पीला रंग - निर्भर Monooxygenase reductive और ऑक्सीडेटिव आधा प्रतिक्रियाओं के निरीक्षण रूका फ्लो Spectrophotometry का उपयोग

Romero, E., Robinson, R., Sobrado, P. Monitoring the Reductive and Oxidative Half-Reactions of a Flavin-Dependent Monooxygenase using Stopped-Flow Spectrophotometry. J. Vis. Exp. (61), e3803, doi:10.3791/3803 (2012).

1. Anaerobic बफर की तैयारी

1. 1 100 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर, 7.5 पीएच के एल तैयार. हलचल पट्टी के साथ एक 500 - एमएल BUCHNER कुप्पी में बफर के 250 एमएल डालो.
2. रबड़ डाट के साथ फ्लास्क सील और यह एक हलचल थाली पर जगह है. कुप्पी की एक Schlenk लाइन के लिए कम ट्यूब कनेक्ट.
3. देगास आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 5 घंटे के लिए वैक्यूम के तहत बफर. इस समय अवधि के दौरान, 5 शून्य के लगातार दौर degassing और argon के साथ निस्तब्धता हर घंटे के प्रदर्शन.
4. 10 सेकंड के लिए argon के साथ फ्लास्क फ्लश और यह निर्वात कई गुना से डिस्कनेक्ट. दस्ताना बॉक्स के अंदर कुप्पी रखें.
5. दस्ताना बॉक्स में कुप्पी खुला जोरदार आंदोलन के साथ रातोंरात छोड़ो.

2. रूका प्रवाह प्रणाली से ऑक्सीजन हटा

1. 0.1 एम सोडियम एसीटेट, पीएच 5.0 से 1 एल तैयार. इस बफर के 125 एमएल 250 एमएल BUCHNER कुप्पी में डालो और कदम 1.2-1.4 प्रदर्शन.
2. 5 से बाहर वजनमिलीग्राम Aspergillus नाइजर (181,300 यू / छ) और 0.9 ग्राम ग्लूकोज का उपयोग एक 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब और 50 एमएल फाल्कन चोटीदार ट्यूब, क्रमशः से ग्लूकोज oxidase. दस्ताना बॉक्स में दोनों कंटेनर रखें.
3. Anaerobic एम 0.1 सोडियम एसीटेट, पीएच 5.0 (18.13 यू / एमएल के अंतिम सांद्रता और 100 मिमी, क्रमशः) के 50 एमएल में ग्लूकोज oxidase और ग्लूकोज भंग. इस समाधान (चित्रा 1) जलाशय सीरिंज के साथ भरें.
4. सुनिश्चित करें कि ड्राइव वाल्व "लोड" स्थिति में हैं और भरने के ड्राइव सीरिंज (चित्रा 1). "ड्राइव" की स्थिति को एफ वाल्व बंद. समर्थक डेटा नियंत्रण सॉफ्टवेयर में खाली पर क्लिक करके रोक सिरिंज खाली. प्रवाह सर्किट के माध्यम से मैन्युअल रूप से इसी ड्राइव राम को ऊपर उठाने के द्वारा ड्राइव सिरिंज एफ से बफर धक्का. इस चरण में कुल दस बार दोहराएँ. अन्य तीन ड्राइव सीरिंज के साथ एक ही प्रक्रिया का प्रदर्शन करते हैं. एक घंटे रुको.
5. एक ही बफर contai साथ जलाशय सीरिंज का समाधान बदलेंग्लूकोज oxidase और ग्लूकोज Ning के. 2.4 कदम दोहराएँ.
6. 2.5 दोहराएँ कदम और समाधान प्रवाह प्रणाली में खड़ा करने के लिए रात भर देते हैं.
7. रात भर ऊष्मायन के बाद, फिर से 2.5 कदम.

