A tela de genética para isolar Toxoplasma gondii Host de células mutantes egresso

Visão global

Protocolos são fornecidos para definir primeiro a dosagem do agente mutagénico levando a uma morte 70% dos parasitas (protocolo 1). O procedimento seguinte é fornecido para enriquecer os mutantes egresso induzidas a partir de uma piscina parasita mutagenizada (protocolo 2, Figura 2). Isto é seguido por um protocolo para testar a incidência de mutantes de egresso na piscina enriquecido, ou para validar o fenótipo de saída em mutantes individuais (protocolo 3). Finalmente, um protocolo é fornecida para gerar clones de parasitas individuais a partir de populações enriquecidas por diluição limitante (protocolo 4).

1. Titulação do mutagéneo

Tenha cuidado especial, como luvas duplas, ao trabalhar com compostos altamente mutagênicos e líquidos. Coletar o resíduo líquido separadamente para destinação adequada.

1. Inocular frascos de cultura de tecidos T25 confluentes com humanos prepúcio de fibroblastos (HFF) células com 1 ml de taquizoítos de fresco lisadas e crescer 18-25 horas a 37 °; C sob _5% de CO2 em Ed1 médio (D-MEM suplementado com 1% inactivado pelo calor de soro bovino fetal, 0,2 mM de L-glutamina, 50 U / ml de penicilina, estreptomicina 50 mg / ml, e 0,25 ug / ml de anfotericina B ). Veja Roos et al. para o crescimento geral e meios de comunicação das células HFF e parasitas ^21.
2. Substituir meio com 10 ml de 0,1% médio de soro fetal bovino (diluído 1:10 Ed1 em D-MEM) e deixar em humidificada a 37 ° C incubadora sob CO2 a _5% (chamado "37 ° C incubadora" a partir daqui por diante) durante 10 min .
3. Adicionar 0, 12,5, 25, 50 ou 100 ul ENU (1 Banco M em DMSO) ou EMS (1 Banco M em DMSO) por balão (diluições de mutagênico de trabalho vai ser de 1,25, 2,5, 5 e 10 mM, respectivamente). Adicionar DMSO a 100 uL de cada frasco. Incubar durante 4 horas a 37 ° C incubadora.
4. Lavar três vezes durante 10 segundos à temperatura ambiente, por lavagem da monocamada com 10 ml de PBS frio (pré-arrefecido a 4 ° C).
5. Adicionar 5 ml de PBS, raspar a monocamada solto com um policial de borracha (célula scraper), passar as células raspadas através de uma agulha 26,5 G remover fisicamente o parasita dos fibroblastos (clipe fora do eixo fora da agulha com uma tesoura pesados ​​para não expor a agulha), e filtro com 3,0 mM filtro de policarbonato. Passagens de agulhas múltiplas irá aumentar a eficiência de libertação de parasitas a partir da célula hospedeira.
6. Contar a concentração parasita usando um hemocitómetro. Deixe os parasitas resolver durante 5 min na hemocytomer antes da contagem.
7. Diluir parasitas a 10.000 parasitas por 3 ml em Ed1 (para 10 ml 33.333 parasitas são necessários).
8. Inocular um poço numa placa de 6 poços com 3 ml de os parasitas diluídos (contendo 10.000 parasitas). Serialmente diluir os parasitas de 10 vezes ao longo de 3 poços de uma placa confluente de 6 poços com células HFF contendo 2,7 ml Ed1 pela transferência de 300 uL para fora do primeiro poço. Deixar as placas não perturbadas na incubadora a 37 ° C durante 7 dias.
9. Aspirar médio, corrigir 15 min com 3 ml / poço de etanol 100%, manchacom 3 ml / poço solução de violeta de cristal (12,5 g de violeta de cristal em 125 ml de etanol misturado com 500 ml de oxalato de amónio a 1%) durante 15 min, lavar com 3 ml / poço de PBS (1 minuto) e ar seco. Tudo em temperatura ambiente.
10. Contar as placas e seleccionar concentração de agente mutagénico necessário para alcançar a sobrevivência de 30% dos parasitas expostos (70% matando dosagem: ver Figura 1). Uma dosagem de matar 70% tem sido utilizada historicamente ¹⁴ e induziu menos de 100 mutações pontuais por genoma (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuscrito submetido).

