The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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1Department of Pharmacology, University of Medicine and Dentistry of New Jersey-Robert Wood Johnson Medical School, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University
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Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina. J. Vis. Exp. (60), e3792, doi:10.3791/3792 (2012).
चिकन भ्रूण रेटिना उच्च रीढ़ में रेटिना विकास का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण है. बड़े आकार और बाहरी विकास की वजह से, यह अपेक्षाकृत बहुत आसान है लड़की भ्रूण पुनः संयोजक डीएनए / आरएनए प्रौद्योगिकी का उपयोग रेटिना में हेरफेर. डीएनए / आरएनए constructs के भ्रूण रेटिना में electroporation स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं रेटिना के में रेटिनल विकास के दौरान जीन विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक महान लाभ है. रिपोर्टर जीन परख, अभिव्यक्ति से अधिक जीन, जीन नीचे दस्तक (shRNA) आदि के रूप में assays के विभिन्न प्रकार electroporation तकनीक का उपयोग किया जा सकता है. इस वीडियो लक्षित रेटिना इंजेक्शन को दर्शाता है और भ्रूण लड़की रेटिना में ओवो electroporation में हैम्बर्गर और हैमिल्टन 22-23 मंच, जो भ्रूण 4 दिन (E4) के बारे में है. यहाँ हम ओवो electroporation तकनीक में तेजी और सुविधाजनक शो जिससे एक प्लास्मिड डीएनए है कि एक मार्कर के रूप में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त सीधे में कर दिया हैलड़की भ्रूण subretinal अंतरिक्ष और बिजली दालों के बाद रेटिना स्टेम / पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के डीएनए तेज की सुविधा. रेटिना और E4 पर इंजेक्शन electroporation की नई विधि देर जन्मे 1 न्यूरॉन्स, जो इंजेक्शन और electroporation की पारंपरिक विधि के साथ मुश्किल 2 E1.5 पर किया गया है सहित सभी रेटिना सेल प्रकार, दृश्य की अनुमति देता है.
के बाद से प्रोटोकॉल के कुछ भागों के रूप में मामूली संशोधन के साथ पहले से अन्य जौव 2 वीडियो और 3 कागजात में वर्णित प्रदर्शन कर रहे हैं हम यहाँ विस्तार में उन पर चर्चा करेंगे.
1. अंडा हैंडलिंग और सुई तैयार
2. इंजेक्शन और electroporation
3. प्रतिनिधि परिणाम
हमारे अध्ययन में, हम विभिन्न प्लाज्मिड constructs का उपयोग करने के लिए जीन अभिव्यक्ति के नियमन का अध्ययन है कि रेटिना सेल के विकास शामिल है. इस वीडियो में pCAG GFP (अभिकर्मक नियंत्रण) करने के लिए एक सफल इंजेक्शन और electroporation का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. हालांकि, रिपोर्टर जीन (GFP है, आरएफपी आदि) के साथ किसी भी प्लास्मिड का निर्माण किया जा सकता. हालांकि GFP अभिव्यक्ति हाथी के बाद 8 घंटे के रूप में जल्दी के रूप में देखा जा सकता हैctroporation, हम आम तौर पर 6 दिन अंडा (E6) और उसके बाद कटाई शुरू करते हैं. Electroporated retinas के भ्रूण की dissected किया गया और एम्बेड और सेक्शनिंग पहले फ्लोरोसेंट विच्छेदन खुर्दबीन के तहत विश्लेषण. आमतौर पर, रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति रेटिना की एक तिमाही में कम से कम एक सफल electroporation (चित्र 1) के बाद देखा जा सकता है. ट्रांसफ़ेक्ट रेटिना के ऊतकों और सेल morphologies का स्पष्ट दृश्य के लिए प्रोटोकॉल के माध्यम से विश्लेषण किया गया. Immunohistochemistry सेल प्रकार विशिष्ट (Brn3a, आदि Pax6) सेल विशेष GFP अभिव्यक्ति की अनुमति लक्षण वर्णन मार्करों (चित्र 2) का उपयोग कर.