3. आक्सीजन संतृप्त बफर की तैयारी

1. 100 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर (7.5 पीएच) तैयार है और 50 एमएल की शीशी में हलचल पट्टी के साथ 50 एमएल डालना. Wheaton डाट और एक Wheaton एल्यूमीनियम सील के साथ शीशी टोपी.
2. बर्फ पर शीशी रखें. एक लंबे समय तक एक समाधान में 100% ऑक्सीजन युक्त टैंक से जुड़ा सुई को विसर्जित कर दिया. वेंट रूप शीशी के डाट के माध्यम से एक और छोटी सुई डालें.
3. आंदोलन के साथ 1 घंटे के लिए 100% ऑक्सीजन बुलबुला साथ समाधान.
4. पहले शीशी से कम सुई को हटाने और लंबी सुई को हटाने से पहले 10 सेकंड प्रतीक्षा है. दस्ताना बॉक्स में बंद शीशी रखें.

4. NADPH समाधान की तैयारी

1. एक 1.5 एमएल Eppendorf ट्यूब में NADPH के 1 मिलीग्राम वजन और मैं जगहदस्ताना बॉक्स में टी.
2. के anaerobic 100 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर, 7.5 पीएच के 300 μL में NADPH भंग. दस्ताना बॉक्स से इस समाधान का 30 μL निकालें स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (ε ₃₄₀ = +६२७० एम ^{-1 -1} सेमी _{एनएम)} के साथ NADPH एकाग्रता का निर्धारण.

5. ऑक्सीजन के एनजाइम समाधान से हटाने

1. और दस्ताने बॉक्स में फ्रीजर पिघलना से एंजाइम स्टॉक समाधान की 400 μL लो. एंजाइम स्टॉक समाधान (360 माइक्रोन) 100 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट (7.5 पीएच) 100 मिमी NaCl युक्त बफर में पहले से तैयार किया गया था, और तरल नाइट्रोजन में जमे हुए है.
2. हलचल पट्टी के साथ एक 25 एमएल की शीशी में स्थानांतरण एंजाइम समाधान के लिए, Wheaton डाट और एक Wheaton एल्यूमीनियम सील के साथ शीशी टोपी और दस्ताने बॉक्स से हटा दें.
3. बर्फ पर शीशी प्लेस और एक Schlenk लाइन के लिए यह शीशी डाट माध्यम से एक सुई डालने से कनेक्ट.
4. 5 की लगातार राउंड प्रदर्शन से एंजाइम समाधान देगासनिर्वात degassing और argon के साथ की निस्तब्धता 1 घंटे के लिए हर 20 मिनट.
5. 10 सेकंड के लिए argon के साथ शीशी फ्लश और यह निर्वात कई गुना से डिस्कनेक्ट. दस्ताना बॉक्स के अंदर बर्फ पर शीशी रखें.

