Single-celle Analyse av Bacillus subtilis Biofilm Bruke fluorescensmikroskopi og flowcytometrisystemer

1. Merking B. subtilis og biofilmdannelse Analyseverdier

1. Forsterke ved PCR arrangøren regionen av genet av interesse. Vi viser som eksempel kloning av P _tapas, arrangøren av gener ansvarlig for produksjonen av TasA matrix protein ^26. Clone P _Tapa inn pkm008 vektor (skapt av Rudner lab,, USA Harvard Medical School. Boston) (fig 2).
2. Linearize plasmidene ved enzymatisk fordøyelse (Enzyme anbefales, XhoI).
3. Indusere naturlig kompetanse i B. subtilis belastning 168 ved å følge en trinn protokoll tidligere beskrevet av Harwood og Cutting ^27.
4. Tilsett lineært plasmider i kulturen av kompetente celler og velg for spektinomycin motstand etter to timers inkubering.
5. Stammer innhentet har satt konstruktet inn i nøytral amyE locus of B. subtilis ved å dobbeltklikke rekombinasjon (fig 4). Slik lageren dobbel-merket belastning, integrere andre reporteren inn den nøytrale locus Laca ved hjelp av plasmidet pDR183 vi presenterer i figuren tre. Sett denne reporteren bruke den samme teknikken vi beskrev ovenfor for innsetting av journalister klonet i pKM008.
6. Overfør reporter fra den belastningen 168 til NCIB3610 som er i stand til å danne biofilm. Bruk SPP1 phage transduksjon protokollen ^28,29. Grow donor belastning i TY medium (LB +10 mm MgSO ₄ +10 mM MnSO _4). Bland 200 mL av kulturen med 100 mL av phage lager fortynning. Legg 3 ml myk agar etter 30 min inkubasjon og la Phage glorier å oppstå ved 37 ° C.
7. Samle det myke agar. Sentrifuger det og passerer supernatant trodde en sprøyte 0,22 mikrometer filter. Bruk denne supernatant å infisere en kultur for mottakeren belastningen vokst i TY medium. Tilsett 30 mL til 10 ml av kultur fortynnes 1:10. Inkuber i 30 min og velger for antibiotikaresistens etter 24 timers inkubering.
8. SElect en koloni og dyrke det over natten på LB ved 37 ° C.
9. Spot 3 mL av natten kultur på solid biofilm-induserende medium MSgg 1,5% agar ^30. Tillat celler å vokse i løpet av 72 timer ved 30 ° C (figur 3). Etter tre dager med vekst, utviklet biofilm dannes på overflaten av MSgg agar en kompleks morfologisk arkitektur i overflaten av agar.

2. Biofilm Dispersion og Cell Fixation

1. Fjern biofilm formen overflaten av MSgg agar med en tannpirker eller pinsett. Konsistensen av biofilm bør tillate deg å å skrelle den av fra overflaten av agar i ett stykke.
2. Plasser biofilm i 3 ml PBS buffer og spre biofilmen av repetitive passasje gjennom en pipette eller en nål. Alternativt kan biofilm spredning gjøres ved hjelp av mild sonikator. Mild sonikator krever 12 pulser med en produksjon på 3 og amplitude på 0,7 sekunder.
3. Fiks prøvene før celle-enkelt analyse. Resuspend 300 mL av cellesuspensjon i 1 ml 4% paraformaldehyde løsningen og inkuberes ved romtemperatur i nøyaktig syv minutter.
   Sammensetning av 4% paraformaldehyde løsning:
   2 g paraformaldehyde
   50 ml PBS-buffer
   4 mL 10 N NaOH
   Filtrer løsningen gjennom et 0,22 um filter og delmengde
4. Vask cellene etter fiksering i PBS-buffer tre ganger og resuspender dem i 300 mL PBS-buffer.

