The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
Authors
The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages
1Department of Pharmacology, University of Medicine and Dentistry of New Jersey-Robert Wood Johnson Medical School, 2Department of Biomedical Engineering, Rutgers University
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
Recommend JoVE to Your LibrarianCurrent Access Through Your IP Address
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 50.19.155.235, User IP: 50.19.155.235, User IP Hex: 840145899
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
Islam, M. M., Doh, S. T., Cai, L. In Ovo Electroporation in Embryonic Chick Retina. J. Vis. Exp. (60), e3792, doi:10.3791/3792 (2012).
شبكية العين الدجاج الجنينية هو أداة ممتازة لدراسة تطوير شبكية العين في الفقاريات العليا. بسبب الحجم الكبير والتنمية الخارجية، فمن السهل جدا نسبيا لمعالجة شبكية العين كتكوت الجنينية باستخدام المؤتلف DNA / RNA التكنولوجيا. Electroporation من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي في البنى الشبكية الجنينية تتمتع بميزة كبيرة لدراسة تنظيم الجينات في الخلايا الجذعية / السلف في شبكية العين خلال تطوير شبكية العين. لا يمكن أن يؤديها نوع مختلف من فحوصات مثل فحص الجينات المراسل، جين الافراط في التعبير، والجينات بهدم (shRNA) وما إلى ذلك باستخدام تقنية electroporation. هذا الفيديو يشرح حقن في شبكية العين، واستهدفت في electroporation البيضة في شبكية العين كتكوت الجنينية في هامبورغ وهاملتون مرحلة 22-23، وهي عبارة عن يوم الجنينية 4 (E4). هنا نعرض سريعة ومريحة في تقنية electroporation البيضة حيث يتم تسليمها مباشرة البلازميد التي تعبر عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) كعلامة فيكتكوت الجنينية الفضاء تحت الشبكية وتليها نبضات كهربائية لتسهيل امتصاص الحمض النووي عن طريق الخلايا الجذعية / السلف في شبكية العين. طريقة جديدة للحقن في شبكية العين وelectroporation في E4 يسمح التصور من جميع أنواع الخلايا في شبكية العين، بما في ذلك الخلايا العصبية في وقت متأخر من مواليد 1، والتي كان من الصعب مع الأسلوب التقليدي للحقن وelectroporation في E1.5 2.
منذ يتم تنفيذ بعض أجزاء من بروتوكول كما هو موضح سابقا في أشرطة الفيديو وغيرها [جوف] 2 و 3 ورقات مع تعديلات طفيفة لن نناقش هذه بالتفصيل هنا.
1. التعامل مع البيض وتحضير الإبرة
2. الحقن وElectroporation
3. ممثل النتائج
في دراستنا، ونحن نستخدم بنيات بلازميد مختلفة لدراسة تنظيم التعبير الجيني التي تنطوي على تطوير خلية شبكية العين. في هذا الفيديو تم استخدام pCAG-GFP (مراقبة ترنسفكأيشن) لمتابعة حقن ناجحة وelectroporation. ومع ذلك، يمكن استخدام أي بناء البلازميد مع الجينات مراسل (GFP، طلب تقديم العروض وغيرها). ويمكن أن ينظر إليه على الرغم من GFP التعبير في أقرب وقت 8 ساعات بعد ايلىctroporation، ونحن عادة ما تبدأ حصاد البيض في يوم 6 (E6) وما بعده. تم تشريح Electroporated شبكية العين من الجنين وتحليلها تحت مجهر تشريح فلوري قبل دمج وباجتزاء. عادة، يمكن أن ينظر مراسل التعبير الجيني في ما لا يقل عن ربع شبكية العين بعد electroporation الناجحة (الشكل رقم 1). وقد تم تحليل مزيد من أنسجة الشبكية من خلال transfected باجتزاء لتصور واضح للmorphologies الخلية. المناعية باستخدام علامات نوع من الخلايا المحددة (Brn3a، Pax6 الخ) توصيف سمح التعبير GFP خلية محددة (الشكل رقم 2).