6. Reductive आधा प्रतिक्रिया निगरानी पीला रंग में कमी

1. साधन बंद कर दिया प्रवाह और समर्थक निर्माता प्रोटोकॉल के बाद एकल मिश्रण मोड के लिए डेटा नियंत्रण सॉफ्टवेयर तैयार करते हैं.
2. एक परिसंचारी पानी स्नान (15 डिग्री सेल्सियस) पर बारी. के माध्यम से 20 मिनट के लिए नाइट्रोजन बुदबुदाती पानी से ऑक्सीजन निकालें. यह प्रवाह सर्किट के माध्यम से ऑक्सीजन के संक्रमण से बचाता है.
3. परिसंचारी स्नान के लिए बंद कर दिया प्रवाह के पानी स्नान आवास को जोड़ने के द्वारा ड्राइव सीरिंज का तापमान और अवलोकन सेल में 15 डिग्री सेल्सियस बनाए रखें.
4. समर्थक डेटा नियंत्रण सॉफ्टवेयर का चयन photodiode सरणी, बाहरी ट्रिगर (रोका प्रवाह आपरेशन सक्रिय करने के लिए), और Logarit के नियंत्रण कक्ष की खिड़की मेंhmic पैमाने.
5. समर्थक दर्शक डेटा सॉफ्टवेयर लांच और निर्देशिका है जहाँ डेटा फ़ाइलों को संग्रहीत किया जाएगा परिभाषित.
6. जलाशय सीरिंज सी और anaerobic 100 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर (7.5 पीएच) के साथ एफ के समाधान बदलें. सी और "ड्राइव" की स्थिति को एफ वाल्व बारी. समर्थक डेटा नियंत्रण सॉफ्टवेयर में खाली क्लिक करके रोक सिरिंज खाली. मैन्युअल रूप से कुल इसी ड्राइव राम पांच बार के स्थापना (राम के प्रत्येक आंदोलन से पहले खाली क्लिक करें) के द्वारा बफर दोनों प्रवाह सर्किट के माध्यम से ड्राइव सीरिंज से पुश.
7. आदेश में करने के लिए सुनिश्चित करें कि ग्लूकोज oxidase प्रवाह सर्किट से पूरी तरह से हटा दिया गया है, कुल में 6.6 चार बार कदम प्रदर्शन करते हैं.
8. समर्थक डेटा नियंत्रण सॉफ्टवेयर में बेसलाइन पर क्लिक करें.
9. Anaerobic 100 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर (15 माइक्रोन का रोका प्रवाह में मिश्रण करने के बाद अंतिम एकाग्रता) के 1100 μL साथ एंजाइम स्टॉक समाधान के 100 μL मिश्रण.
10. जलाशय SYR का समाधान बदलेंInge एफ एंजाइम समाधान के साथ. "ड्राइव" की स्थिति को एफ वाल्व बंद. समर्थक डेटा नियंत्रण सॉफ्टवेयर में खाली क्लिक करके रोक सिरिंज खाली. प्रवाह सर्किट के माध्यम से मैन्युअल रूप से इसी ड्राइव राम को ऊपर उठाने के द्वारा ड्राइव सिरिंज एफ से एंजाइम समाधान धक्का. कुल में तीन बार प्रदर्शन करते हैं. प्रो - नियंत्रण डेटा सॉफ्टवेयर में, 60 है अधिग्रहण के समय सेट.
11. सुनिश्चित करें कि दोनों ड्राइव सीरिंज उनके इसी समाधान और ड्राइव मेढ़े के साथ भर रहे हैं ड्राइव सिरिंज पिस्टन के साथ संपर्क में हैं. "ड्राइव" स्थिति के लिए दोनों वाल्व बंद करने और समर्थक डेटा नियंत्रण सॉफ्टवेयर में प्राप्त करने के लिए ड्राइव प्रदर्शन क्लिक करें. इस कदम को दो बार दोहराएँ तीन प्रतियों में डेटा प्राप्त. एंजाइम का ऑक्सीकरण फार्म का यह पैदावार स्पेक्ट्रा.
12. एक _{452 एनएम} ड्राइव से प्राप्त मान का प्रयोग, मिश्रण (ε ₄₅₂ = 13,700 एम ^{-1 -1} सेमी _{एनएम)} के पहले एंजाइम एकाग्रता का निर्धारण और एक NADPH solutio की 4 एमएल तैयार1.5 गुना अधिक ध्यान केंद्रित किया.
13. NADPH समाधान और खाली और फिर से भरना रोक सिरिंज तीन बार के रूप में 6.10 में वर्णित साथ जलाशय सिरिंज सी के समाधान बदलें.
14. 6.11 कदम दोहराएँ. एंजाइम की कमी के दौरान यह पैदावार स्पेक्ट्रा.