2. Enriquecimento de mutantes saída (Figura 2)

1. Realizar mutagénese tal como descrito acima, usando uma dosagem mutagénica induzir morte de 70%. Crescer a população mutagenizada para uma passagem em um balão de novo de células hospedeiras.
2. Infect um T25, HFF frasco de cultura confluente tecido com 120.000 parasitas de fresco lisadas a partir de uma população mutagenizada em 10 ml Ed1. Incubar durante 2 horas em um incubador a 35 ° C sob 5% de CO2 e umidificado (doravante denominada "35 ° C incubadora").
3. Aspirar médio e enxaguamento de 10 segundos com 10 ml PBS frio e, em seguida, adicionam-se 10 ml Ed1 meio suplementado com 25 mg / ml de sulfato de dextrano (DS) ^13. Incubar durante 26 horas num incubador a 40 ° C sob _5% de CO2 e humidificado (doravante denominado "40 ° C incubadora").
4. Preparar solução de trabalho de promotores de saída. Diluir o indutor de saída de escolha para a concentração de trabalho em um tubo Falcon 15 ml contendo 10 ml HBSSc suplementado com 25 mg / ml DS. Pré-aquecer as diluições durante 30 min em um banho-maria a 37 ° C. Ver Tabela 1 para as concentrações de trabalho.
5. Aspirar médio dos frascos parasita infectadas e adicionar pré-aquecida solução indutor de saída. Incubar no 37 ° C incubadora para os tempos indicados na Tabela 1.
6. Aspirar médio e enxaguamento de 10 segundos com 10 ml PBS frio e, em seguida, adicionam-se 10 ml Ed1 suplementado com 25 mg / ml e DS 50 uM pirrolidina ditiocarbamato (PDTC: add uL 5 de 100 mM de Stock PDTC em PBS) ^13. Incubar em 5 horas a 35 ° C incubadora.
7. Aspirar médio e enxaguamento de 10 segundos, uma vez com 10 ml de PBS (temperatura ambiente) e depois adicionar 10 ml Ed1 médio. Coloque frascos de volta para a 35 ° C até incubadora parasitas destruir a monocamada: frascos de agitação diária. Esta recuperação leva cerca de 7 dias.

3. Validação de fenótipos mutantes por ensaios de ingresso

Depois de executar a tela de enriquecimento e crescimento da população enriquecida por uma passagem em células HFF, os fenótipos precisam ser confirmados por um teste de saída ^11,13. Este ensaio deve também ser utilizado para validar os clones individuais após o protocolo 4.

1. Inocule 20.000 parasitas por poço numa placa de 24 poços contendo células HFF confluentes cultivadas em lamelas (1 ml Ed1 médio por poço). Incubar 8 horas em um incubador a 35 ° C, em seguida, transferir para um incubador a 40 ° C durante 24 horas.
2. Lava-se com 1 ml / poço de PBS (10 segundos à temperatura ambiente). Adicionar 1 ml (indutores de egresso incluem uma DMSO apenas controlo negativo), pré-aquecidos e diluído em HBSSc e incubar durante os tempos descritos na Tabela 1.
3. Aspirar médio e fixar com 1 ml / poço metanol a 100% durante 15 min à temperatura ambiente.
4. Se parasitas pais que expressam uma proteína autofluorescente foram utilizados para a mutagênese, vá para a etapa # 3.5 ^13. Se parasitas não fluorescentes proteína exprimindo foram utilizados como linha parental, manchar as lamelas fixas com Diff-Quick mancha durante 1 min à temperatura ambiente ^11.
5. Lavar 5 min com 1 ml / poço de PBS na placa de 24 cavidades, à temperatura ambiente.
6. Para parasitas que expressam proteínas fluorescentes: lavar rapidamente a lamela em DDH ₂ O (imersão) e montar em lâminas sob gelmount para proteger o sinal de fluorescência. Para Diff-Quick parasitas coradas, lavar 10 segundos em etanol a 100% e deixar secar ao ar antes da montagem no slide.
7. Usando um microscópio (fluorescência) com um40-60x objectivo contar a percentagem de vacúolos egresso versus os vacúolos que permaneceram intracelular (ver Figura 4).

4. Clone mutantes egresso por diluição limitante

Após a validação do fenótipo da população saída enriquecido mutante usando o protocolo 3, a população policlonal precisa de ser clonado a obtenção de clones de parasitas individuais.