3. Fluorescensmikroskopi

1. Hell 200 mL av 0,8% agarose over et objektglass og nøye dekke den med et annet lysbilde. Fjern det øverste lysbildet lavt etter 2 minutter for å få et lag av agarose knyttet til raset i bunnen.
2. Spot 2 mL av faste celler på overflaten av agarose laget og dekke den med et mikroskop cover glass.
3. Plasser prøven i fluorescens mikroskop. Vi bruker en Fluorescensmikroskop Leica DMI6000B utstyrt med en Leica CRT6000 iIlumination systemet. Filtrene for YFP er Ex: BP500/20, Em: BP535/30 og for CFP er Ex: BP426/20, Em: 480/40
4. Utsett prøve til en eksitasjon fluorescens mellom 50-200 ms. Sett eksitasjon perioden ifølge en negativ kontroll som viser ingen fluorescens i vilkårene valgt for forsøket.
5. Se fluorescens bildet til det samme bildet oppnådd med lyse felt. Flett de to bildene i ett bilde. Resultater hentet fra flyt fluorescensmikroskopi hjelp av en enkelt-merket belastning harboring reporteren P _tapas-YFP er representert i figur 6.

4. Kvantifisering av enkeltceller Bruke flowcytometrisystemer

1. Spre utvalget av faste celler ved hjelp av mild sonikator. Sonicate prøven utføre to serier på 12 pulser med en effekt på 5 og amplitude på 0,7 sekunder, for å spre klumper i enkeltceller uten å forårsake cellelyse. Bekreft effektiviteten av cellen spredning av lys mikroskopi. Fortynn prøven 1:100 i PBS-buffer før flowcytometri analyse. Vi bruker en strømningscytometer BD FACS Canto II. For YFP fluorescens, bruke en laser eksitasjon ved 488 nm kombinert med en 530/30 filter. For CFP fluorescens, bruke laser eksitasjon ved 405 nm kombinert med en 408/40 filter.
2. Kalibrer strømningscytometeret maskin med to negative kontroller. En prøve av PBS-buffer uten celler i suspensjon bør tjene som negativ kontroll for størrelsen på partiklene registrert av flowcytometeret. Et eksempel merket med uten fluorescens reporteren bør tjene som negativ kontroll for fluorescens følsomheten strømningscytometeret.
3. Plasser prøven merket med fluorescerende reporter i strømningscytometeret. For hver prøve, analysere minst 50.000 hendelser med en strømningshastighet mellom 300 og 3000 hendelser per sekund.
4. Fang data ved hjelp FACS Diva programvare (BD Biosciences) og analysere den ved hjelp FlowJo 8.5.2 programvare. Se fluorescens signaler til kontrollen som viserer ingen fluorescens.
5. Presentere dataene overvåker fluorescens signalet med en én-merket belastning i en to-aksene grafikk. Plott fluorescens signal oppdaget i X-aksen og antall celler uttrykker de ulike nivåer av fluorescens i Y-aksen. Resultater hentet fra flowcytometri analyse ved hjelp av en enkelt-merket belastning harboring reporteren P _tapas-YFP er representert i figur 8.
6. Presentere dataene overvåker fluorescens signal på en dobbel-merket belastning i en tre-akser grafikk. Plott fluorescens signalet til hver en av kanalene overvåkede i X og Y aksene (for eksempel, ville GFP måles i X-aksen og CFP på Y-aksen). Plott i Z-aksen antall celler uttrykker hver reporter og presentere dem som høydekurvene isolines som ville være vinkelrett på planet av papir (Fig. 9 og 10).

4. Representative Resultater

Når B. subtilis vokser på en plate av biofilm-induserende medium MSgg, biofilmdannelse er observert etter tre dagers inkubasjon ved 30 ° C ^30. Biofilmen viser sterk konsistens og det kunne skrelles bort fra overflaten av agar i ett stykke. Videre viser biofilm en kompleks morfologisk arkitektur som indikerer at de distinkte deltakende celle subpopulasjoner (Fig. 5). For eksempel produksjon av ekstracellulær matrix i biofilm resulterer i dannelsen av rynker på overflaten av kolonien. Denne funksjonen kan være korrelert med differensiering av en undergruppe matrix produsentene ^19. Tilsvarende er hevingen av flybilder strukturer på overflaten av biofilm indikasjon på tilstedeværelse av en undergruppe sporulating celler, ettersom sporene lokalisert i den apikale delen av disse strukturene ^30.