7. Oxidative आधा प्रतिक्रिया: मॉनिटरिंग पीला रंग ऑक्सीकरण

1. साधन बंद कर दिया प्रवाह और समर्थक निर्माता प्रोटोकॉल के बाद डबल मिश्रण मोड के लिए डेटा नियंत्रण सॉफ्टवेयर तैयार करते हैं.
2. 6.2-6.5 कदम दोहराएँ.
3. Anaerobic 100 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर (7.5 पीएच) के साथ चार जलाशय सीरिंज में समाधान बदलें. "ड्राइव" की स्थिति को एफ वाल्व बंद समर्थक डेटा नियंत्रण सॉफ्टवेयर में खाली क्लिक करके खाली रोक सिरिंज. मैन्युअल रूप से इसी ड्राइव राम को ऊपर उठाने के द्वारा ड्राइव प्रवाह सर्किट के माध्यम से सिरिंज एफ से बफर धक्का. इस कदम प्रत्येक ड्राइव सिरिंज के साथ कुल में पांच बार प्रदर्शन करना.
4. 7.3 मुन्ना में चार बार कदम प्रदर्शन करनाअल प्रवाह सर्किट से पूरी तरह से सामग्री हटाने के.
5. समर्थक डेटा नियंत्रण सॉफ्टवेयर में बेसलाइन पर क्लिक करें.
6. Anaerobic 100 मिमी पोटेशियम फॉस्फेट बफर (15 माइक्रोन का रोका प्रवाह में मिश्रण करने के बाद अंतिम एकाग्रता) के 1000 μL साथ एंजाइम स्टॉक समाधान के 200 μL मिश्रण.
7. एंजाइम समाधान के साथ एक जलाशय सिरिंज के समाधान बदलें. "ड्राइव" स्थिति वाल्व एक बारी. समर्थक डेटा नियंत्रण सॉफ्टवेयर में खाली क्लिक करके रोक सिरिंज खाली. ड्राइव सिरिंज से प्रवाह एक सर्किट के माध्यम से मैन्युअल रूप से इसी ड्राइव राम को ऊपर उठाने के द्वारा एंजाइम समाधान धक्का. इस चरण में कुल तीन बार प्रदर्शन करते हैं. समर्थक डेटा नियंत्रण सॉफ्टवेयर में देरी के लिए 0.5 है और अधिग्रहण के समय 60 है निर्धारित किया है.
8. सुनिश्चित करें कि सभी ड्राइव सीरिंज उनके इसी समाधान और ड्राइव मेढ़े के साथ भर रहे हैं ड्राइव सिरिंज पिस्टन के साथ संपर्क में हैं. "ड्राइव" स्थिति के लिए सभी वाल्व बारी और समर्थक - Dat मोल क्लिक करेंकरने के लिए ड्राइव करने के लिए एक नियंत्रण सॉफ्टवेयर. इस चरण को दोहराएँ दो बार के लिए तीन प्रतियों में डेटा प्राप्त कर सकते हैं. एंजाइम का ऑक्सीकरण फार्म का यह पैदावार स्पेक्ट्रा.
9. NADPH 1.5 गुना अधिक सिरिंज ए में एंजाइम समाधान के "ड्राइव" स्थिति और खाली और स्टाप सिरिंज के तीन बार के रूप में 7.7 में वर्णित फिर से भरना करने के लिए बी वाल्व बंद की तुलना में केंद्रित समाधान साथ जलाशय सिरिंज बी के समाधान बदलें.
10. ऑक्सीजन बफर के साथ जलाशय सिरिंज सी के समाधान बदलें. "ड्राइव" स्थिति और खाली और स्टॉप सिरिंज के तीन बार 7.7 में वर्णित के रूप में फिर से भरना करने के लिए सी वाल्व बारी. प्रो - नियंत्रण डेटा सॉफ्टवेयर में, 15 और 900 है पर देरी और अधिग्रहण के समय क्रमशः सेट,.
11. 7.8 कदम दोहराएँ. पूरी तरह से कम एंजाइम की reoxidation दौरान यह पैदावार स्पेक्ट्रा.