1. Contar população parasita em um hemocitómetro e diluir até uma concentração de 500 parasitas por ml em meio Ed1.
2. Em uma placa de 384 poços contendo uma monocamada confluente de células HFF, substituir o meio com 40 uL / ​​poço de Ed1 média usando uma pipeta multi-canal. Como mostrado na Figura 5, quatro populações policlonais podem ser clonadas por placa como se segue: pipeta 40 uL / ​​poço de mutante diluído 1 em poços C3-C12, mutante 2 em poços C13-C22, 3 mutante em poços H3-H12, e mutante 4 em poços H13-H22 (volume final nos poços é agora 80 uL). Usando um multi-canal pipeta pipeta, o solution cima e para baixo 5 vezes, em seguida, transferir 40 ul para a linha abaixo da linha de partida (a partir de linha C para D ou H linha de I). Continuar estas diluições 2-dobragem de série através de linha G (mutantes 1 e 2) ou linha N (mutantes 3 e 4). Descarte a 40 ul extra da última linha. Incubar em 35 ° C incubadora durante 7-10 dias, sem perturbar a placa.
3. Verificar as cavidades sobre um microscópio invertido com uma objectiva 10-20x para a presença de placas individuais, visível como dos buracos 'na monocamada.
4. Escolha 4 poços por mutante com uma única placa e transferir os parasitas em um balão de cultura de tecidos confluentes com células HFF e preenchido com Ed1 médio. Crescer os parasitas em uma incubadora a 35 ° C; agitar os frascos diários para dispersar os parasitas extracelulares. Isso normalmente leva 7 dias.

5. Os resultados representativos

A ENU mutagénicos e EMS não são estáveis ​​quando armazenadas durante longos períodos de tempo. Portanto, testando o poder mutagénico doos estoques é crítica para a obtenção de resultados reprodutíveis. Resultados de titulação típicas e matando curvas para ambos ENU e EMS são mostrados na Figura 1. No entanto, é recomendado para realizar ensaios de placa para cada experiência de mutagénese para assegurar que a dosagem apropriada foi usado. Para manter a diversidade da população mutagenizada parasita, é importante para prosseguir com a tela de saída mutante tão rapidamente quanto possível. Tipicamente, uma passagem dos parasitas para um balão de novo é realizada para deixar que os parasitas sobreviventes recuperar antes de ir para a frente com a tela. Deve ser mantido em mente que fazer isso irá resultar em divisão dos mutantes. Portanto, não pode ser excluído que vários mutantes clonais isoladas depois de completar todo o procedimento conter exactamente o mesmo genótipo. Para evitar o isolamento dos mesmos mutantes várias vezes, recomenda-se isolar apenas um mutante egresso único por mutagénese, a menos que seus fenótipos (por exemplo, diferenciais sensibilidades indutor egresso) sãomuito diferentes umas das outras. Por outro lado, nem todos os resultados da tela em isolamento de mutantes com o fenótipo desejado. Em particular, a ^{Ca2 +-ionóforo} A23187 fenótipo resistente é rara e requer a realização de mutagénese múltiplas e telas para isolar um mutante de saída única. Portanto, recomenda-se realizar mutagénese 5-10 e as experiências de tela em paralelo.

O poder de enriquecimento da tela foi testada por mistura de um mutante de saída conhecido do tipo selvagem com parasitas em diferentes proporções. Estas misturas foram submetidas à tela ea incidência do fenótipo mutante na população enriquecida foi avaliada. Ao utilizar de tipo selvagem parasitas que expressam RFP citoplasmática e uma linha mutante expressando YFP citoplasmática as incidências poderia ser rapidamente estabelecidos por citometria de fluxo (Figura 3) ^13. Os resultados mostram que os fenótipos mutantes podem ser rotineiramente enriquecido a pureza de 80%, começando com um parasita saída mutante por 10.000 p de tipo selvagemarasites ^13. No entanto, quando a saída mutante: tipo selvagem rácio de início parasita é 1:100.000 parasitas, a população isolado é apenas 1-2% mutantes (1:100) de saída. Por conseguinte, o poder de enriquecimento da tela é 1000 vezes. Uma vez que a tela se inicia com a inoculação de 120.000 parasitas, dos quais tipicamente 70% viáveis, que normalmente executar duas rondas de enriquecimento. Os parasitas isolados são crescido entre as rodadas de enriquecimento. Este procedimento leva a uma população de 100% mutante mesmo quando começando com 1:1.000.000 egresso mutante: tipo selvagem parasitas.

