathogenen. In feite, onderdompeling assays, waarbij embryo's ondergedompeld in een bacteriesuspensie, zijn niet reproduceerbaar in onze handen ^22. Terwijl sommige embryo's kunnen besmet raken na onderdompeling, hebben wij een grote variatie in sterftecijfers en in de explicieteion van inflammatoire markers tussen individuele embryo dergelijke tests. De micro-injectie methoden die in dit artikel te bereiken reproduceerbaar infecties en zijn bijzonder nuttig om bacteriële interacties met gastheer aangeboren immuunsysteem cellen te bestuderen. Een efficiënte aanpak van de bacteriële infectie te kwantificeren in individuele embryo's is om de fluorescerende beelden van geïnfecteerde embryo's te analyseren met op maat gemaakte, toegewijde pixel kwantificering software ^{17, 23.} Deze benadering is gebleken te correleren met de resultaten van cfu tellen na plating van geïnfecteerde embryo's. Zo hebben de relatieve veranderingen in leukocyten aantallen per embryo gekwantificeerd door digitale beeldanalyse in transgene leukocyten fluorofoor verslaggever lijnen; deze aanpak van toepassing zou zijn voor het kwantificeren van de gastheer leukopoietic reactie op infectie ^24.

De functie van ontvangst aangeboren immuunsysteem genen efficiënt in vivo onderzocht door het combineren van de beschreven infectie modellenmet morfolino knockdown. Morpholinos zijn synthetische antisense oligonucleotiden die specifiek RNA gericht en verminderen de expressie van de genproducten bij injectie in 1-cel stadium zebravisembryo's zoals in andere video artikelen in dit tijdschrift ^{10, 25.} In morfolino knockdown studies is het van groot belang dat alle embryo te vergelijken groepen kunnen worden opgevoerd voor bacteriële injecties. Dit is vooral belangrijk omdat embryo's beschikken over een ontwikkeling van het immuunsysteem die steeds bevoegd in de tijd.

Er zijn verschillende transgene reporter lijnen die momenteel beschikbaar zijn op de grote aangeboren immuunsysteem subsets, macrofagen en neutrofielen, in de zebravis embryo's te onderscheiden. De MPX en Lyz promotors zijn gebruikt om neutrofielen reporter lijnen ^{16, 26, 27} genereren en csf1r (FMS) en mpeg1 promoters zijn voor het produceren van macrofagen reporters ^{14, 28.} Terwijl CSF1R (FMS) is bovendien uitgedrukt in xanthophores, mpeg1 expressie is uitsluitend in macrofagen. Zoals blijkt uit deze video artikel, de recent ontwikkelde mpeg1 reporter lijnen zijn zeer nuttig voor de beeldvorming bacteriële fagocytose door macrofagen.

De auteurs hebben niets te onthullen.

De auteurs willen graag Chao Cui bedanken, Floor de Kort, Esther Stoop en Ralph Carvalho voor afbeeldingen in figuur 4, Ulrike Nehrdich en Davy de Witt voor vissen zorg, en andere lab-leden voor nuttige discussies. Dit werk wordt ondersteund door het Smart Mix-programma van Nederland Ministerie van Economische Zaken en het Ministerie van Onderwijs, Cultuur en Wetenschap, de Europese Commissie 7e kader project ZF-GEZONDHEID (HEALTH-F4-2.010 tot 242.048), de Europese Marie-Curie netwerk voor initiële opleiding FishForPharma (PITN-GA-2011 tot 289.209), en door de Australische NHMRC (637.394). De Australische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde wordt ondersteund door subsidies van de staat regering van Victoria en de Australische regering.

1. Meijer, A.H. & Spaink, H.P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Curr. Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).
2. Davis, J.M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17, 693-702 (2002).
3. van der Sar, A.M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell Microbiol. 5, 601-611 (2003).
4. Zakrzewska, A., et al. Macrophage-specific gene functions in Spi1-directed innate immunity. Blood. 116, e1-11 (2010).
5. Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
6. Herbomel, P., Thisse, B., & Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126, 3735-3745 (1999).
7. Alibaud, L., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Mol. Microbiol. 80, 919-934 (2011).
8. Carvalho, R., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PLoS One. 6, e16779 (2011).
9. van der Sar, A.M., Spaink, H.P., Zakrzewska, A., Bitter, W., & Meijer, A.H. Specificity of the zebrafish host transcriptome response to acute and chronic mycobacterial infection and the role of innate and adaptive immune components. Mol. Immunol. 46, 2317-2332 (2009).
10. Rosen, J.N., Sweeney, M.F., & Mably, J.D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115, DOI: 10.3791/1115 (2009).
11. Kimmel, C.B., Ballard, W.W., Kimmel, S.R., Ullmann, B., & Schilling, T.F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).
12. Westerfield, M. (ed.) The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio). The University of Oregon Press, Eugene, (1993).
13. Gutzman, J.H. & Sive, H. Zebrafish Brain Ventricle Injection. J. Vis. Exp. (26), e1218, DOI: 10.3791/1218 (2009).
14. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J.W., Andrianopoulos, A., & Lieschke, G.J. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117, e49-56 (2011).
15. Stockhammer, O.W., Zakrzewska, A., Hegedus, Z., Spaink, H.P., & Meijer, A.H. Transcriptome profiling and functional analyses of the zebrafish embryonic innate immune response to Salmonella infection. J. Immunol. 182, 5641-5653 (2009).
16. Renshaw, S.A., et al. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108, 3976-3978 (2006).
17. Stoop, E.J., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Dis. Model Mech. 4, 526-536 (2011).
18. Levraud, J.P., et al. Identification of the zebrafish IFN receptor: implications for the origin of the vertebrate IFN system. Journal of Immunology. 178, 4385-4394 (2007).
19. Levraud, J.P., Colucci-Guyon, E., Redd, M.J., Lutfalla, G., & Herbomel, P. In vivo analysis of zebrafish innate immunity. Methods Mol. Biol. 415, 337-363 (2008).
20. Brothers, K.M., Newman, Z.R., & Wheeler, R.T. Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryot. Cell. 10, 932-944 (2011).
21. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J.Y., Renshaw, S.A., & Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124, 3053-3059 (2011).
22. van Soest, J.J, et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
23. Adams, K.N., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145, 39-53 (2011).
24. Ellett, F.L. & Lieschke, G.J. Computational quantification of fluorescent leukocyte numbers in zebrafish embryos. Methods in Enzymology. In press, (2011).
25. Yuan, S. & Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113, DOI: 10.3791/1113 (2009).
26. Mathias, J.R., et al. Resolution of inflammation by retrograde chemotaxis of neutrophils in transgenic zebrafish. J. Leukoc. Biol. 80, 1281-1288 (2006).
27. Hall, C., Flores, M.V., Storm, T., Crosier, K., & Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Dev. Biol. 7, 42 (2007).
28. Gray, C., et al. Simultaneous intravital imaging of macrophage and neutrophil behaviour during inflammation using a novel transgenic zebrafish. Thromb. Haemost. 105, 811-819 (2011).

0 Comments

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.