8. डेटा विश्लेषण

1. समर्थक डाटा कनवर्टर सॉफ्टवेयर लांच. विकल्प आइकन पर क्लिक करें और ProDataCSV में सहेजें का चयन करें.
2. खुलानिर्देशिका है जहाँ डेटा फ़ाइलों को संग्रहीत किया गया. एपीएल समर्थक डाटा कनवर्टर खिड़की करने के लिए फ़ाइलों को खींचें. सीऍसवी प्रारूप में फाइल के रूप में एक ही निर्देशिका में डेटा स्वचालित रूप से सहेजा जाएगा.
3. सीऍसवी प्रारूप का उपयोग करके फ़ाइलें माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल (माइक्रोसॉफ्ट, रेडमंड, WA, संयुक्त राज्य अमरीका) खोलें. 700 एनएम पर इसी अवशोषण subtracting द्वारा बंद कर दिया प्रवाह के निशान की आधारभूत मानक के अनुसार.
4. सही घातीय समारोह के लिए उपयुक्त समय की तुलना में इसी अधिकतम absorbance की साजिश फिटिंग के द्वारा KaleidaGraph (सिनर्जी सॉफ्टवेयर, पढ़ना, PA) का उपयोग निशान का विश्लेषण. चित्रा 2B, 452 एनएम के absorbance के क्रम में करने के लिए और बंद कर दिया साधन - प्रवाह में एंजाइम NADPH मिश्रण के बाद पीला रंग में कमी की दर निर्धारित समय के एक समारोह के रूप में प्लॉट किए जाते दिखाया गया है. इस मामले में, डेटा का सबसे अच्छा फिट प्राप्त हुई थी एक डबल घातीय समीकरण और 0.65 और 0.23 ^-1 की दर का उपयोग कर रहे थे कमी, Res के पहले और दूसरे चरण के लिए गणनाpectively. के मध्यवर्ती C4a - hydroperoxyflavin और ऑक्सीजन के साथ कम एंजाइम की प्रतिक्रिया के बाद reoxidation के गठन की दर निर्धारित करने के लिए, हम 380 और 452 एनएम, क्रमशः (3B चित्रा) में बंद कर दिया प्रवाह के निशान का विश्लेषण किया. एक घातीय समीकरण का प्रयोग, हम oxidative आधा प्रतिक्रिया की पहले और दूसरे चरण के लिए क्रमश: 1.4 और 0.006 एस ^-1 की दर की गणना,.

9. प्रतिनिधि परिणाम

पिछले अनुभागों में वर्णित प्रयोगों से परिणाम बताते हैं कि कैसे एक च सीडा की reductive आधा प्रतिक्रिया 452 एनएम absorbance में परिवर्तन है, जो पीला रंग की redox राज्य में परिवर्तन के अनुरूप मापने के द्वारा नजर रखी जा सकती है. इस कदम की दर उचित समीकरण (8.4 चरण चित्रा 2) के लिए डेटा फिटिंग द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. कमी प्राप्त दर (0.65 एस ^-1) कश्मीर _{बिल्ली} के साथ परिकलित मान के समान हैस्थिर राज्य ² प्रयोगों, सुझाव है कि कमी प्रतिक्रिया की दर निर्धारण कदम है. डबल रोका प्रवाह के मिश्रण मोड का लाभ उठाते हुए, ऑक्सीकरण और इस आधे प्रतिक्रिया में मध्यवर्ती की दर (8.4 चरण चित्रा 3) निर्धारित किया जा सकता है. एक च सीडा द्वारा उत्प्रेरित प्रतिक्रिया में, C4a - hydroperoxyflavin स्पष्ट रूप से (λ 380 एनएम के _{अधिकतम)} का पता चला है, और गठन और क्षय की दर की गणना की जा सकती है. प्राप्त reoxidation (0.006 ^-1 s) की धीमी दर को इंगित करता है कि C4a hydroperoxyflavin अभाव में बहुत स्थिर ओर्निथिन है.