O ensaio de saída para validar e caracterizar os fenótipos requer uma multiplicidade de infecção da célula hospedeira que permite a diferenciação de vacúolos individuais. Isto é especialmente crítico ao analisar as condições com altas porcentagens de saída como os parasitas individuais são espalhados. Como mostrado na Figura 4, se as populações egressos não são bem separados é fácil subestimar a percentagemde saída, contando dois vacúolos egressos como um vacúolo. Desde saída e invasão são processos relacionados, e alguns fenótipos sensíveis à temperatura exibir um fenótipo leve à temperatura mais baixa, nem todos os mutantes terá eficiências de invasão semelhantes. Tais mutantes devem, portanto, ser inoculado em várias doses mais elevadas de dobragem para se obter uma densidade vacúolo suficientemente elevada para uma avaliação precisa do seu fenótipo de saída. Além disso, alguns indutores egresso não eficientemente estimular a saída dos vacúolos contendo quatro parasitas ou menos. Como tal, é importante que vacúolos conter oito parasitas ou mais quando iniciar o ensaio de saída. Em nosso laboratório nós mutantes tela isolado com uma determinada saída potenciador contra potenciadores egresso outros. Por seu perfil de reatividade cruzada dos mutantes podem ser agrupados em classes diferentes. Por último, nem todos os mutantes de egresso será sensível à temperatura. Em mutantes particulares isoladas com indutores de ingresso desencadear passos antes do lançamento do intracellular Ca ^{2 +} são propensos a temperatura não-fenótipos sensíveis. Isto é devido às vias paralelas que podem levar a egress antes que o sinal converge sobre a libertação de Ca ^{2 +} intracelular.

Figura 1. Chemical titulação dosagem mutagênico. Ensaios de placa A. realizado em uma placa de 6 poços utilizando várias concentrações do SME e vários números de parasitas por poço, como indicado. As manchas brancas são placas de parasitas formadas na monocamada HFF. B, C. As curvas de sobrevivência de parasitas após a exposição a várias dosagens de EMS (B) e ENU (C). A sobrevivência foi avaliada por ensaios de placa. Uma dosagem induzir morte de 70% é escolhido para experiências de mutagénese. Médias de três experimentos independentes + / - desvio padrão são mostrados.

et al. ^13.

Figura 3. Enriquecimento típico de egresso fenótipos mutantes. Resultados de enriquecimento de um mutante de saída misturado em tipo selvagem parasitas em várias proporções (eixo X). A percentagem de egresso fenótipos mutantes na população crescido após a tela é traçada no eixo y e foi avaliada por citometria de fluxo (egresso parasitas mutantes expressos YFP citoplasmática, de tipo selvagem parasitas expressa cytoplasmic RFP). Resultados de três experimentos independentes são representados por pontos vermelhos, azuis e verdes. Adoptado a partir Eidell et al. ^13.

Figura 4. Os resultados típicos de um ensaio de saída. A Arrows. Marcar quatro diferentes vacúolos contendo parasitas intactos 4-8. B. Setas marcar quatro grupos de parasitas espalhados refletindo quatro independentes vacúolos egressos. Egresso foi induzida por A23187 (B) ou DMSO como um controle negativo (A). Parasitas expressar YFP citoplasmática ^22.

Figura 5. Diluição em série para as linhas de parasitas clonal. Quatro populações policlonais (vermelho, azul, amarelo, verde) são diluídos em série em uma única placa confluente 384-bem com células HFF. Linha C e recebo 10 parasitas por poço esão duas vezes diluído (40 uL + 40 uL) até linhas H e N, respectivamente. O tom de cinza indica a diminuição do número de parasitas por bem. Tipicamente, os clones individuais são encontrados em linhas DF e JL.

* Nigericina não pode ser utilizado na enriquecermento tela como os parasitas não sobrevivem estimulação nigericina; usar apenas nigericina na validação de mutantes de ingresso.

Indutores Tabela 1. Egresso utilizados em procedimentos. Diluir em 10 ml HBBSc contendo 25 mg / ml DS para a tela, ou não DS para validação mutante (teste de saída). Todos os compostos a partir de Sigma-Aldrich.