الشكل 1. تم حقن electroporation ناجحة للتعبير مراسل نتائج إيجابية GFP البلازميد. الدجاج الجنينية شبكية العين وelectroporated في يوم الجنينية (4) وتحصد في يوم الجنينية 6. وكان transfected بنجاح ما لا يقل عن 25٪ من شبكية العين (وجهة نظر = الأعلى، B= عرض القاع). جدول المحامين = 1MM.
الشكل 2. توصيف GFP معربا عن خلايا الشبكية باستخدام المناعية. GFP معربا عن الأنسجة الشبكية في E7 مرحلة كانت ثابتة ومقطوع. ثم تم صبغ هذه المقاطع مع علامات خلية مختلف محددة. وقد استخدم Brn3a لتحديد خلايا العقدة (أ) في حين كان يستخدم لتحديد Pax6 أفقي، عديم الاستطالات وخلايا العقدة (B). شريط النطاق = 50 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
استهدفت حقن في شبكية العين وelectroporation البيضة في شبكية العين في المرحلة الجنينية E4 يمكن أن تستهدف على وجه التحديد الخلايا الاصلية في شبكية العين مما يؤدي إلى القدرة على تصور كل خلية شبكية العين 6 أنواع رئيسية على مستوى خلية واحدة. في electroporation البيضة في HH10 (~ E1.5) التي تستهدف الحويصلة البصرية قادرة على transfect الخلايا التي تضع لتشكيل العين. ومع ذلك، وهذه الخلايا لها دوران عالية جدا في هذا الوقت وهذه الطريقة ليست محددة لخلايا الشبكية. قد يكون من أن ارتفاع معدل دوران خلية يمنع التعبير مستقرة مستمرة. بواسطة E4، يتم وضع الجنين يكفي أن يتم تشكيل جميع الهياكل الرئيسية للعين ولكن الشباب ما يكفي من أن غالبية الخلايا في شبكية العين والخلايا الجذعية لا يزال في شبكية العين. ويمكن أيضا أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها على الربح / الخسارة من الدراسات وظيفة حيث يمكن استهداف الجين من اهتمام لدراسة التطور الطبيعي و / أو مرض في شبكية العين.
بعد نشرنا هذه التقنية في منطقتناورقة السابق 1، اتصل عدد من العلماء في هذا المجال لنا لمزيد من المساعدة في هذه التقنية. لذلك قررنا إنتاج هذا الفيديو عن التصور. وبالإضافة إلى ذلك، يتم وصف التطورات في تقنية لدينا في هذا الفيديو.
لتنفيذ هذه التقنية بنجاح، والعوامل الحاسمة في أعقاب تستحق وصف.
العامل الأكثر أهمية هو وضع الإبرة على وجه التحديد في الفضاء تحت الشبكية. أولا، يحتاج المرء أن يكون حذرا لتحقيق المواءمة بين إبرة مضاد الوحشي على حزمة رئيسية من الأوعية الدموية التي تدخل العين ومشيرا نحو منقار. هذا الموقف هو مواز تقريبا للقلب، ويقلل من فرصة لتلف في الدماغ والقلب. عندما اختراق من خلال غشاء المحي، الصلبة، شبكية العين والفكاهة زجاجي، ينبغي أن إبرة ليس السفر بعيدا، وبيرس من خلال أي وريد الدم. إذا كانت إبرة حادة بما فيه الكفاية ومن ثم يمكن القيام بذلك بسهولة جدا مع الممارسات قليلة. الخطوة التالية هي لسحب ببطء مرة الرابعةإبرة ه وضعه على حافة افتتاح شبكية العين. هناك دائما فرصة لتخلعها تماما. إذا كان ذلك يجب أن يحدث، ثم يمكن للمرء أن المحاولة مرة أخرى لوضع طرف الإبرة مرة أخرى في الجلسة الافتتاحية. وضع إبرة في الفضاء تحت الشبكية (ما بين الصلبة والشبكية) يتطلب الممارسة والصبر. في البداية، ويبدو من الصعب جدا، ولكن مع بعض الممارسة يصبح من السهل. في حين حقن محلول الحمض النووي داخل الفضاء تحت الشبكية، من المهم جدا لمراقبة تشكيل انتفاخ. بعد ذلك، والحل يبدأ أخضر ملء الخطوط العريضة للعين، مما يدل على نجاح الحقن. إذا كان هذا الحل بعيدا أو ينشر يبدأ تعبئة في وسط العين، وهذا يدل على وجود حقن غير صحيحة والتي لن تسفر عن electroporation ناجحة.