योजना 1. एक च सीडा के तंत्र. धुनी cofactor के isoallozaxine अंगूठी दिखाया गया है. ऑक्सीकरण पीला रंग (ए) (बी) में NADPH बांध और कम पीला रंग और (सी) NADP फार्म प्रति प्रतिक्रिया करता है. आणविक ऑक्सीजन और के बंधन के साथ प्रतिक्रिया के बादओर्निथिन, C4a - hydroperoxyflavin, (डी) का गठन किया गया है. यह hydroxylating प्रजातियों है. ओर्निथिन की hydroxylation के बाद, hydroxyflavin (ई) के लिए ऑक्सीकरण एंजाइम के रूप में निर्जलित होना चाहिए. NADP ⁺ उत्प्रेरक चक्र के दौरान ही रहता है और अंतिम उत्पाद (एफ) जारी किया है.

चित्रा 1 साधन बंद कर दिया प्रवाह. ए) एप्लाइड Photophysics SX20 के घटकों के चित्र स्पेक्ट्रोफोटोमीटर प्रवाह बंद कर दिया. बी नमूना हैंडलिंग इकाई के चित्र). सी) डबल मिश्रण मोड में प्रवाह सर्किट की योजना.

चित्रा 2 NADPH साथ सीडा की अवायवीय बंद कर दिया साधन के प्रवाह में कमी. एक) वर्णक्रमीय परिवर्तन 30 माइक्रोन सीडा और 45 माइक्रोन NADPH के बराबर मात्रा के मिश्रण के बाद दर्ज की गई. पहले (सीडा ऑक्सीकरण) स्पेक्ट्रम और पिछले स्पेक्ट्रम (पूरी तरह से सिड कमएक) क्रमश: नीले और लाल रंग में प्रकाश डाला है. बी) 452 एनएम पर समय के एक समारोह के रूप में दर्ज Absorbance ट्रेस.

बंद कर दिया साधन - प्रवाह में चित्रा 3. सीडा के ऑक्सीकरण. ए) का मिश्रण बराबर संस्करणों के बाद पूरी तरह से कम सीडा और ऑक्सीजन बफर वर्णक्रमीय परिवर्तन दर्ज की गई. अंतिम सांद्रता 15 माइक्रोन सीडा, 22.5 माइक्रोन NADPH, और 0.95 मिमी ऑक्सीजन थे. स्पेक्ट्रम 0.034, 4.268 पर दर्ज की गई, और 727.494 है पूरी तरह से कम एंजाइम, C4a - hydroperoxyflavin के मध्यवर्ती (λ 380 एनएम के _{अधिकतम),} और ऑक्सीकरण एंजाइम (450 एनएम के _{अधिकतम} λ) से मेल खाती है, क्रमशः. बी) के 382 और 452 एनएम पर Absorbance का पता लगाने के समय के एक समारोह के रूप में दर्ज की गई.

Redox प्रतिक्रियाओं उत्प्रेरित एंजाइमों कि आमतौर पर hemes और flavins कि उत्प्रेरक चक्र के दौरान महत्वपूर्ण absorbance के परिवर्तन से गुजरना जैसे cofactors होते हैं. पीला रंग का ऑक्सीकरण फार्म absorbance के मॅक्सिमा ~ 360 और 450 एनएम पर प्रस्तुत करता है, और इसकी कमी आम तौर पर ⁷ एनएम पर 450 absorbance के कमी के बाद से नजर रखी है. सामान्य में, कुछ क्षणिक मध्यवर्ती मौजूद है, लेकिन फार्म और क्षय भी नियमित spectrophotometers में मापा जा तेजी से कर रहे हैं. एप्लाइड Photophysics SX20 रोका प्रवाह स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (या इसी तरह के उपकरण) का उपयोग करना, यह संभव है absorbance के millisecond के समय के पैमाने में परिवर्तन (मृत समय, 2 एमएस) को मापने के. यहाँ हम पीला रंग पर निर्भर monooxygenase एक च सीडा reductive और oxidative आधा प्रतिक्रियाओं का अध्ययन किया, एक मॉडल के रूप में सेवारत. hydride हस्तांतरण की दर anaerobic शर्तों के तहत एंजाइम NADPH साथ मिश्रण के बाद 452 एनएम absorbance के परिवर्तन को मापने के द्वारा निर्धारित किया गया था. बाद में, लाभ लेने केरोका साधन - प्रवाह की डबल मिश्रण मोड के ई, एंजाइम पहले NADPH साथ प्रतिक्रिया व्यक्त किया गया था, जब तक पूर्ण कमी हासिल की थी, तो कम एंजाइम NADP ⁺ जटिल ऑक्सीजन के साथ मिलाया गया था. इस प्रक्रिया के बाद, यह संभव है क्षणिक ऑक्सीजन पीला रंग मध्यवर्ती पता लगाने के लिए और गठन और क्षय की दर को मापने. इन मध्यवर्ती की पहचान कटैलिसीस प्रतिक्रिया प्रजातियों में से एक प्रकृति के बारे में प्रयोगात्मक डेटा प्रदान करता है. एक च सीडा, (आम तौर पर 370-380 एनएम पर निगरानी) C4a hydroperoxyflavin, जो hydroxylating प्रजातियों के गठन के मामले में. इसके अलावा, हर कदम की स्थिर दर को मापने के एक दर का निर्धारण प्रतिक्रिया के कदम के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए और मदद करने के लिए एंजाइम की गतिज और रासायनिक तंत्र स्पष्ट अनुमति देता है.