O protocolo descrito proporciona um método eficiente para isolar mutantes Toxoplasma com um defeito de saída. Conseguimos isolado mutantes ao longo vários passos da via de saída, alguns dos quais têm um fenótipo invasão dupla ^13. Os potenciais efeitos na invasão pode ser determinada utilizando o chamado ensaio de vermelho-verde, o que diferencia invadido a partir de não-invadidas parasitas por coloração diferencial anticorpo ^23,24. Para os ensaios de ambos os invasão e saída pode ser conveniente para expressar uma proteína marcadora autofluorescente no citoplasma das ^13,22 parasitas. No entanto, se os parasitas sendo mutagenizado já expressam uma proteína fluorescente este poderia interferir com a caracterização fenotípica adicional por imunofluorescência mais tarde. É sempre possível adicionar um marcador fluorescente para um mutante após o seu isolamento. Como descrito, uma simples, alternativa não fluorescente é Diff-Quick coloração para saída.

Embora uma variedade de indutores egresso desencadeadores diferentes aspectos da via de sinalização são descritos na Tabela 1, existem outros agentes farmacológicos conhecidos para agir em processos necessários para saída. Por exemplo, a cafeína tem sido mostrado para induzir a secreção de microneme em parasitas extracelulares, que é necessária para ambossaída e invasão ^7,26,27. No entanto, a cafeína não pode ser usado para desencadear saída a partir de células hospedeiras infectadas, provavelmente porque a cafeína não eficientemente difusa através da célula hospedeira para os parasitas que residem num compartimento vacuolar. Da mesma forma, um gatilho de saída é a acumulação de ácido abscísico, mas é impossível para o rastreio de mutantes em vez que esta via ácido abscísico não se difundem para a célula hospedeira ^28. E, tal como indicado na Tabela 1, o K +-ionóforo nigericina é um indutor de saída eficiente ^5, no entanto, os parasitas não sobrevivem estimulação nigericina. Por conseguinte, este composto não é também adequado para o ecrã. Em alternativa um procedimento de rastreio, mais elaborado para mutantes ionóforos, foi relatado que muitos mutantes com um atraso na saída ionóforo induzida sobreviver à exposição prolongada a extracelular ionóforo ^11. No entanto, nenhum egresso mutantes resistentes ao ionóforo saída induzida foram isoladas nesta tela, fazendo com que os fenótiposmais fraco. É actualmente não está claro se os mutantes com resistência à exposição prolongada à indutores egresso outros podem ser obtidos.

Uma vez que parece haver vários caminhos paralelos que podem levar à saída, a questão de saber qual seria a mais relevante em uma infecção (experimental). Parece que os ataques do sistema imunitário na célula infectada são o principal gatilho de saída ^29. É possível utilizar os gatilhos tais na tela de mutante. Por exemplo, células-T CD8 podem estimular saída através de ambos um Fas mediada e uma via mediada por perforina ^30. Portanto, usando um FasL expressando células T humanas como uma célula hospedeira na tela de saída, de saída pode ser desencadeada por incubação com um anticorpo anti-Fas a enriquecer para os mutantes por essa via.

Para mapear geneticamente as mutações subjacentes aos fenótipos de saída, duas abordagens diferentes estão disponíveis em gondii. Ao contrário dos organismos modelo genético, todossegregação elic por atravessamento não é uma opção uma vez que o ciclo sexual do parasita só pode ser desencadeada no intestino do gato. Além da impraticabilidade e baixa eficiência deste processo, as estirpes do parasita cultivadas em laboratório muito rapidamente perdem a capacidade de infectar gatos. Para contornar este problema uma eficiente abordagem de tipo selvagem complementação cosmídeos biblioteca foi desenvolvida, que complementou a 90% de mutantes divisão celular ^18. Além disso, foi recentemente estabelecido genoma completo resequencing protocolos para identificar todas as mutações induzidas no genoma (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuscrito submetido). Normalmente identificamos 20-70 polimorfismos de nucleotídeo único em mutantes induzidos quimicamente. Entre estas duas abordagens, temos sido capazes de identificar a mutação responsável em todos os mutantes induzidos quimicamente caracterizadas até à data.

Tomados em conjunto, a tela descrito fornece uma ferramenta versátil, que vai permitir que a frente de dissecção genética deas vias de saída. Nós esperar que este irá identificar vários componentes da via de sinalização conhecida por existir com base em dados farmacológicos, mas para os quais não genes candidatos bons puderam ser identificados no genoma gondii.