आकृति 1. संवाददाता प्लाज्मिड परिणाम सकारात्मक GFP अभिव्यक्ति की सफल electroporation चिकन भ्रूण retinas. और इंजेक्शन गया electroporated और भ्रूण 4 दिन में भ्रूण 6 दिन में काटा. रेटिना के कम से कम 25% सफलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था (एक = शीर्ष देखने के लिए, बी= नीचे देखें). बार = 1mm स्केल.
चित्रा 2. GFP की विशेषता रेटिना की कोशिकाओं का उपयोग कर immunohistochemistry व्यक्त E7 चरण में रेटिना के ऊतकों को व्यक्त GFP तय की और sectioned थे. इन वर्गों तो विभिन्न सेल विशिष्ट मार्कर के साथ दाग रहे थे. Brn3a नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (ए) जबकि Pax6 क्षैतिज लंबे प्रबर्धों से रहित है, और नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (बी) का निर्धारण किया गया था निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. पैमाने बार = 50 माइक्रोन.
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रेटिना इंजेक्शन लक्षित और E4 के स्तर पर भ्रूण रेटिना में ओवो electroporation में विशेष रूप से एकल कोशिका के स्तर पर सभी छह प्रमुख रेटिना सेल प्रकार की कल्पना करने की क्षमता में जिसके परिणामस्वरूप रेटिनल पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को लक्षित कर सकते हैं (~ E1.5) HH10 पर ओवो electroporation लक्ष्यीकरण. ऑप्टिक पुटिका कोशिकाओं कि है आँख फार्म विकसित transfect करने में सक्षम है. हालांकि, इन कोशिकाओं को इस समय एक बहुत ही उच्च कारोबार है और इस विधि रेटिना की कोशिकाओं के लिए विशिष्ट नहीं है. यह हो सकता है कि उच्च सेल कारोबार दर निरंतर स्थिर अभिव्यक्ति को रोकता है. E4 द्वारा, भ्रूण काफी विकसित है कि आँख के प्रमुख संरचनाओं का गठन कर रहे हैं, लेकिन सभी काफी युवा है कि रेटिना में कोशिकाओं के बहुमत अभी भी रेटिना स्टेम सेल हैं. यह विधि भी समारोह पढ़ाई की है, जहां ब्याज की एक जीन सामान्य विकास और / या रेटिना की बीमारी का अध्ययन करने के लिए लक्षित किया जा सकता है / नुकसान हासिल करने के लिए लागू किया जा सकता है.
के बाद हम हमारे में इस तकनीक को प्रकाशितपिछले 1 कागज, इस क्षेत्र में कई वैज्ञानिकों ने हमें इस तकनीक पर अधिक सहायता के लिए संपर्क किया. तो हम दृश्य के लिए इस वीडियो का निर्माण करने का फैसला किया. इसके अलावा, हमारी तकनीक में अग्रिम इस वीडियो में वर्णित हैं.
इस तकनीक को सफलतापूर्वक करने के लिए, निम्नलिखित महत्वपूर्ण कारकों का वर्णन करने के लायक हैं.