सामान्य में, समान दृष्टिकोण के अन्य flavoenzymes, या प्रोटीन जैसे प्रोटीन absorbance के जो परिवर्तन हुआ है, के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि आगेऐन heme, pyridoxal फॉस्फेट, या गैर heme ^8-10 लोहा. इस विधि के लिए एक सीमा है कि शुद्ध एंजाइम की बड़ी मात्रा की आवश्यकता है, लेकिन यह उच्च पैदावार साथ एक अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके दूर किया जा सकता है. एक पर्याप्त प्रोटीन ताकि एक मजबूत पर्याप्त संकेत देखा जा सकता है का उपयोग करने के द्वारा रिकॉर्डिंग स्पेक्ट्रा के लिए इष्टतम प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करता है, लेकिन नहीं भी इतना है कि एंजाइम नहीं बर्बाद किया है. आमतौर पर, पीला रंग युक्त एंजाइमों रोका प्रवाह प्रयोगों में इस्तेमाल के लिए सबसे कम एंजाइम एकाग्रता 6-10 माइक्रोन (मिश्रण बाद) है और इसी एंजाइम की दाढ़ विलुप्त होने गुणांक का उपयोग कर निर्धारित किया है. एक च सीडा के मामले में, एंजाइम बाध्य धुनी का प्रतिशत 50-65% ² है. ए पी ओ प्रोटीन इन प्रयोगों में निष्क्रिय के रूप में माना जाता है क्योंकि एक ही धुनी cofactor के कटैलिसीस के लिए आवश्यक है. इस विधि के लिए एक और संभव सीमा तो एक एंजाइम की प्रक्रिया में होने पर 2 से तेजी से एमएस (रोका प्रवाह के मर समय) वे मनाया जा नहीं होगा, लेकिन वें हैअरे रणनीतियों जहां दर इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए कम किया जा सकता है रिपोर्ट कर रहे हैं. इस के लिए एक उदाहरण है एक ferredoxin - NADP ^{+ 11} रिडक्टेस की प्रतिक्रिया में एक उच्च NaCl एकाग्रता का उपयोग भी शामिल है. रोका प्रवाह के प्रवाह सर्किट से ऑक्सीजन की scrubbing के इस प्रयोग में अक्सर एक मुश्किल कदम है और विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है. ग्लूकोज oxidase ग्लूकोज यहाँ वर्णित प्रणाली को सफलतापूर्वक ज्यादातर प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है के रूप में यह एक प्रभावी और सस्ता तरीका है. हालांकि, वहाँ कुछ कमियां हैं जो ₂ एच ₂ हे के उत्पादन में शामिल हैं और कुछ अनुप्रयोगों के लिए protocatechuate प्रणाली रूप में dioxygenase - protocatechuate अन्य विकल्प ¹² विचार किया जाना चाहिए रहे हैं. एक anaerobic दस्ताने बॉक्स का उपयोग anaerobic शर्तों को सुनिश्चित करने के लिए यह आसान बनाता है, लेकिन जरूरी नहीं है. ऑक्सीजन का प्रवाह बंद कर दिया प्रवाह सर्किट से हटा दिया जाना चाहिए के रूप में हम एंजाइम ऑक्सीजन के अभाव में कम करना चाहते हैं या एकाग्रता में ऑक्सीजन के साथ प्रतिक्रियाकि हम निर्दिष्ट. हालांकि बंद कर दिया प्रवाह दस्ताना बॉक्स में है, वहाँ प्रवाह सर्किट में ऑक्सीजन है अगर हम पिछले प्रयोगों में एरोबिक बफ़र्स का इस्तेमाल किया. Absorbance के माप के अलावा, प्रतिदीप्ति और परिपत्र द्विवर्णता assays इसी सामान के साथ एप्लाइड Photophysics SX20 स्पेक्ट्रोफोटोमीटर रोका प्रवाह में प्रदर्शन किया जा सकता है.