والعامل الثاني هو تلفيق من إبرة المثلى التي تتم عن طريق الحرارة سحب أنبوب زجاجي الشعرية وكسر طرف. الإبر مع نصائح كبير صعوبة في اختراق عبتيough الغشاء المحي الذي يزيد من فرصة للإتلاف شبكية العين. عادة نصائح أكبر إبرة هي الأفضل لهذا الغرض. ومع ذلك، إبرة مع نصائح صغيرة جدا صعوبة في تحميل وتسليم الحمض النووي ولها فرصة أكبر لكسر داخل مقلة العين. لهذا السبب نحن جعل الإبر مع افتتاح قمة في حوالي 0.1 ميكرون في القطر، وتفتق 20 مم 1. أيضا، أثناء تحميل مزيج من الحمض النووي من قطرة على قطعة من parafilm، من المهم جدا عدم تحميل الجزء الأخير من السائل كما أنه يزيد من فرص الحصول على الهواء داخل إبرة.
أخيرا، ووضع من الأقطاب الكهربائية حرج للغاية لتحقيق electroporation ناجحة. ينبغي أن توضع الأقطاب في مواز بحيث تقع العين النامية بين الأقطاب. وينبغي اتخاذ الحذر من لمس أي الأوعية الدموية الرئيسية أو القلب مع الأقطاب. قد تضر أي من هذه يؤدي إلى وفاة الجنين حتى بعد injecti ناجحفي. وعلاوة على ذلك، والعيون هما الموجهة بشكل مختلف. لذا، لا بد من أخذها في الحسبان لتغيير اتجاه القطب (إيجابية مقابل سلبي) بحيث القطب السالب يجب أن تكون دائما في الجانب حقن للسماح للمنتشر الحمض النووي في خلايا الشبكية تحت التيار الكهربائي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
وقد وافق كل من التجارب على الحيوانات من قبل رعاية الحيوانات المؤسسية واللجنة المرافق في جامعة روتجرز.
نود أن نشكر السيد معاذ أنور لاستخدام كاميرا HD له (كانون VIXIA HFS100). وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (EY018738)، نيو جيرسي جنة البحوث الحبل الشوكي (08-3074-SCR-E-0 و 10-3091-SCR-0-E)، وبوش جائزة بحوث الطبية الحيوية.
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fertilized pathogen-free (SPF) white leghorn chicken eggs | Sunrise Farms (Catskill, NY) | ||
| Chicken egg incubator | GQF Manufacturing | Model-1550 | Set to 60% humidity and 37.5°C. |
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | TW150F-4 | |
| 0.1 ml syringe | Hamilton Co | Gastight 1710 | Alternatively 1ml syringe can be used as well |
| Masterflex Silicone (peroxide) Tubing | Cole-Parmer | HV-96400-13 | Cut a small piece (1 cm) for attaching the glass needle to the syringe |
| Tweezers | Dumont | AA | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301-M3 | |
| Plasmid DNA | pCAG-GFP was borrowed from Dr. Connie Cepko | ||
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Dilute it to 0.025 % with PBS |
| Pulse generator | Harvard Apparatus | BTX ECM 830 | Square wave generator |
| Electrodes | Harvard Apparatus | BTX model 514 | Our electrodes were spaced 3-5 mm apart |
| Monochrome Digital Camera | Carl Zeiss, Inc. | Axiocam MRM | |
| Fluorescent Dissection Microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16FA | |
| Upright Fluorescence Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Zeiss Axio Imager A1 |
Do you think it would be possible to perform this teqnique on much older embryos, in ovo?
How do you confirm that the injection was in place?
1
ReplyPosted by: Yael K.January 7, 2013, 6:38 AM