Eksempler på visualisering av celledifferensiering i en enkelt-merket og en dobbel-merket belastningen med fluorescens mikroskopi er represented i figur 6 og 7, henholdsvis. Singelen-merket belastning havner fluorescerende reporteren P _tapas-CFP som er uttrykt i subpopulasjon matrix produserende celler. Dette subpopulasjon er ansvarlig for å produsere og skille ut det ekstracellulær matrix som utgjør biofilm (Fig. 6). Den doble-merket belastning havner reporteren P _tapas-CFP ²⁶ og den ekstra reporter P _srfAA-YFP ^31. Denne andre reporter gjør det mulig å overvåke en undergruppe av celler ansvarlige for å skille ut det signaliserer molekyl surfactin, som utløser signaliserer kaskade til differensiering av matrix produsentene (Fig. 7). Subpopulasjon matrix produsentene er falsk farget i blått, mens en undergruppe surfactin produsentene er falsk farget i gult.

Flowcytometri analyse ved hjelp av en enkelt-merket belastning harboring reporteren P _tapas-YFP er presentert i figur 8. Ubehandlet kontroll belastning ikke harboringnoen fluorescerende protein genene viste en enkelt populasjon lav relativ fluorescens. Celler huser P _tapas-YFP hos ikke biofilm-induserende forhold ikke differensiere subpopulasjon matrix produsenter og hele befolkningen viste lav relativ fluorescens. I biofilm-induserende tilstand, oppstod en undergruppe av celler med høy relativ fluorescens, observert som en skulder til høyre for den lave relative fluorescens topp ^23.

Resultater hentet fra flowcytometri analyse ved hjelp av en dobbel-merket belastningen er representert i figur 9 og 10. Figur 9 overvåket subpopulasjoner av matrix produsenter og surfactin produsenter ved hjelp av dobbel-merket stamme P _tapas-CFP, P _srfAA-YFP. Som kontroll av bakgrunnsfluorescens brukte vi en stamme ikke harboring noen fluorescerende protein gener. Deretter oppdaget vi hver undergruppe matrix produsenter og surfactin produsenter i hver fluorescens kanal, med single-merket belastning s som kontroller. Den doble-merket stamme P _tapas-CFP, P _srfAA-YFP viste to subpopulasjoner av celler uttrykker høye nivåer av de fluorescerende reportere. Hver befolkningen rammes, viser at det er ingen overlapping i uttrykket av reporterne mellom de to subpopulasjoner av spesialiserte celler ^15. Tilsvarende flow cytometri analyse ved hjelp av dobbel-merket stamme P _SKF-YFP, P _tapas-YFP er presentert i figur 10. Reporteren for genet SKF overvåker differensiering av en undergruppe kannibaler ^32, som har blitt beskrevet å skille coordinately med en undergruppe matrix produsentene ^24. I dette tilfellet viste det dobbel-merket belastning ett subpopulasjon fluorescerende celler uttrykker både YFP og CFP. Dette indikerte at begge celledifferensiering veier er coordinately aktivert i samme undergruppe.

1.jpg "/>
Figur 1. Samlet ordningen av forsøket. Protokollen er delt i tre hovedtrinn. Det første trinnet krever merking belastningen av B. subtilis med reporteren fusjon som overvåker en undergruppe av interesse. Second, vokse merket stammer i biofilm-induserende forhold. Tredje, spre biofilm og gjennomføre encellet analyse av befolkningen bruker fluorescens mikroskop og flowcytometri.