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

NSF पुरस्कार MCB-1021384 अनुसंधान द्वारा समर्थित है.

1. Hissen, A.H., et al. The Aspergillus fumigatus siderophore biosynthetic gene sidA, encoding L-ornithine N5-oxygenase, is required for virulence. Infect. Immun. 73 (9), 5493-5503 (2005).
2. Chocklett, S.W. & Sobrado, P. Aspergillus fumigatus SidA is a highly specific ornithine hydroxylase with bound flavin cofactor. Biochemistry. 49 (31), 6777-6783 (2010).
3. Mayfield, J.A., et al. Comprehensive spectroscopic, steady state, and transient kinetic studies of a representative siderophore-associated flavin monooxygenase. J. Biol. Chem. 285 (40), 30375-30388 (2010).
4. Fierke, C.A. & Hammes, G.G. Transient kinetic approaches to enzyme mechanisms. In: Contemporary enzyme kinetics and mechanism. Elsevier, USA, (2009).
5. Palfey, B.A. & McDonald, C.A. Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases. Arch. Biochem. Biophys. 493 (1), 26 (2010).
6. van Berkel, W.J.H., Kamerbeek, N.M., & Fraaije, M.W. Flavoprotein monooxygenases, a diverse class of oxidative biocatalysts. J. Biotechnol. 124 (4), 670-689 (2006).
7. Chapman, S.K. & Reid, G.A. In: Flavoprotein Protocols. Humana Press, Totowa, USA, (1999).
8. Sobrado, P. & Fitzpatrick, P.F. Solvent and primary deuterium isotope effects show that lactate CH and OH bond cleavage are concerted in Y254F flavocytochrome b₂, consistent with a hydride transfer mechanism. Biochemistry. 42, 15208-15214 (2003).
9. Kumar, S., Gawandi, V.B., Capito, N., & Phillips, R.S. Substituent effects on the reaction of β-benzoylalanines with Pseudomonas fluorescens kynureninase. Biochemistry. 49 (36), 7909-7913 (2010).
10. Yun, D., García-Serres, R., Chicalese, B.M., An, Y.H., Huynh, B.H., & Bollinger, J.M.J. (μ-1,2-Peroxo)diiron(III/III) complex as a precursor to the diiron(III/IV) intermediate X in the assembly of the iron-radical cofactor of ribonucleotide reductase from mouse. Biochemistry. 46 (7), 1925-32 (2007).
11. Pennati, A., Zanetti, G., Aliverti, A., & Gadda, G. Effect of salt and pH on the reductive half-reaction of Mycobacterium tuberculosis FprA with NADPH Biochemistry. Biochemistry. 47 (11), 3418-3425 (2008).
12. Patil, P.V. & Allou, D.P. The use of protocatechuate dioxygenase for maintaining anaerobic conditions in biochemical experiments. Analytical Biochemistry. 286 (2), 187-192 (2000).

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