सबसे महत्वपूर्ण कारक subretinal अंतरिक्ष में सुई जगह ठीक है. सबसे पहले, एक सुई विपरीत आंख में प्रवेश करने और चोंच की ओर इशारा करते हुए रक्त वाहिकाओं के मुख्य बंडल करने के लिए पार्श्व संरेखित सावधान होने की जरूरत है. यह स्थिति लगभग दिल के समानांतर है और मस्तिष्क और हृदय को नुकसान करने के लिए मौका कम कर देता है. जब झिल्ली पीतक, श्वेतपटल, रेटिना और कांच का हास्य के माध्यम से भेदी, सुई दूर है और पियर्स किसी भी रक्त शिरा के माध्यम से यात्रा नहीं करना चाहिए. यदि सुई काफी तेज है तो यह कुछ प्रथाओं के साथ बहुत आसानी से किया जा सकता है. अगले कदम धीरे धीरे वापस वें खींच करने के लिए हैई सुई और यह रेटिना के उद्घाटन के किनारे पर स्थिति. वहाँ हमेशा एक मौका है यह पूरी तरह से बाहर खींच. अगर वह नहीं होना चाहिए, तो एक फिर से कोशिश उद्घाटन के अवसर पर सुई टिप वापस डाल सकते हैं. Subretinal अंतरिक्ष श्वेतपटल और रेटिना के बीच में सुई रखकर अभ्यास और धैर्य की आवश्यकता है. शुरुआत में, यह बहुत मुश्किल लग रहा है, लेकिन कुछ अभ्यास के साथ यह आसान हो जाता है. जबकि subretinal अंतरिक्ष के अंदर डीएनए समाधान इंजेक्शन, यह बहुत महत्वपूर्ण है उभाड़ना गठन का पालन करने के लिए. बाद में, हरी समाधान आंख की रूपरेखा भरने शुरू होता है, एक सफल इंजेक्शन का संकेत है. यदि समाधान दूर diffuses है या आंख के बीच में भरने शुरू होता है, कि एक गलत इंजेक्शन इंगित करता है जो एक सफल electroporation नहीं निकलेगा.
दूसरा पहलू है जो एक गिलास केशिका ट्यूब गर्मी खींच और टिप को तोड़ने के माध्यम से किया जाता है एक इष्टतम सुई का निर्माण है. बड़े युक्तियों के साथ सुई कठिनाई भेदी through पीतक झिल्ली जो रेटिना हानिकारक का मौका बढ़ जाती है. आमतौर पर तीव्र सुई युक्तियाँ इस उद्देश्य के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं. हालांकि, बहुत छोटे सुझावों के साथ सुई लोड हो रहा है और डीएनए पहुंचाने में कठिनाई होती है और वृद्धि के लिए नेत्र गोलक के अंदर नीचे तोड़ने का मौका है. इस कारण से हम व्यास में 0.1 माइक्रोन और 20 मिमी एक घटना पर एक टिप खोलने के साथ सुई बनाना. इसके अलावा, जबकि parafilm का एक टुकड़ा पर एक छोटी बूंद से डीएनए मिश्रण लोड हो रहा है, यह बहुत महत्वपूर्ण है करने के लिए तरल के अंतिम बिट लोड नहीं के रूप में यह सुई अंदर हो रही हवा की संभावना बढ़ जाती है.
अंत में, इलेक्ट्रोड रखने बहुत सफल electroporation को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है. इलेक्ट्रोड समानांतर में रखा जाना चाहिए ताकि विकासशील आंख इलेक्ट्रोड के बीच स्थित है. अतिरिक्त सावधानी के किसी भी प्रमुख खून इलेक्ट्रोड के साथ या दिल वाहिकाओं को छूने से लिया जाना चाहिए. इनमें से किसी भी हानिकारक मौत के बाद एक सफल injecti भी भ्रूण के लिए परिणाम कर सकते हैंपर. इसके अलावा, दो आँखें अलग उन्मुख हैं. तो, यह ध्यान में रखा जाना करने के लिए इलेक्ट्रोड अभिविन्यास (सकारात्मक बनाम नकारात्मक) इतना बदल कि नकारात्मक इलेक्ट्रोड हमेशा इंजेक्शन पक्ष में बिजली के वर्तमान के तहत रेटिना की कोशिकाओं में डीएनए फैलाना अनुमति चाहिए.
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पशु प्रयोगों के सभी संस्थागत पशु की देखभाल और Rutgers विश्वविद्यालय में सुविधाएं समिति द्वारा अनुमोदित किया गया.
हम अपने HD कैमरा का उपयोग (तोप VIXIA HFS100) के लिए श्री Maaz Enver धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के भाग में (EY018738) एनआईएच, स्पाइनल कॉर्ड अनुसंधान पर न्यू जर्सी आयोग (08-3074-SCR ई 0 और 10-3091-SCR-ई 0), और Busch जैव चिकित्सा अनुसंधान पुरस्कार से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
Do you think it would be possible to perform this teqnique on much older embryos, in ovo?
How do you confirm that the injection was in place?
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ReplyPosted by: Yael K.January 7, 2013, 6:38 AM