Figur 2. Skjematisk fremstilling av integrasjonen vektoren pKM008. Denne vektoren integrerer reporteren fusjon av interesse i den nøytrale locus amyE ved å dobbeltklikke rekombinasjon. Arrangøren av interesse (P _tapas) er klonet inn i vektor med begrensning nettstedene EcoRI og HindIII. Deretter er det uttrykk for den felles fiskeripolitikken genet under kontroll av promotoren P _tapas. Den orientation av genene i plasmidet er representert som en pil.

Figur 3. Skjematisk fremstilling av integrasjonen vektoren pDR183. Denne vektoren integrerer reporteren fusjon av interesse i den nøytrale locus Laca ved å dobbeltklikke rekombinasjon. Sammensmeltingen av interesse (P _tapas - CFP) er klonet inn i vektor med begrensning nettstedene EcoRI og BamHI. Orienteringen av genene i plasmidet er representert som en pil.

Figur 4. Ordningen med integreringen av reporterne i kromosom av B. subtilis ved å dobbeltklikke rekombinasjon. (A) B. subtilis kromosom har to nøytrale loci, amyE og Laca, å integrere reporter fusjoner uten å påvirke utviklingen av biofilm. (B) B. subtilis ved å dobbeltklikke rekombinasjon. Reporteren fusjon integreres i den nøytrale locus i en stabil måte.

Figur 5. Biofilm dannelsen av B. subtilis NCIB3610. Process of bioflm dannelsen av belastningen B. subtilis NCIB 3610 da vokser på biofilm-induserende medium MSgg løpet av tre dager ved 30 ° C. Sekvensielle bilder av utviklingen av biofilm ble tatt hver 12h.

Figur 6. Visualisering av en undergruppe matrix produsenter under fluorescens mikroskop. En prøve fra en biofilm av B. subtilis P _tapas - CFP ble fiksert og undersøkt under fluorescens mikroskop. 200 ms av fluorescenseksitasjon dokumentert en undergruppe av celler som avgir høyere fluorescens enn resten av cellene. Vi mente dette subpopulasjon som en undergruppe av matrix-produserende celler. Scale bar er 3 mikrometer.

Figur 7. Visualisering av en undergruppe matrix produsenter og surfactin produsenter under fluorescens mikroskop. Eksempel fra en biofilm av B. subtilis P _tapas-CFP, P _srfAA-yfp dobbel-merket belastningen ble fiksert og undersøkt under fluorescens mikroskop. Eksponeringstid på 250 ms gjenspeiles to subpopulasjoner av celler som avgir høyere fluorescens enn resten av cellene. En undergruppe uttrykte YFP og det ble oppdaget utelukkende bruker YFP kanal (falsk farget i gult). Dette er en undergruppe surfactin produsenter. En annen undergruppe uttrykte CFP, og det var utelukkende påvises ved hjelp av CFP chann el. Dette er en undergruppe av matrix produsenter. Scale bar er 3 mikrometer.

Figur 8. Kvantifisering av en undergruppe matrix produsenter som bruker to-D flowcytometri. Spredt celler fra en biofilm av B. subtilis P _tapas-yfp ble overvåket ved hjelp av flowcytometri. Strømningscytometeret telte 50.000 hendelser og fluorescens signalet for hver hendelse ble overvåket. Antall celler telles plottes i Y-aksen, mens intensiteten av YFP signal plottes i X-aksen. Celler ble dyrket i LB medium for å få ikke-biofilm induserende forhold. Celler ble dyrket i MSgg medium for å få biofilm-induserende forhold. En undergruppe av matrix produsenter skiller bare i biofilm-induserende forhold. Dette tallet ble tilpasset fra López et al., PNAS (2009) 106 :280-285.

s/ftp_upload/3796/3796fig9.jpg "/>
Figur 9. Kvantifisering av en undergruppe matrix produsenter og surfactin produsenter som bruker 3-D flowcytometri. Fluorescence signal av kanalene overvåkede presenteres i X-aksen (for YFP) og Y-aksen (for CFP). Z-aksen måler antall celler uttrykker hver reporter, og det er kvantifisert som høydekurvene isolines vinkelrett på planet av papir. Antallet hendelser overvåkes i dette eksperimentet var 50.000 hendelser. Venstre øvre panel presenterer en kontroll av bakgrunnsfluorescens harboring ingen fluorescerende protein gener. Øvre høyre panel oppdager subpopulasjon surfactin produsenter i YFP fluorescens kanal (innrammet i gult) med en enkelt-merket stamme P _srfAA-YFP. Venstre bunn panel oppdager subpopulasjon matrix produsenter i CFP fluorescens kanal (innrammet i blått) med en enkelt-merket stamme P _tapas-CFP. Den doble-merket belastningen P _tapas </ Em>-CFP, P _srfAA-YFP overvåkes nederst i høyre panel. Det viste to subpopulasjoner som er innrammet i gult og blått. Dette tallet ble tilpasset fra López et al., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638.

Figur 10. Kvantifisering av en undergruppe matrix produsenter og kannibaler ved hjelp av 3-D flowcytometri. Fluorescence signal av kanalene overvåkede presenteres i X-aksen (for YFP) og Y-aksen (for CFP). Antallet hendelser overvåkes i dette eksperimentet var 50.000. Øvre høyre panel oppdager en undergruppe av kannibaler i YFP fluorescens kanal (innrammet i gult) i en enkelt-merket stamme P _SKF-YFP. Venstre bunn panel oppdager subpopulasjon matrix produsenter i CFP fluorescens kanal (innrammet i blått) i en enkelt-merket stamme P _tapas-CFP. Double-merket stamme P _tapas-CFP, P _SKF-YFP viste bare en undergruppe av celler i diagonal til X og Y-aksene (innrammet i grønt). Dette subpopulasjon er oppdaget i YFP og CFP kanal fordi den uttrykker de to journalistene samtidig. López et al., Genes and Development (2009) 23 :1631-1638.

Det faktum at bakterielle samfunn viser subpopulasjoner av celler uttrykker spesifikke sett av gener bevis kompleksitet mikrobielle samfunn ^33,34. Denne protokollen skal bidra til å avgjøre om uttrykket av noen genet av interesse er begrenset til en bestemt undergruppe av spesialiserte celler i løpet av det mikrobielle samfunn. Visualisering av disse subpopulasjoner krever utvikling av nye teknikker, fordi tradisjonelle metoder for å overvåke genuttrykket eller microarray analyse rente nivåene av genuttrykk til hele mikrobielle samfunn og svingninger i genuttrykket i det mikrobielle samfunnet generelt savnet.

Fluorescens mikroskopi og flowcytometri komplement ideelt for analyse av celletyper å gi en kombinasjon av kvalitative og kvantitative som vil definere av en undergruppe av interesse. Begrensninger av begge teknikkene gjør dem nødvendig å henvise til hverandre for the skyld nøyaktigheten av målingene. I tilfelle av fluorescens mikroskopi, varierer intensiteten av signalet fra fluorescerende celler (og noen ganger størrelsen av en undergruppe), avhengig av eksponering tid brukt til å opphisse prøvene (normalt mellom 50 og 200 msek). I tilfelle av flowcytometri imidlertid begrenser den lille størrelsen på bakterieceller påvisning og noen bakterier ikke kan overvåkes. På grunn Cellestørrelse restriksjoner, bør fluorescens signalet som sendes ut fra reporteren være høy nok til at påvisning av fluorescens og, nettopp på grunn av dette har vi opplevd problemer i påvisning av celler uttrykker reportere med lavt uttrykk nivå. Men nye flowcytometere nå kommet med en mer sensitiv deteksjonsgrensen, som tillater oss å overvåke bakterielle populasjoner i en mer presis måte. I tillegg vil høyere følsomhet i deteksjonsgrensen tillate oss å analysen for celle sortering, å isolere en undergruppe av celler vi er interested i og gjennomføre genekspresjonsanalyse i denne undergruppe.